Metabolit imunomodulator merupakan ciri utama mikro lingkungan tumor (TME), tetapi dengan beberapa pengecualian, identitasnya sebagian besar masih belum diketahui. Di sini, kami menganalisis tumor dan sel T dari tumor dan asites pasien dengan karsinoma serosa tingkat tinggi (HGSC) untuk mengungkap metabolom dari kompartemen TME yang berbeda ini. Asites dan sel tumor memiliki perbedaan metabolit yang luas. Dibandingkan dengan asites, sel T yang menginfiltrasi tumor secara signifikan diperkaya dengan 1-metilnikotinamida (MNA). Meskipun kadar MNA dalam sel T meningkat, ekspresi nikotinamida N-metiltransferase (enzim yang mengkatalisis transfer gugus metil dari S-adenosilmetionin ke nikotinamida) terbatas pada fibroblas dan sel tumor. Secara fungsional, MNA menginduksi sel T untuk mensekresikan sitokin pendorong tumor, yaitu faktor nekrosis tumor alfa. Oleh karena itu, MNA yang berasal dari TME berkontribusi pada regulasi imun sel T dan merupakan target imunoterapi potensial untuk pengobatan kanker manusia.
Metabolit yang berasal dari tumor dapat memiliki efek penghambat yang mendalam pada imunitas anti-tumor, dan semakin banyak bukti menunjukkan bahwa metabolit tersebut juga dapat berperan sebagai pendorong utama perkembangan penyakit (1). Selain efek Warburg, penelitian terbaru telah mulai mengkarakterisasi keadaan metabolisme sel tumor dan hubungannya dengan keadaan imun lingkungan mikro tumor (TME). Studi pada model tikus dan sel T manusia telah menunjukkan bahwa metabolisme glutamin (2), metabolisme oksidatif (3), dan metabolisme glukosa (4) dapat bertindak secara independen pada berbagai subkelompok sel imun. Beberapa metabolit dalam jalur ini menghambat fungsi anti-tumor sel T. Telah terbukti bahwa penghambatan koenzim tetrahidrobiopterin (BH4) dapat merusak proliferasi sel T, dan peningkatan BH4 dalam tubuh dapat meningkatkan respons imun anti-tumor yang dimediasi oleh CD4 dan CD8. Selain itu, efek imunosupresif kynurenin dapat diselamatkan dengan pemberian BH4 (5). Pada glioblastoma mutan isositrat dehidrogenase (IDH), sekresi enantiometabolik (R)-2-hidroksiglutarat (R-2-HG) menghambat aktivasi, proliferasi, dan aktivitas sitolisis sel T (6). Baru-baru ini, telah ditunjukkan bahwa metilglioksal, produk sampingan glikolisis, diproduksi oleh sel penekan asal myeloid, dan transfer metilglioksal ke sel T dapat menghambat fungsi sel T efektor. Dalam pengobatan, netralisasi metilglioksal dapat mengatasi aktivitas sel penekan turunan myeloid (MDSC) dan secara sinergis meningkatkan terapi blokade checkpoint pada model tikus (7). Studi-studi ini secara kolektif menekankan peran kunci metabolit yang berasal dari TME dalam mengatur fungsi dan aktivitas sel T.
Disfungsi sel T telah banyak dilaporkan pada kanker ovarium (8). Hal ini sebagian disebabkan oleh karakteristik metabolisme yang melekat pada hipoksia dan pembuluh darah tumor yang abnormal (9), yang mengakibatkan konversi glukosa dan triptofan menjadi produk sampingan seperti asam laktat dan kynurenin. Laktat ekstraseluler yang berlebihan mengurangi produksi interferon-γ (IFN-γ) dan mendorong diferensiasi subkelompok mielosupresif (10, 11). Konsumsi triptofan secara langsung menghambat proliferasi sel T dan menghambat pensinyalan reseptor sel T (12-14). Terlepas dari pengamatan ini, banyak penelitian seputar metabolisme imun dilakukan pada kultur sel T in vitro menggunakan media yang dioptimalkan, atau terbatas pada model tikus homolog in vivo, yang keduanya tidak sepenuhnya mencerminkan heterogenitas kanker manusia dan lingkungan makro dan mikro fisiologis.
Ciri umum kanker ovarium adalah penyebaran peritoneum dan munculnya asites. Akumulasi cairan sel dalam asites dikaitkan dengan penyakit stadium lanjut dan prognosis yang buruk (15). Menurut laporan, kompartemen unik ini bersifat hipoksik, memiliki kadar faktor pertumbuhan endotel vaskular (VEGF) dan indolamin 2,3-dioksigenase (IDO) yang tinggi, dan diinfiltrasi oleh sel T regulator dan sel penghambat myeloid (15-18). Lingkungan metabolik asites mungkin berbeda dari lingkungan tumor itu sendiri, sehingga pemrograman ulang sel T di ruang peritoneum masih belum jelas. Selain itu, perbedaan dan heterogenitas utama antara asites dan metabolit yang ada di lingkungan tumor dapat menghambat infiltrasi sel imun dan fungsinya pada tumor, dan penelitian lebih lanjut diperlukan.
Untuk mengatasi masalah ini, kami merancang metode pemisahan sel sensitif dan kromatografi cair tandem spektrometri massa (LC-MS/MS) untuk mempelajari berbagai jenis sel (termasuk sel T CD4+ dan CD8+) serta metabolitnya di dalam dan antar sel tumor dalam lingkungan asites dan tumor yang sama pada pasien. Kami menggunakan metode ini bersamaan dengan sitometri aliran berdimensi tinggi dan pengurutan RNA sel tunggal (scRNA-seq) untuk memberikan gambaran yang sangat terperinci tentang status metabolisme populasi kunci ini. Metode ini mengungkapkan peningkatan signifikan pada kadar 1-metilnikotinamida (MNA) dalam sel T tumor, dan percobaan in vitro menunjukkan bahwa efek imunomodulator MNA pada fungsi sel T sebelumnya tidak diketahui. Secara umum, metode ini mengungkapkan interaksi metabolisme timbal balik antara tumor dan sel imun, dan memberikan wawasan unik tentang metabolit regulasi imun, yang mungkin berguna untuk pengobatan imunoterapi kanker ovarium berbasis sel T.
Kami menggunakan sitometri aliran berdimensi tinggi untuk mengukur secara simultan penyerapan glukosa [2-(N-(7-nitrophenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG) dan aktivitas mitokondria [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) yang berdampingan merupakan penanda khas yang membedakan sel imun dan populasi sel tumor (Tabel S2 dan Gambar S1A). Analisis ini menunjukkan bahwa dibandingkan dengan sel T, sel asites dan sel tumor memiliki tingkat penyerapan glukosa yang lebih tinggi, tetapi memiliki perbedaan yang lebih kecil dalam aktivitas mitokondria. Rata-rata penyerapan glukosa sel tumor [CD45-EpCAM (EpCAM)+] adalah tiga hingga empat kali lipat dari sel T, dan rata-rata penyerapan glukosa sel T CD4+ adalah 1,2 kali lipat dari sel T CD8+, yang menunjukkan bahwa limfosit infiltrasi tumor (TIL) memiliki kebutuhan metabolik yang berbeda bahkan dalam TME yang sama (Gambar 1A). Sebaliknya, aktivitas mitokondria pada sel tumor mirip dengan aktivitas mitokondria pada sel T CD4+, dan aktivitas mitokondria kedua jenis sel tersebut lebih tinggi daripada aktivitas mitokondria pada sel T CD8+ (Gambar 1B). Secara umum, hasil ini mengungkapkan tingkat metabolisme. Aktivitas metabolisme sel tumor lebih tinggi daripada aktivitas metabolisme sel T CD4+, dan aktivitas metabolisme sel T CD4+ lebih tinggi daripada aktivitas metabolisme sel T CD8+. Terlepas dari efek ini di berbagai jenis sel, tidak ada perbedaan yang konsisten dalam status metabolisme sel T CD4+ dan CD8+ atau proporsi relatifnya dalam cairan asites dibandingkan dengan tumor (Gambar 1C). Sebaliknya, pada fraksi sel CD45-, proporsi sel EpCAM+ dalam tumor meningkat dibandingkan dengan cairan asites (Gambar 1D). Kami juga mengamati perbedaan metabolisme yang jelas antara komponen sel EpCAM+ dan EpCAM-. Sel EpCAM+ (tumor) memiliki penyerapan glukosa dan aktivitas mitokondria yang lebih tinggi daripada sel EpCAM-, yang jauh lebih tinggi daripada aktivitas metabolisme fibroblas pada sel tumor di TME (Gambar 1, E dan F).
