Asam propionat (PPA), agen antijamur dan aditif makanan umum, telah terbukti menyebabkan perkembangan saraf abnormal pada tikus disertai disfungsi gastrointestinal, yang mungkin disebabkan oleh disbiosis usus. Hubungan antara paparan PPA dalam makanan dan disbiosis mikrobiota usus telah diusulkan, tetapi belum diselidiki secara langsung. Di sini, kami menyelidiki perubahan komposisi mikrobiota usus yang terkait dengan PPA yang dapat menyebabkan disbiosis. Mikrobioma usus tikus yang diberi makanan tanpa perlakuan (n=9) dan makanan yang diperkaya PPA (n=13) diurutkan menggunakan pengurutan metagenomik jarak jauh untuk menilai perbedaan komposisi mikroba dan jalur metabolisme bakteri. PPA dalam makanan dikaitkan dengan peningkatan kelimpahan taksa penting, termasuk beberapa spesies Bacteroides, Prevotella, dan Ruminococcus, yang anggotanya sebelumnya telah terlibat dalam produksi PPA. Mikrobioma tikus yang terpapar PPA juga memiliki lebih banyak jalur yang terkait dengan metabolisme lipid dan biosintesis hormon steroid. Hasil penelitian kami menunjukkan bahwa PPA dapat mengubah mikrobiota usus dan jalur metabolisme terkaitnya. Perubahan yang diamati ini menyoroti bahwa pengawet yang diklasifikasikan sebagai aman untuk dikonsumsi dapat memengaruhi komposisi mikrobiota usus dan, pada gilirannya, kesehatan manusia. Di antara pilihan tersebut, P, G, atau S dipilih tergantung pada tingkat klasifikasi yang dianalisis. Untuk meminimalkan dampak klasifikasi positif palsu, ambang batas kelimpahan relatif minimum sebesar 1e-4 (1/10.000 pembacaan) diadopsi. Sebelum analisis statistik, kelimpahan relatif yang dilaporkan oleh Bracken (fraction_total_reads) ditransformasikan menggunakan transformasi rasio log terpusat (CLR) (Aitchison, 1982). Metode CLR dipilih untuk transformasi data karena bersifat invarian skala dan cukup untuk dataset yang tidak jarang (Gloor dkk., 2017). Transformasi CLR menggunakan logaritma natural. Data hitungan yang dilaporkan oleh Bracken dinormalisasi menggunakan ekspresi log relatif (RLE) (Anders dan Huber, 2010). Gambar dihasilkan menggunakan kombinasi matplotlib v. 3.7.1, seaborn v. 3.7.2, dan logaritma sekuensial (Gloor dkk., 2017). 0.12.2 dan stantanotations v. 0.5.0 (Hunter, 2007; Waskom, 2021; Charlier et al., 2022). Rasio Bacillus/Bacteroidetes dihitung untuk setiap sampel menggunakan jumlah bakteri yang dinormalisasi. Nilai yang dilaporkan dalam tabel dibulatkan hingga 4 desimal. Indeks keanekaragaman Simpson dihitung menggunakan skrip alpha_diversity.py yang disediakan dalam paket KrakenTools v. 1.2 (Lu et al., 2022). Laporan Bracken disediakan dalam skrip dan indeks Simpson “Si” disediakan untuk parameter -an. Perbedaan kelimpahan yang signifikan didefinisikan sebagai perbedaan CLR rata-rata ≥ 1 atau ≤ -1. Perbedaan CLR rata-rata ±1 menunjukkan peningkatan 2,7 kali lipat dalam kelimpahan suatu jenis sampel. Tanda (+/-) menunjukkan apakah takson tersebut lebih melimpah pada sampel PPA dan sampel kontrol, masing-masing. Signifikansi ditentukan menggunakan uji Mann-Whitney U (Virtanen dkk., 2020). Perangkat lunak Statsmodels v. 0.14 (Benjamini dan Hochberg, 1995; Seabold dan Perktold, 2010) digunakan, dan prosedur Benjamini-Hochberg diterapkan untuk mengoreksi pengujian berganda. Nilai p yang disesuaikan ≤ 0,05 digunakan sebagai ambang batas untuk menentukan signifikansi statistik.