(A dan B) Intensitas fluoresensi median (MFI) penyerapan glukosa (2-NBDG) (A) dan aktivitas mitokondria sel T CD4+ (MitoTracker merah tua) (B) Grafik representatif (kiri) dan data tabulasi (kanan), sel T CD8+ dan sel tumor EpCAM+CD45- dari asites dan tumor. (C) Rasio sel CD4+ dan CD8+ (dari sel T CD3+) dalam asites dan tumor. (D) Proporsi sel tumor EpCAM+ dalam asites dan tumor (CD45−). (E dan F) Penyerapan glukosa (2-NBDG) sel tumor EpCAM+CD45- dan matriks EpCAM-CD45- (E) dan aktivitas mitokondria (MitoTracker merah tua) (F) grafik representatif (kiri) dan data tabulasi (kanan) sel asites dan tumor. (G) Grafik representatif ekspresi CD25, CD137, dan PD1 dengan sitometri aliran. (H dan I) Ekspresi CD25, CD137 dan PD1 pada sel T CD4+ (H) dan sel T CD8+ (I). (J dan K) Fenotipe naif, memori sentral (Tcm), efektor (Teff) dan memori efektor (Tem) berdasarkan ekspresi CCR7 dan CD45RO. Gambar representatif (kiri) dan data tabular (kanan) dari sel T CD4+ (J) dan sel T CD8+ (K) dalam asites dan tumor. Nilai P ditentukan dengan uji t berpasangan (*P<0,05, **P<0,01 dan ***P<0,001). Garis tersebut mewakili pasien yang cocok (n = 6). FMO, fluoresensi minus satu; MFI, intensitas fluoresensi median.
Analisis lebih lanjut mengungkapkan perbedaan signifikan lainnya antara status fenotipe sel T yang sangat terdefinisi. Sel T yang teraktivasi (Gambar 1, G hingga I) dan memori efektor (Gambar 1, J dan K) dalam tumor jauh lebih sering daripada asites (proporsi sel T CD3+). Demikian pula, menganalisis fenotipe berdasarkan ekspresi penanda aktivasi (CD25 dan CD137) dan penanda penipisan [protein kematian sel terprogram 1 (PD1)] menunjukkan bahwa meskipun karakteristik metabolisme populasi ini berbeda (Gambar S1, B hingga E), tetapi tidak ada perbedaan metabolisme signifikan yang secara konsisten diamati antara subset naif, efektor, atau memori (Gambar S1, F hingga I). ​​Hasil ini dikonfirmasi dengan menggunakan metode pembelajaran mesin untuk secara otomatis menetapkan fenotipe sel (21), yang selanjutnya mengungkapkan keberadaan sejumlah besar sel sumsum tulang (CD45+/CD3-/CD4+/CD45RO+) dalam asites pasien (Gambar S2A). Di antara semua jenis sel yang teridentifikasi, populasi sel myeloid ini menunjukkan penyerapan glukosa dan aktivitas mitokondria tertinggi (Gambar S2, B hingga G). Hasil ini menyoroti perbedaan metabolisme yang kuat antara berbagai jenis sel yang ditemukan dalam cairan asites dan tumor pada pasien HGSC.
Tantangan utama dalam memahami karakteristik metabonomik TIL adalah kebutuhan untuk mengisolasi sampel sel T dengan kemurnian, kualitas, dan kuantitas yang cukup dari tumor. Studi terbaru menunjukkan bahwa metode penyortiran dan pengayaan manik-manik berdasarkan sitometri aliran dapat menyebabkan perubahan profil metabolit seluler (22-24). Untuk mengatasi masalah ini, kami mengoptimalkan metode pengayaan manik-manik untuk mengisolasi TIL dari kanker ovarium manusia yang dioperasi sebelum analisis dengan LC-MS/MS (lihat Bahan dan Metode; Gambar 2A). Untuk menilai dampak keseluruhan protokol ini pada perubahan metabolit, kami membandingkan profil metabolit sel T yang diaktifkan oleh donor sehat setelah langkah pemisahan manik-manik di atas dengan sel yang tidak dipisahkan dengan manik-manik tetapi tetap berada di atas es. Analisis kontrol kualitas ini menemukan bahwa terdapat korelasi yang tinggi antara kedua kondisi ini (r = 0,77), dan pengulangan teknis dari kelompok 86 metabolit memiliki pengulangan yang tinggi (Gambar 2B). Oleh karena itu, metode ini dapat melakukan analisis metabolit yang akurat pada sel yang mengalami pengayaan tipe sel, sehingga menyediakan platform resolusi tinggi pertama untuk mengidentifikasi metabolit spesifik pada HGSC, dan dengan demikian memungkinkan orang untuk memperoleh pemahaman yang lebih dalam tentang program metabolisme seksual spesifik sel.
(A) Diagram skematis pengayaan manik magnetik. Sebelum analisis dengan LC-MS/MS, sel akan menjalani tiga putaran pengayaan manik magnetik berturut-turut atau tetap di atas es. (B) Pengaruh jenis pengayaan terhadap kelimpahan metabolit. Rata-rata dari tiga pengukuran untuk setiap jenis pengayaan ± SE. Garis abu-abu mewakili hubungan 1:1. Korelasi intra-kelas (ICC) dari pengukuran berulang ditunjukkan pada label sumbu. NAD, nikotinamida adenin dinukleotida. (C) Diagram skematis alur kerja analisis metabolit pasien. Cairan asites atau tumor dikumpulkan dari pasien dan dibekukan. Sebagian kecil dari setiap sampel dianalisis dengan sitometri aliran, sementara sampel yang tersisa menjalani tiga putaran pengayaan untuk sel CD4+, CD8+, dan CD45-. Fraksi sel ini dianalisis menggunakan LC-MS/MS. (D) Peta panas kelimpahan metabolit yang distandarisasi. Dendrogram mewakili pengelompokan Ward dari jarak Euclidean antar sampel. (E) Analisis komponen utama (PCA) dari peta metabolit sampel, menunjukkan tiga replikasi dari setiap sampel, sampel dari pasien yang sama dihubungkan oleh sebuah garis. (F) PCA dari profil metabolit sampel yang dikondisikan pada pasien (yaitu, menggunakan redundansi parsial); jenis sampel dibatasi oleh selubung cembung. PC1, komponen utama 1; PC2, komponen utama 2.
Selanjutnya, kami menerapkan metode pengayaan ini untuk menganalisis 99 metabolit dalam fraksi sel CD4+, CD8+, dan CD45- pada asites primer dan tumor dari enam pasien HGSC (Gambar 2C, Gambar S3A dan Tabel S3 dan S4). Populasi yang diteliti mencakup 2% hingga 70% dari sampel besar sel hidup asli, dan proporsi sel sangat bervariasi antar pasien. Setelah memisahkan manik-manik, fraksi yang diperkaya (CD4+, CD8+, atau CD45-) mencakup lebih dari 85% dari semua sel hidup dalam sampel secara rata-rata. Metode pengayaan ini memungkinkan kami untuk menganalisis populasi sel dari metabolisme jaringan tumor manusia, yang tidak mungkin dilakukan dari sampel besar. Dengan menggunakan protokol ini, kami menentukan bahwa l-kynurenin dan adenosin, dua metabolit imunosupresif yang telah dikarakterisasi dengan baik ini, meningkat pada sel T tumor atau sel tumor (Gambar S3, B dan C). Oleh karena itu, hasil ini menunjukkan keakuratan dan kemampuan teknologi pemisahan sel dan spektrometri massa kami untuk menemukan metabolit penting secara biologis dalam jaringan pasien.
Analisis kami juga mengungkapkan pemisahan metabolik yang kuat dari jenis sel di dalam dan antar pasien (Gambar 2D dan Gambar S4A). Secara khusus, dibandingkan dengan pasien lain, pasien 70 menunjukkan karakteristik metabolik yang berbeda (Gambar 2E dan Gambar S4B), menunjukkan bahwa mungkin ada heterogenitas metabolik yang substansial antar pasien. Perlu dicatat bahwa dibandingkan dengan pasien lain (1,2 hingga 2 liter; Tabel S1), jumlah total asites yang dikumpulkan pada pasien 70 (80 ml) lebih kecil. Pengendalian heterogenitas antar pasien selama analisis komponen utama (misalnya, menggunakan analisis redundansi parsial) menunjukkan perubahan yang konsisten antara jenis sel, dan jenis sel dan/atau lingkungan mikro jelas teragregasi sesuai dengan profil metabolit (Gambar 2F). Analisis metabolit tunggal menekankan efek ini dan mengungkapkan perbedaan signifikan antara jenis sel dan lingkungan mikro. Perlu dicatat bahwa perbedaan paling ekstrem yang diamati adalah MNA, yang biasanya diperkaya dalam sel CD45- dan dalam sel CD4+ dan CD8+ yang menginfiltrasi tumor (Gambar 3A). Untuk sel CD4+, efek ini paling jelas terlihat, dan MNA pada sel CD8+ juga tampaknya sangat dipengaruhi oleh lingkungan. Namun, hal ini tidak penting, karena hanya tiga dari enam pasien yang dapat dievaluasi untuk skor CD8+ tumor. Selain MNA, pada berbagai jenis sel dalam asites dan tumor, metabolit lain yang kurang terkarakterisasi dalam TIL juga kaya secara berbeda (Gambar S3 dan S4). Oleh karena itu, data ini mengungkapkan serangkaian metabolit imunomodulator yang menjanjikan untuk penelitian lebih lanjut.
(A) Kandungan MNA yang dinormalisasi dalam sel CD4+, CD8+ dan CD45- dari asites dan tumor. Plot kotak menunjukkan median (garis), rentang interkuartil (engsel bingkai) dan rentang data, hingga 1,5 kali rentang interkuartil (kumis bingkai). Seperti yang dijelaskan dalam Bahan dan Metode Pasien, gunakan nilai limma pasien untuk menentukan nilai P (*P<0,05 dan **P<0,01). (B) Diagram skematik metabolisme MNA (60). Metabolit: S-adenosil-1-metionin; SAH, S-adenosin-1-homosistein; NA, nikotinamida; MNA, 1-metilnikotinamida; 2-PY, 1-metil-2-piridon-5-karboksamida; 4-PY, 1-metil-4-piridon-5-karboksamida; NR, nikotinamida ribosa; NMN, nikotinamida mononukleotida. Enzim (hijau): NNMT, nikotinamida N-metiltransferase; SIRT, sirtuin; NAMPT, nikotinamida fosforibosil transferase; AOX1, aldehida oksidase 1; NRK, nikotinamida ribosida kinase; NMNAT, nikotinamida mononukleotida adenilat transferase; Pnp1, purin nukleosida fosforilase. (C) t-SNE dari scRNA-seq cairan asites (abu-abu) dan tumor (merah; n = 3 pasien). (D) Ekspresi NNMT pada populasi sel yang berbeda yang diidentifikasi menggunakan scRNA-seq. (E) Ekspresi NNMT dan AOX1 pada SK-OV-3, sel ginjal embrionik manusia (HEK) 293T, sel T, dan sel T yang diobati dengan MNA. Ekspresi yang dilipat ditunjukkan relatif terhadap SK-OV-3. Pola ekspresi dengan SEM ditunjukkan (n = 6 donor sehat). Nilai Ct lebih besar dari 35 dianggap tidak terdeteksi (UD). (F) Ekspresi SLC22A1 dan SLC22A2 pada sel SK-OV-3, HEK293T, sel T, dan sel T yang diobati dengan 8mM MNA. Ekspresi terlipat ditunjukkan relatif terhadap SK-OV-3. Pola ekspresi dengan SEM ditunjukkan (n = 6 donor sehat). Nilai Ct lebih besar dari 35 dianggap tidak terdeteksi (UD). (G) Kandungan MNA sel pada sel T donor sehat yang diaktifkan setelah 72 jam inkubasi dengan MNA. Pola ekspresi dengan SEM ditunjukkan (n = 4 donor sehat).
MNA diproduksi dengan mentransfer gugus metil dari S-adenosil-1-metionin (SAM) ke nikotinamida (NA) oleh nikotinamida N-metiltransferase (NNMT; Gambar 3B). NNMT diekspresikan secara berlebihan dalam berbagai kanker manusia dan dikaitkan dengan proliferasi, invasi, dan metastasis (25-27). Untuk lebih memahami sumber MNA dalam sel T di TME, kami menggunakan scRNA-seq untuk mengkarakterisasi ekspresi NNMT di berbagai jenis sel dalam asites dan tumor dari tiga pasien HGSC (Tabel S5). Analisis sekitar 6.500 sel menunjukkan bahwa dalam lingkungan asites dan tumor, ekspresi NNMT terbatas pada populasi sel fibroblas dan sel tumor yang diduga (Gambar 3, C dan D). Perlu dicatat bahwa tidak ada ekspresi NNMT yang jelas pada populasi mana pun yang mengekspresikan PTPRC (CD45 +) (Gambar 3D dan Gambar S5A), yang menunjukkan bahwa MNA yang terdeteksi dalam spektrum metabolit telah dimasukkan ke dalam sel T. Ekspresi aldehida oksidase 1 (AOX1) yang mengubah MNA menjadi 1-metil-2-piridon-5-karboksamida (2-PYR) atau 1-metil-4-piridon-5-karboksamida (4-PYR); Gambar 3B) juga terbatas pada populasi fibroblas yang mengekspresikan COL1A1 (Gambar S5A), yang bersama-sama menunjukkan bahwa sel T tidak memiliki kemampuan metabolisme MNA konvensional. Pola ekspresi gen terkait MNA ini diverifikasi menggunakan kumpulan data sel independen kedua dari asites pasien HGSC (Gambar S5B; n = 6) (16). Selain itu, analisis reaksi berantai polimerase kuantitatif (qPCR) pada sel T donor sehat yang diobati dengan MNA menunjukkan bahwa dibandingkan dengan sel tumor ovarium SK-OV-3 kontrol, NNMT atau AOX1 hampir tidak diekspresikan (Gambar 3E). Hasil yang tidak terduga ini menunjukkan bahwa MNA mungkin disekresikan dari fibroblas atau tumor ke sel T yang berdekatan di TME.
Meskipun kandidatnya mencakup keluarga transporter kation organik 1 hingga 3 (OCT1, OCT2 dan OCT3) yang dikodekan oleh keluarga pembawa larut 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 dan SLC22A3), transporter potensial MNA masih belum terdefinisi (28). QPCR mRNA dari sel T donor sehat menunjukkan tingkat ekspresi SLC22A1 yang rendah tetapi tingkat SLC22A2 yang tidak terdeteksi, yang mengkonfirmasi bahwa hal itu telah dilaporkan sebelumnya dalam literatur (Gambar 3F) (29). Sebaliknya, lini sel tumor ovarium SK-OV-3 mengekspresikan tingkat tinggi kedua transporter tersebut (Gambar 3F).
Untuk menguji kemungkinan sel T memiliki kemampuan untuk menyerap MNA asing, sel T donor sehat dikultur selama 72 jam dengan adanya berbagai konsentrasi MNA. Tanpa adanya MNA eksogen, kandungan MNA seluler tidak dapat dideteksi (Gambar 3G). Namun, sel T yang diaktifkan dan diberi perlakuan dengan MNA eksogen menunjukkan peningkatan kandungan MNA dalam sel yang bergantung pada dosis, hingga 6 mM MNA (Gambar 3G). Hasil ini menunjukkan bahwa meskipun tingkat ekspresi transporter rendah dan kurangnya enzim utama yang bertanggung jawab untuk metabolisme MNA intraseluler, TIL masih dapat menyerap MNA.
Spektrum metabolit dalam sel T pasien dan eksperimen penyerapan MNA in vitro meningkatkan kemungkinan bahwa fibroblas terkait kanker (CAF) mensekresikan MNA dan sel tumor dapat mengatur fenotipe dan fungsi TIL. Untuk menentukan efek MNA pada sel T, sel T donor sehat diaktifkan secara in vitro dengan atau tanpa MNA, dan proliferasi serta produksi sitokinnya dievaluasi. Setelah 7 hari penambahan MNA pada dosis tertinggi, jumlah penggandaan populasi sedikit berkurang, sementara vigor dipertahankan pada semua dosis (Gambar 4A). Selain itu, pengobatan dengan MNA eksogen menghasilkan peningkatan proporsi sel T CD4+ dan CD8+ yang mengekspresikan faktor nekrosis tumor-α (TNFα; Gambar 4B). Sebaliknya, produksi IFN-γ intraseluler berkurang secara signifikan pada sel T CD4+, tetapi tidak pada sel T CD8+, dan tidak ada perubahan signifikan pada interleukin 2 (IL-2; Gambar 4, C dan D). Oleh karena itu, uji imunosorben terkait enzim (ELISA) dari supernatan kultur sel T yang diberi perlakuan MNA ini menunjukkan peningkatan signifikan pada TNFα, penurunan pada IFN-γ, dan tidak ada perubahan pada IL-2 (Gambar 4, E hingga G). Penurunan IFN-γ menunjukkan bahwa MNA mungkin berperan dalam menghambat aktivitas anti-tumor sel T. Untuk mensimulasikan efek MNA pada sitotoksisitas yang dimediasi sel T, sel T reseptor antigen chimeric (FRα-CAR-T) yang menargetkan reseptor folat α dan sel CAR-T (GFP) yang diatur oleh protein fluoresen hijau (GFP) -CAR-T) diproduksi dari sel mononuklear darah tepi (PBMC) donor sehat. Sel CAR-T dikultur selama 24 jam dengan adanya MNA, dan kemudian dikultur bersama dengan sel tumor ovarium SK-OV-3 manusia yang mengekspresikan reseptor folat α dengan rasio efektor terhadap target 10:1. Perlakuan MNA menghasilkan penurunan signifikan pada aktivitas pembunuhan sel FRα-CAR-T, yang serupa dengan sel FRα-CAR-T yang diberi adenosin (Gambar 4H).
(A) Jumlah total sel hidup dan penggandaan populasi (PD) langsung dari kultur pada hari ke-7. Grafik batang mewakili rata-rata + SEM dari enam donor sehat. Mewakili data dari setidaknya n = 3 percobaan independen. (B hingga D) CD3/CD28 dan IL-2 digunakan untuk mengaktifkan sel T pada konsentrasi MNA masing-masing selama 7 hari. Sebelum analisis, sel distimulasi dengan PMA/ionomycin dengan GolgiStop selama 4 jam. Ekspresi TNFα (B) pada sel T. Contoh gambar (kiri) dan data tabular (kanan) ekspresi TNFα pada sel hidup. Ekspresi IFN-γ (C) dan IL-2 (D) pada sel T. Ekspresi sitokin diukur dengan flow cytometry. Grafik batang mewakili rata-rata (n = 6 donor sehat) + SEM. Gunakan analisis varians satu arah dan pengukuran berulang (*P<0,05 dan **P<0,01) untuk menentukan nilai P. Mewakili data dari setidaknya n = 3 percobaan independen. (E hingga G) CD3/CD28 dan IL-2 digunakan untuk mengaktifkan sel T pada konsentrasi MNA masing-masing selama 7 hari. Medium dikumpulkan sebelum dan setelah 4 jam stimulasi PMA/ionomycin. Konsentrasi TNFα (E), IFN-γ (F) dan IL-2 (G) diukur dengan ELISA. Grafik batang mewakili rata-rata (n = 5 donor sehat) + SEM. Nilai P ditentukan menggunakan analisis varians satu arah dan pengukuran berulang (*P<0,05). Garis putus-putus menunjukkan batas deteksi. (H) Uji lisis sel. Sel FRα-CAR-T atau GFP-CAR-T disesuaikan dengan adenosin (250μM) atau MNA (10 mM) selama 24 jam, atau dibiarkan tanpa perlakuan (Ctrl). Persentase pembunuhan sel SK-OV-3 diukur. Nilai P ditentukan dengan uji t Welch (*P<0,5 dan **P<0,01).
Untuk memperoleh pemahaman mekanistik tentang regulasi ekspresi TNFα yang bergantung pada MNA, perubahan mRNA TNFα pada sel T yang diobati dengan MNA dievaluasi (Gambar 5A). Sel T donor sehat yang diobati dengan MNA menunjukkan peningkatan dua kali lipat pada tingkat transkripsi TNFα, yang menunjukkan bahwa MNA bergantung pada regulasi transkripsi TNFα. Untuk menyelidiki mekanisme regulasi yang mungkin ini, dua faktor transkripsi yang diketahui mengatur TNFα, yaitu faktor nuklir sel T teraktivasi (NFAT) dan protein spesifik 1 (Sp1), dievaluasi sebagai respons terhadap pengikatan MNA ke promotor TNFα proksimal (30). Promotor TNFα mengandung 6 situs pengikatan NFAT yang teridentifikasi dan 2 situs pengikatan Sp1, yang tumpang tindih pada satu situs [-55 pasangan basa (bp) dari 5'cap] (30). Imunopresipitasi kromatin (ChIP) menunjukkan bahwa ketika diobati dengan MNA, pengikatan Sp1 ke promotor TNFα meningkat tiga kali lipat. Penggabungan NFAT juga meningkat dan mendekati tingkat penting (Gambar 5B). Data ini menunjukkan bahwa MNA mengatur ekspresi TNFα melalui transkripsi Sp1, dan pada tingkat yang lebih rendah ekspresi NFAT.
(A) Dibandingkan dengan sel T yang dikultur tanpa MNA, perubahan lipatan ekspresi TNFα pada sel T yang diberi perlakuan MNA. Pola ekspresi dengan SEM ditunjukkan (n = 5 donor sehat). Mewakili data dari setidaknya n = 3 percobaan independen. (B) Promotor TNFα sel T yang diberi perlakuan dengan atau tanpa 8 mM MNA setelah NFAT dan Sp1 dikombinasikan dengan (Ctrl) dan stimulasi PMA/ionomycin selama 4 jam. Imunoglobulin G (IgG) dan H3 digunakan sebagai kontrol negatif dan positif untuk imunopresipitasi, masing-masing. Kuantifikasi ChIP menunjukkan bahwa pengikatan Sp1 dan NFAT ke promotor TNFα pada sel yang diberi perlakuan MNA meningkat beberapa kali lipat dibandingkan dengan kontrol. Mewakili data dari setidaknya n = 3 percobaan independen. Nilai P ditentukan oleh beberapa uji t (*** P <0,01). (C) Dibandingkan dengan asites HGSC, sel T (non-sitotoksik) menunjukkan peningkatan ekspresi TNF di dalam tumor. Warna-warna tersebut mewakili pasien yang berbeda. Sel yang ditampilkan telah diambil sampel secara acak sebanyak 300 dan diacak untuk membatasi penggambaran berlebihan (** Padj = 0,0076). (D) Model MNA yang diusulkan untuk kanker ovarium. MNA diproduksi dalam sel tumor dan fibroblas di TME dan diambil oleh sel T. MNA meningkatkan pengikatan Sp1 ke promotor TNFα, yang menyebabkan peningkatan transkripsi TNFα dan produksi sitokin TNFα. MNA juga menyebabkan penurunan IFN-γ. Penghambatan fungsi sel T menyebabkan penurunan kemampuan membunuh dan percepatan pertumbuhan tumor.
Menurut laporan, TNFα memiliki efek antitumor dan imunosupresif yang bergantung pada bagian depan dan belakang, tetapi memiliki peran yang dikenal dalam mendorong pertumbuhan dan metastasis kanker ovarium (31-33). Menurut laporan, konsentrasi TNFα dalam cairan asites dan jaringan tumor pada pasien kanker ovarium lebih tinggi daripada pada jaringan jinak (34-36). Dari segi mekanisme, TNFα dapat mengatur aktivasi, fungsi, dan proliferasi sel darah putih, dan mengubah fenotipe sel kanker (37, 38). Konsisten dengan temuan ini, analisis ekspresi gen diferensial menunjukkan bahwa TNF secara signifikan meningkat pada sel T dalam jaringan tumor dibandingkan dengan cairan asites (Gambar 5C). Peningkatan ekspresi TNF hanya terlihat pada populasi sel T dengan fenotipe non-sitotoksik (Gambar S5A). Singkatnya, data ini mendukung pandangan bahwa MNA memiliki efek imunosupresif dan pendorong tumor ganda pada HGSC.
Pelabelan fluoresen berdasarkan sitometri aliran telah menjadi metode utama untuk mempelajari metabolisme TIL. Studi-studi ini menunjukkan bahwa dibandingkan dengan limfosit darah perifer atau sel T dari organ limfoid sekunder, TIL tikus dan manusia memiliki kecenderungan yang lebih tinggi untuk menyerap glukosa (4, 39) dan kehilangan fungsi mitokondria secara bertahap (19, 40). Meskipun kami telah mengamati hasil serupa dalam penelitian ini, perkembangan kuncinya adalah membandingkan metabolisme sel tumor dan TIL dari jaringan tumor yang sama yang telah direseksi. Konsisten dengan beberapa laporan sebelumnya, sel tumor (CD45-EpCAM +) dari asites dan tumor memiliki penyerapan glukosa yang lebih tinggi daripada sel T CD8 + dan CD4 +, yang mendukung bahwa penyerapan glukosa yang tinggi pada sel tumor dapat dibandingkan dengan sel T. Konsep kompetisi sel T. TME. Namun, aktivitas mitokondria sel tumor lebih tinggi daripada sel T CD8 +, tetapi aktivitas mitokondria mirip dengan sel T CD4 +. Hasil ini memperkuat tema yang muncul bahwa metabolisme oksidatif penting bagi sel tumor (41, 42). Hasil ini juga menunjukkan bahwa sel T CD8+ mungkin lebih rentan terhadap disfungsi oksidatif daripada sel T CD4+, atau bahwa sel T CD4+ mungkin menggunakan sumber karbon selain glukosa untuk mempertahankan aktivitas mitokondria (43, 44). Perlu dicatat bahwa kami tidak mengamati perbedaan dalam penyerapan glukosa atau aktivitas mitokondria antara sel efektor T CD4+, sel memori efektor T, dan sel memori sentral T dalam asites. Demikian pula, keadaan diferensiasi sel T CD8+ dalam tumor tidak ada hubungannya dengan perubahan penyerapan glukosa, yang menyoroti perbedaan signifikan antara sel T yang dikultur secara in vitro dan TIL manusia secara in vivo (22). Pengamatan ini juga dikonfirmasi oleh penggunaan alokasi populasi sel otomatis yang tidak bias, yang lebih lanjut mengungkapkan bahwa sel CD45+/CD3-/CD4+/CD45RO+ dengan penyerapan glukosa dan aktivitas mitokondria yang lebih tinggi daripada sel tumor lebih banyak ditemukan tetapi memiliki populasi sel aktif secara metabolik. Populasi ini mungkin mewakili subpopulasi sel penekan myeloid atau sel dendritik plasmacytoid yang diidentifikasi dalam analisis scRNA-seq. Meskipun keduanya telah dilaporkan pada tumor ovarium manusia [45], keduanya masih membutuhkan penelitian lebih lanjut untuk mendeskripsikan subpopulasi myeloid ini.
Meskipun metode berbasis sitometri aliran dapat mengklarifikasi perbedaan umum dalam metabolisme glukosa dan oksidatif antara jenis sel, metabolit tepat yang dihasilkan oleh glukosa atau sumber karbon lain untuk metabolisme mitokondria di TME belum ditentukan. Menentukan ada atau tidaknya metabolit pada subset TIL tertentu memerlukan pemurnian populasi sel dari jaringan yang dieksisi. Oleh karena itu, metode pengayaan sel kami yang dikombinasikan dengan spektrometri massa dapat memberikan wawasan tentang metabolit yang diperkaya secara berbeda dalam sel T dan populasi sel tumor pada sampel pasien yang sesuai. Meskipun metode ini memiliki keunggulan dibandingkan dengan pengurutan sel yang diaktifkan fluoresensi, pustaka metabolit tertentu mungkin terpengaruh karena stabilitas inheren dan/atau laju pergantian yang cepat (22). Meskipun demikian, metode kami mampu mengidentifikasi dua metabolit imunosupresif yang dikenal, adenosin dan kynurenin, karena keduanya sangat bervariasi antara jenis sampel.
Analisis metabonomik kami terhadap subtipe tumor dan TIL memberikan wawasan lebih lanjut tentang peran metabolit dalam TME ovarium. Pertama, menggunakan sitometri aliran, kami menentukan bahwa tidak ada perbedaan aktivitas mitokondria antara tumor dan sel T CD4+. Namun, analisis LC-MS/MS mengungkapkan perubahan signifikan dalam kelimpahan metabolit di antara populasi ini, menunjukkan bahwa kesimpulan tentang metabolisme TIL dan aktivitas metabolik keseluruhannya memerlukan interpretasi yang cermat. Kedua, MNA adalah metabolit dengan perbedaan terbesar antara sel CD45 dan sel T dalam asites, bukan tumor. Oleh karena itu, kompartementalisasi dan lokasi tumor mungkin memiliki efek yang berbeda pada metabolisme TIL, yang menyoroti kemungkinan heterogenitas dalam lingkungan mikro tertentu. Ketiga, ekspresi enzim penghasil MNA, NNMT, sebagian besar terbatas pada CAF, yang merupakan sel tumor dalam jumlah yang lebih sedikit, tetapi kadar MNA yang terdeteksi diamati pada sel T yang berasal dari tumor. Ekspresi berlebihan NNMT pada CAF ovarium diketahui memiliki efek pendorong kanker, sebagian karena peningkatan metabolisme CAF, invasi tumor, dan metastasis (27). Meskipun tingkat TIL secara keseluruhan moderat, ekspresi NNMT pada CAF terkait erat dengan subtipe mesenkimal Cancer Genome Atlas (TCGA), yang dikaitkan dengan prognosis buruk (27, 46, 47). Terakhir, ekspresi enzim AOX1 yang bertanggung jawab untuk degradasi MNA juga terbatas pada populasi CAF, yang menunjukkan bahwa sel T tidak memiliki kemampuan untuk memetabolisme MNA. Hasil ini mendukung gagasan bahwa meskipun diperlukan penelitian lebih lanjut untuk memverifikasi temuan ini, tingkat MNA yang tinggi pada sel T dapat mengindikasikan adanya lingkungan mikro CAF yang imunosupresif.
Mengingat rendahnya tingkat ekspresi transporter MNA dan tidak terdeteksinya protein-protein kunci yang terlibat dalam metabolisme MNA, keberadaan MNA dalam sel T tidak terduga. Baik NNMT maupun AOX1 tidak dapat dideteksi melalui analisis scRNA-seq dan qPCR bertarget dari dua kohort independen. Hasil ini menunjukkan bahwa MNA tidak disintesis oleh sel T, tetapi diserap dari lingkungan mikro tumor (TME) di sekitarnya. Eksperimen in vitro menunjukkan bahwa sel T cenderung mengakumulasi MNA eksogen.
Studi in vitro kami menunjukkan bahwa MNA eksogen menginduksi ekspresi TNFα pada sel T dan meningkatkan pengikatan Sp1 ke promotor TNFα. Meskipun TNFα memiliki fungsi anti-tumor dan anti-inflamasi, pada kanker ovarium, TNFα dapat mendorong pertumbuhan kanker ovarium (31-33). Netralisasi TNFα dalam kultur sel tumor ovarium atau penghapusan sinyal TNFα pada model tikus dapat meningkatkan produksi sitokin inflamasi yang dimediasi TNFα dan menghambat pertumbuhan tumor (32, 35). Oleh karena itu, dalam kasus ini, MNA yang berasal dari TME dapat bertindak sebagai metabolit pro-inflamasi melalui mekanisme yang bergantung pada TNFα melalui lingkaran autokrin, sehingga mendorong terjadinya dan penyebaran kanker ovarium (31). Berdasarkan kemungkinan ini, blokade TNFα sedang dipelajari sebagai agen terapi potensial untuk kanker ovarium (37, 48, 49). Selain itu, MNA mengganggu sitotoksisitas sel CAR-T terhadap sel tumor ovarium, memberikan bukti lebih lanjut untuk penekanan imun yang dimediasi MNA. Secara kolektif, hasil ini menunjukkan model di mana tumor dan sel CAF mensekresikan MNA ke dalam TME ekstraseluler. Melalui (i) stimulasi pertumbuhan kanker ovarium yang diinduksi TNF dan (ii) penghambatan aktivitas sitotoksik sel T yang diinduksi MNA, hal ini dapat memiliki efek ganda pada tumor (Gambar 5D).
Kesimpulannya, dengan menerapkan kombinasi pengayaan sel cepat, pengurutan sel tunggal, dan profil metabolisme, penelitian ini mengungkapkan perbedaan imunometabolomik yang sangat besar antara sel tumor dan sel asites pada pasien HGSC. Analisis komprehensif ini menunjukkan bahwa terdapat perbedaan dalam penyerapan glukosa dan aktivitas mitokondria antara sel T, dan mengidentifikasi MNA sebagai metabolit pengatur imun non-sel otonom. Data ini berdampak pada bagaimana TME memengaruhi metabolisme sel T pada kanker manusia. Meskipun persaingan langsung untuk nutrisi antara sel T dan sel kanker telah dilaporkan, metabolit juga dapat bertindak sebagai pengatur tidak langsung untuk mendorong perkembangan tumor dan mungkin menekan respons imun endogen. Deskripsi lebih lanjut tentang peran fungsional metabolit pengatur ini dapat membuka strategi alternatif untuk meningkatkan respons imun anti-tumor.
Spesimen pasien dan data klinis diperoleh melalui repositori jaringan tumor kanker BC yang disertifikasi oleh Jaringan Repositori Jaringan Kanada. Sesuai dengan protokol yang disetujui oleh Komite Etika Penelitian Kanker BC dan Universitas British Columbia (H07-00463), semua spesimen dan data klinis pasien memperoleh persetujuan tertulis yang diinformasikan atau secara resmi melepaskan persetujuan mereka. Sampel disimpan di BioBank bersertifikat (BRC-00290). Karakteristik pasien secara detail ditunjukkan pada Tabel S1 dan S5. Untuk kriopreservasi, pisau bedah digunakan untuk menguraikan sampel tumor pasien secara mekanis dan kemudian mendorongnya melalui filter 100 mikron untuk mendapatkan suspensi sel tunggal. Cairan asites pasien disentrifugasi pada 1500 rpm selama 10 menit pada suhu 4°C untuk memisahkan sel dan membuang supernatan. Sel yang diperoleh dari tumor dan asites dibekukan dalam 50% serum AB manusia yang diinaktivasi panas (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) dan 10% dimetil sulfoksida. Suspensi sel tunggal yang diawetkan ini dicairkan dan digunakan untuk metabolomik dan penentuan metabolit yang dijelaskan di bawah ini.
Medium lengkap terdiri dari RPMI 1640: AimV yang disaring 0,22 μm dengan perbandingan 50:50. RPMI 1640 + 2,05 mM l-glutamin (Thermo Fisher Scientific) ditambah dengan 10% serum AB manusia yang diinaktivasi panas (Sigma-Aldrich), 12,5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamin (Thermo Fisher Scientific), 1 x larutan Penisilin Streptomisin (PenStrep) (Thermo Fisher Scientific) dan 50 μM merkaptoetanol. AimV (Invitrogen) ditambah dengan 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) dan 2 mM l-glutamin (Thermo Fisher Scientific). Larutan penyangga pewarnaan flow sitometer terdiri dari larutan garam fosfat (PBS; Invitrogen) yang disaring 0,22 μm dan ditambah dengan 3% serum manusia AB yang diinaktivasi panas (Sigma). Larutan penyangga pengayaan sel terdiri dari PBS yang disaring 0,22 μm dan ditambah dengan 0,5% serum manusia AB yang diinaktivasi panas (Sigma-Aldrich).
Dalam medium lengkap 37°C, sel diwarnai dengan 10 nM MT DR dan 100 μM 2-NBDG selama 30 menit. Selanjutnya, sel diwarnai dengan pewarna viabilitas eF506 pada suhu 4°C selama 15 menit. Suspensi sel dalam FC Block (eBioscience) dan Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), diencerkan dalam buffer pewarnaan flow sitometer (sesuai petunjuk pabrik), dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu kamar. Warnai sel dengan serangkaian antibodi (Tabel S2) dalam buffer pewarnaan flow sitometri pada suhu 4°C selama 20 menit. Suspensi sel dalam buffer pewarnaan flow sitometri (Cytek Aurora; konfigurasi 3L-16V-14B-8R) sebelum analisis. Gunakan SpectroFlo dan FlowJo V10 untuk menganalisis data jumlah sel, dan gunakan GraphPad Prism 8 untuk membuat data. Intensitas fluoresensi median (MFI) dari 2-NBDG dan MT DR dinormalisasi logaritmik, kemudian uji t berpasangan digunakan untuk analisis statistik guna memperhitungkan pasien yang cocok. Semua populasi dengan kurang dari 40 kejadian dikeluarkan dari analisis; masukkan nilai MFI 1 untuk setiap nilai negatif sebelum melakukan analisis statistik dan visualisasi data.
Untuk melengkapi strategi gating manual dari panel proses di atas, kami menggunakan anotasi lengkap dengan pohon pembatasan bentuk (FAUST) (21) untuk secara otomatis menetapkan sel ke populasi setelah menghilangkan sel mati di FlowJo. Kami mengelola output secara manual untuk menggabungkan populasi yang tampaknya salah dialokasikan (menggabungkan sel tumor PD1+ dengan PD1-) dan populasi yang dipertahankan. Setiap sampel mengandung rata-rata lebih dari 2% sel, dengan total 11 populasi.
Sentrifugasi gradien densitas Ficoll digunakan untuk memisahkan PBMC dari produk pemisahan leukosit (STEMCELL Technologies). Sel T CD8+ diisolasi dari PBMC menggunakan CD8 MicroBeads (Miltenyi) dan diperbanyak dalam medium lengkap menggunakan TransAct (Miltenyi) selama 2 minggu sesuai petunjuk pabrik. Sel dibiarkan selama 5 hari dalam medium lengkap yang mengandung IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), dan kemudian distimulasi ulang dengan TransAct. Pada hari ke-7, sesuai petunjuk pabrik, human CD45 MicroBeads (Miltenyi) digunakan untuk memperkaya sel dalam tiga putaran berturut-turut. Sel-sel tersebut dialiquot untuk analisis sitometri aliran (seperti yang dijelaskan di atas), dan satu juta sel dialiquot tiga kali untuk analisis LC-MS/MS. Sampel diproses dengan LC-MS/MS seperti yang dijelaskan di bawah ini. Kami memperkirakan nilai metabolit yang hilang dengan jumlah ion 1.000. Setiap sampel dinormalisasi berdasarkan jumlah ion total (TIC), dikonversi secara logaritmik, dan dinormalisasi secara otomatis di MetaboAnalystR sebelum analisis.
Suspensi sel tunggal dari setiap pasien dicairkan dan disaring melalui filter 40 μm ke dalam medium lengkap (seperti yang dijelaskan di atas). Menurut protokol pabrikan, tiga putaran seleksi positif berturut-turut dengan pemisahan manik magnetik menggunakan MicroBeads (Miltenyi) digunakan untuk memperkaya sampel untuk sel CD8+, CD4+, dan CD45- (di atas es). Singkatnya, sel-sel tersebut disuspensikan kembali dalam buffer pengayaan sel (seperti yang dijelaskan di atas) dan dihitung. Sel-sel tersebut diinkubasi dengan manik-manik CD8 manusia, manik-manik CD4 manusia, atau manik-manik CD45 manusia (Miltenyi) pada suhu 4°C selama 15 menit, dan kemudian dicuci dengan buffer pengayaan sel. Sampel dilewatkan melalui kolom LS (Miltenyi), dan fraksi positif dan negatif dikumpulkan. Untuk mengurangi durasi dan memaksimalkan langkah pemulihan sel, fraksi CD8- kemudian digunakan untuk putaran kedua pengayaan CD4+, dan fraksi CD4- digunakan untuk pengayaan CD45- selanjutnya. Jaga agar larutan tetap dingin di atas es selama proses pemisahan.
Untuk menyiapkan sampel untuk analisis metabolit, sel dicuci sekali dengan larutan garam dingin, dan 1 ml metanol 80% ditambahkan ke setiap sampel, kemudian di-vortex dan dibekukan cepat dalam nitrogen cair. Sampel dikenai tiga siklus pembekuan-pencairan dan disentrifugasi pada 14.000 rpm selama 15 menit pada suhu 4°C. Supernatan yang mengandung metabolit diuapkan hingga kering. Metabolit dilarutkan kembali dalam 50 μl asam format 0,03%, di-vortex untuk dicampur, dan kemudian disentrifugasi untuk menghilangkan kotoran.
Ekstrak metabolit seperti yang dijelaskan di atas. Pindahkan supernatan ke botol kromatografi cair kinerja tinggi untuk penelitian metabolomik. Gunakan protokol perlakuan acak untuk memperlakukan setiap sampel dengan jumlah sel yang serupa untuk mencegah efek batch. Kami melakukan penilaian kualitatif metabolit global yang sebelumnya dipublikasikan pada Spektrometer Massa Triple Quadrupole AB SCIEX QTRAP 5500 (50). Analisis kromatografi dan integrasi luas puncak dilakukan menggunakan perangkat lunak MultiQuant versi 2.1 (Applied Biosystems SCIEX).
Jumlah ion 1000 digunakan untuk memperkirakan nilai metabolit yang hilang, dan TIC dari setiap sampel digunakan untuk menghitung luas puncak yang dinormalisasi dari setiap metabolit yang terdeteksi untuk mengoreksi perubahan yang diperkenalkan oleh analisis instrumental dari pemrosesan sampel. Setelah TIC dinormalisasi, MetaboAnalystR(51) (parameter default) digunakan untuk konversi logaritmik dan penskalaan garis normal otomatis. Kami menggunakan PCA dengan paket R vegan untuk melakukan analisis eksplorasi perbedaan metabolom antara jenis sampel, dan menggunakan analisis redundansi parsial untuk menganalisis pasien. Gunakan metode Ward untuk membangun dendrogram peta panas untuk mengelompokkan jarak Euclidean antara sampel. Kami menggunakan limma (52) pada kelimpahan metabolit yang distandarisasi untuk mengidentifikasi metabolit yang berbeda kelimpahannya di seluruh jenis sel dan lingkungan mikro. Untuk menyederhanakan penjelasan, kami menggunakan parameter rata-rata kelompok untuk menentukan model, dan menganggap jenis sel dalam lingkungan mikro sebagai setiap kelompok (n = 6 kelompok); Untuk uji signifikansi, kami melakukan tiga pengukuran berulang untuk setiap metabolit. Untuk menghindari replikasi palsu, pasien dimasukkan sebagai hambatan dalam desain limma. Untuk memeriksa perbedaan metabolit antar pasien yang berbeda, kami menyesuaikan model limma dengan memasukkan pasien secara tetap. Kami melaporkan signifikansi kontras yang telah ditentukan sebelumnya antara tipe sel dan lingkungan mikro Padj <0,05 (koreksi Benjamini-Hochberg).
Setelah peningkatan viabilitas menggunakan Miltenyi Dead Cell Removal Kit (>80% viabilitas), sekuensing transkriptom sel tunggal dilakukan pada sampel asites dan tumor beku hidup total menggunakan protokol ekspresi gen 5′ 10x. Lima kasus dengan tumor dan asites yang cocok dianalisis, meskipun viabilitas rendah dari satu sampel tumor mencegah inklusinya. Untuk mencapai beberapa seleksi pasien, kami menggabungkan sampel setiap pasien di jalur pengontrol kromium 10x, dan menganalisis lokasi asites dan tumor secara terpisah. Setelah sekuensing [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp paired end (PE), genom Quebec; rata-rata 73.488 dan 41.378 pembacaan per sel untuk tumor dan asites masing-masing]], kami menggunakan CellSNP dan Vireo (53) (berdasarkan CellSNP sebagai SNP manusia umum (VCF) yang disediakan oleh GRCh38 diberi identitas donor. Kami menggunakan SNPRelate untuk menyimpulkan identitas terdekat (IBS) dari status genotipe pasien (IBS), tidak termasuk sel yang tidak tertugaskan dan sel yang diidentifikasi sebagai dupleks dan mencocokkan donor antara sampel asites dan tumor (54). Berdasarkan tugas ini, kami mempertahankan tiga kasus dengan representasi sel yang melimpah di tumor dan asites untuk analisis selanjutnya. Setelah melakukan langkah filtrasi massal dalam pengemasan BioConductor scater (55) dan scran (56), ini menghasilkan 6975 sel (2792 dan 4183 sel dari tumor dan asites, masing-masing) untuk analisis. Kami menggunakan pengelompokan Louvain dari jaringan tetangga terdekat bersama igraph (57). (SNN) berdasarkan jarak Jaccard untuk mengelompokkan sel berdasarkan ekspresi. Klaster tersebut dianotasi secara manual ke tipe sel yang diduga berdasarkan ekspresi gen penanda dan divisualisasikan dengan t-SNE. Sel T sitotoksik didefinisikan oleh ekspresi CD8A dan GZMA, tidak termasuk subklaster dengan ekspresi protein ribosom rendah. Kami mengakses data yang dipublikasikan oleh Izar et al. (16), termasuk penyematan t-SNE mereka, dapat mengontrol tumpang tindih ekspresi antara penanda sel imun dan ekspresi NNMT.
PBMC dipisahkan dari produk pemisahan leukosit (STEMCELL Technologies) dengan sentrifugasi gradien densitas Ficoll. Sel CD3+ diisolasi dari PBMC menggunakan manik-manik CD3 (Miltenyi). Dengan atau tanpa MNA, sel CD3+ diaktivasi dengan CD3 terikat lempeng (5μg/ml), CD28 larut (3μg/ml) dan IL-2 (300 U/ml; Proleukin). Pada hari terakhir ekspansi, viabilitas (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) dan proliferasi (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) dievaluasi dengan sitometri aliran. Evaluasi fungsi efektor dengan menstimulasi sel menggunakan PMA (20 ng/ml) dan ionomisin (1 μg/ml) dengan GolgiStop selama 4 jam, dan pantau CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4, BioLegend) dan TNFα-fluorescein isothiocyanate (FITC) (MAb11, BD). Stimulasi sel qPCR dan ChIP dengan PMA (20 ng/ml) dan ionomisin (1 μg/ml) selama 4 jam. Supernatan ELISA dikumpulkan sebelum dan setelah stimulasi dengan PMA (20 ng/ml) dan ionomisin (1 μg/ml) selama 4 jam.
Ikuti protokol pabrikan untuk mengisolasi RNA menggunakan RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). Gunakan QIAshredder (QIAGEN) untuk menghomogenkan sampel. Gunakan kit RNA ke cDNA berkapasitas tinggi (Thermo Fisher Scientific) untuk mensintesis DNA komplementer (cDNA). Gunakan TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) untuk mengukur ekspresi gen (sesuai protokol pabrikan) dengan probe berikut: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [gliserolaldehida-3-fosfat tanpa Hidrogen (GAPDH)] dan Hs01010726_m1 (SLC22A2). Sampel dianalisis menggunakan sistem PCR real-time StepOnePlus (Applied Biosystems) dalam pelat reaksi 96 sumur optik cepat MicroAmp (Applied Biosystems) dengan film optik MicroAmp. Nilai Ct apa pun yang melebihi 35 dianggap berada di atas ambang deteksi dan ditandai sebagai tidak terdeteksi.
Lakukan ChIP seperti yang dijelaskan sebelumnya (58). Singkatnya, sel-sel diperlakukan dengan formaldehida (konsentrasi akhir 1,42%) dan diinkubasi pada suhu kamar selama 10 menit. Gunakan buffer pembengkakan yang dilengkapi (25 mM Hepes, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl dan 0,1% NP-40) di atas es selama 10 menit, kemudian suspensikan kembali dalam buffer imunopresipitasi seperti yang dijelaskan (58). Sampel kemudian disonikasi dengan siklus berikut: 10 siklus (20 pulsa 1 detik) dan waktu statis 40 detik. Inkubasi antibodi imunoglobulin G (Cell Signaling Technology; 1μl), histon H3 (Cell Signaling Technology; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) dan SP1 (Cell Signaling Technology; 3μl) kelas ChIP dengan sampel pada suhu 4°C sambil digoyang semalaman. Inkubasi manik-manik protein A (Thermo Fisher Scientific) dengan sampel pada suhu 4°C dengan pengocokan perlahan selama 1 jam, kemudian gunakan manik-manik Chelex (Bio-Rad) untuk memperkaya DNA, dan gunakan proteinase K (Thermo Fisher) untuk pencernaan protein. Promotor TNFα dideteksi dengan PCR: maju, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; sebaliknya, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (produk 207-bp). Gambar dihasilkan oleh Image Lab (Bio-Rad) dan dikuantifikasi menggunakan perangkat lunak ImageJ.
Supernatan kultur sel dikumpulkan seperti yang dijelaskan di atas. Penentuan dilakukan sesuai dengan prosedur pabrikan kit ELISA TNFα manusia (Invitrogen), kit ELISA IL-2 manusia (Invitrogen), dan kit ELISA IFN-γ manusia (Abcam). Menurut protokol pabrikan, supernatan diencerkan 1:100 untuk mendeteksi TNFα dan IL-2, dan 1:3 untuk mendeteksi IFN-γ. Gunakan EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) untuk mengukur absorbansi pada 450 nm.
PBMC dipisahkan dari produk pemisahan leukosit (STEMCELL Technologies) dengan sentrifugasi gradien densitas Ficoll. Sel CD3+ diisolasi dari PBMC menggunakan manik-manik CD3 (Miltenyi). Dengan atau tanpa MNA, sel CD3+ diaktivasi dengan CD3 terikat lempeng (5μg/ml), CD28 larut (3μg/ml) dan IL-2 (300 U/ml; Proleukin) selama 3 hari. Setelah 3 hari, sel dikumpulkan dan dicuci dengan larutan garam 0,9%, dan pelet dibekukan dengan cepat. Penghitungan sel dilakukan dengan sitometri aliran (Cytek Aurora; konfigurasi 3L-16V-14B-8R) menggunakan eBeads 123count.
Ekstrak metabolit seperti yang dijelaskan di atas. Ekstrak kering dilarutkan kembali pada konsentrasi 4000 setara sel/μl. Analisis sampel dengan kromatografi fase terbalik (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) dan kolom CORTECS T3 (2,1×150 mm, ukuran partikel 1,6-μm, ukuran pori 120-Å; #186008500, Waters). Spektrometer massa polar (6470, Agilent), di mana ionisasi elektrospray beroperasi dalam mode positif. Fase gerak A adalah asam format 0,1% (dalam H2O), fase gerak B adalah asetonitril 90%, asam format 0,1%. Gradien LC adalah 0 hingga 2 menit untuk 100% A, 2 hingga 7,1 menit untuk 99% B, dan 7,1 hingga 8 menit untuk 99% B. Kemudian, lakukan penyeimbangan ulang kolom dengan fase gerak A pada laju alir 0,6 ml/menit selama 3 menit. Laju alir adalah 0,4 ml/menit, dan ruang kolom dipanaskan hingga 50°C. Gunakan standar kimia murni MNA (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Kanada) untuk menentukan waktu retensi (RT) dan transformasi (RT = 0,882 menit, transformasi 1 = 137→94,1, transformasi 2 = 137→92, Transformasi 3 = 137→78). Ketika ketiga transisi terjadi pada waktu retensi yang benar, transisi 1 digunakan untuk kuantifikasi guna memastikan spesifisitas. Kurva standar MNA (Toronto Research Chemical Company) dihasilkan melalui enam pengenceran serial larutan stok (1 mg/ml) untuk mendapatkan standar cairan masing-masing 0,1, 1,0, 10 dan 100 ng/ml dan 1,0 dan 10 μg/ml. Batas deteksi adalah 1 ng/ml, dan respons linier berada antara 10 ng/ml dan 10 μg/ml. Setiap injeksi dua mikroliter sampel dan standar digunakan untuk analisis LC/MS, dan sampel kontrol kualitas campuran dijalankan setiap delapan injeksi untuk memastikan stabilitas platform analisis. Respons MNA dari semua sampel sel yang diberi perlakuan MNA berada dalam rentang linier pengujian. Analisis data dilakukan menggunakan perangkat lunak analisis kuantitatif MassHunter (v9.0, Agilent).
Konstruksi αFR-CAR generasi kedua diambil dari Song et al. (59). Singkatnya, konstruksi tersebut mengandung isi berikut: sekuens pemimpin CD8a, fragmen variabel rantai tunggal spesifik αFR manusia, engsel CD8a dan daerah transmembran, domain intraseluler CD27 dan domain intraseluler CD3z. Sekuens CAR lengkap disintesis oleh GenScript, dan kemudian dikloning ke dalam vektor ekspresi lentiviral generasi kedua di hulu kaset ekspresi GFP yang digunakan untuk mengevaluasi efisiensi transduksi.
Lentivirus diproduksi dengan transfeksi sel HEK293T [American Type Culture Collection (ATCC)]; ditumbuhkan dalam medium Eagle yang dimodifikasi Dulbecco yang mengandung 10% serum janin sapi (FBS) dan 1% PenStrep, dan menggunakan vektor CAR-GFP serta plasmid pengemas (psPAX2 dan pMD2.G, Addgene) menggunakan lipofeksi amina (Sigma-Aldrich). Supernatan yang mengandung virus dikumpulkan 48 dan 72 jam setelah transfeksi, disaring, dan dikonsentrasikan dengan ultrasentrifugasi. Simpan supernatan virus yang terkonsentrasi pada suhu -80°C hingga transduksi.
PBMC dipisahkan dari produk pemisahan leukosit donor sehat (STEMCELL Technologies) dengan sentrifugasi gradien densitas Ficoll. Gunakan mikromanik CD8 seleksi positif (Miltenyi) untuk mengisolasi sel CD8+ dari PBMC. Stimulasi sel T dengan TransAct (Miltenyi) dan dalam medium TexMACS [Miltenyi; ditambah dengan 3% serum manusia yang diinaktivasi panas, 1% PenStrep dan IL-2 (300 U/ml)]. Dua puluh empat jam setelah stimulasi, sel T ditransduksi dengan lentivirus (10 μl supernatan virus terkonsentrasi per 10⁶ sel). 1 hingga 3 hari setelah transduksi pada Cytek Aurora (pada FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+), evaluasi ekspresi GFP sel untuk menunjukkan efisiensi transduksi minimal 30%.
Sel CAR-T dikultur selama 24 jam dalam Immunocult (STEMCELL Technologies; ditambah dengan 1% PenStrep) dengan kondisi berikut: tidak diobati, diobati dengan 250 μM adenosin atau 10 mM MNA. Setelah pra-perlakuan, sel CAR-T dicuci dengan PBS dan dikombinasikan dengan 20.000 sel SK-OV-3 [ATCC; dalam medium McCoy 5A (Sigma-Aldrich) ditambah dengan 10% FBS dan 1% PenStrep pada rasio efektor terhadap target 10:1]. Rasio efektor terhadap target adalah 1, dan dilakukan amplifikasi rangkap tiga dalam medium Immunocult yang telah ditambah. Sel SK-OV-3 dan sel SK-OV-3 yang dilisis dengan digitalis saponin (0,5 mg/ml; Sigma-Aldrich) digunakan masing-masing sebagai kontrol negatif dan positif. Setelah 24 jam ko-kultur, supernatan dikumpulkan dan laktat dehidrogenase (LDH) diukur sesuai dengan petunjuk produsen (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). Supernatan LDH diencerkan 1:50 dalam buffer LDH. Persentase pembunuhan diukur menggunakan rumus berikut: persentase pembunuhan = persentase koreksi / tingkat pembunuhan maksimum x 100%, di mana persentase koreksi = ko-kultur - sel T saja, dan tingkat pembunuhan maksimum = kontrol positif - kontrol negatif.
Seperti yang dijelaskan dalam teks atau bagian bahan dan metode, gunakan GraphPad Prism 8, Microsoft Excel, atau R v3.6.0 untuk analisis statistik. Jika beberapa sampel dikumpulkan dari pasien yang sama (seperti asites dan tumor), kami menggunakan uji t berpasangan atau memasukkan pasien sebagai efek acak dalam model linier atau umum sesuai kebutuhan. Untuk analisis metabolomik, uji kepentingan dilakukan sebanyak tiga kali.
Untuk materi tambahan artikel ini, silakan lihat http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
Artikel ini merupakan artikel akses terbuka yang didistribusikan di bawah ketentuan Lisensi Creative Commons Attribution-Non-Commercial, yang mengizinkan penggunaan, distribusi, dan reproduksi dalam media apa pun, selama penggunaan akhir bukan untuk keuntungan komersial dan premisnya adalah bahwa karya asli tersebut benar. Referensi.
Catatan: Kami hanya meminta Anda untuk memberikan alamat email Anda agar orang yang Anda rekomendasikan ke halaman ini mengetahui bahwa Anda ingin mereka melihat email tersebut dan bahwa email tersebut bukan spam. Kami tidak akan menyimpan alamat email apa pun.
Pertanyaan ini digunakan untuk menguji apakah Anda adalah pengunjung dan mencegah pengiriman spam otomatis.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (Ralph J. DeBerardinis), Russell G. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA berkontribusi pada penekanan imun sel T dan merupakan target imunoterapi potensial untuk pengobatan kanker manusia.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (Ralph J. DeBerardinis), Russell G. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA berkontribusi pada penekanan imun sel T dan merupakan target imunoterapi potensial untuk pengobatan kanker manusia.
©2021 Asosiasi Amerika untuk Kemajuan Ilmu Pengetahuan. semua hak dilindungi undang-undang. AAAS adalah mitra dari HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef dan COUNTER. ScienceAdvanced ISSN 2375-2548.