Mikrobioma manusia sering disebut sebagai “organ terakhir tubuh” dan memainkan peran vital dalam kesehatan manusia (Baquero dan Nombela, 2012). Secara khusus, mikrobioma usus dikenal karena pengaruhnya yang luas dan perannya dalam banyak fungsi penting. Bakteri komensal melimpah di usus, menempati berbagai ceruk ekologis, memanfaatkan nutrisi, dan bersaing dengan patogen potensial (Jandhyala dkk., 2015). Berbagai komponen bakteri dari mikrobiota usus mampu menghasilkan nutrisi penting seperti vitamin dan meningkatkan pencernaan (Rowland dkk., 2018). Metabolit bakteri juga telah terbukti memengaruhi perkembangan jaringan dan meningkatkan jalur metabolisme dan imun (Heijtz dkk., 2011; Yu dkk., 2022). Komposisi mikrobioma usus manusia sangat beragam dan bergantung pada faktor genetik dan lingkungan seperti diet, jenis kelamin, pengobatan, dan status kesehatan (Kumbhare dkk., 2019).
Diet ibu merupakan komponen penting dalam perkembangan janin dan bayi baru lahir, serta merupakan sumber senyawa yang berpotensi memengaruhi perkembangan (Bazer et al., 2004; Innis, 2014). Salah satu senyawa yang menarik perhatian adalah asam propionat (PPA), asam lemak rantai pendek yang merupakan produk sampingan dari fermentasi bakteri dan aditif makanan (den Besten et al., 2013). PPA memiliki sifat antibakteri dan antijamur, sehingga digunakan sebagai pengawet makanan dan dalam aplikasi industri untuk menghambat pertumbuhan jamur dan bakteri (Wemmenhove et al., 2016). PPA memiliki efek yang berbeda pada jaringan yang berbeda. Di hati, PPA memiliki efek antiinflamasi dengan memengaruhi ekspresi sitokin pada makrofag (Kawasoe et al., 2022). Efek pengaturan ini juga telah diamati pada sel imun lainnya, yang menyebabkan penurunan peradangan (Haase et al., 2021). Namun, efek sebaliknya telah diamati di otak. Penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa paparan PPA menginduksi perilaku mirip autisme pada tikus (El-Ansary et al., 2012). Penelitian lain menunjukkan bahwa PPA dapat menginduksi gliosis dan mengaktifkan jalur pro-inflamasi di otak (Abdelli et al., 2019). Karena PPA adalah asam lemah, ia dapat berdifusi melalui epitel usus ke dalam aliran darah dan dengan demikian melewati penghalang restriktif termasuk sawar darah-otak serta plasenta (Stinson et al., 2019), yang menyoroti pentingnya PPA sebagai metabolit pengatur yang diproduksi oleh bakteri. Meskipun peran potensial PPA sebagai faktor risiko autisme saat ini sedang diselidiki, efeknya pada individu dengan autisme mungkin meluas melampaui induksi diferensiasi saraf.
Gejala gastrointestinal seperti diare dan sembelit umum terjadi pada pasien dengan gangguan perkembangan saraf (Cao dkk., 2021). Studi sebelumnya menunjukkan bahwa mikrobioma pasien dengan gangguan spektrum autisme (ASD) berbeda dari individu sehat, yang menunjukkan adanya disbiosis mikrobiota usus (Finegold dkk., 2010). Demikian pula, karakteristik mikrobioma pasien dengan penyakit radang usus, obesitas, penyakit Alzheimer, dll. juga berbeda dari individu sehat (Turnbaugh dkk., 2009; Vogt dkk., 2017; Henke dkk., 2019). Namun, hingga saat ini, belum ada hubungan sebab-akibat yang terbukti antara mikrobioma usus dan penyakit atau gejala neurologis (Yap dkk., 2021), meskipun beberapa spesies bakteri diduga berperan dalam beberapa kondisi penyakit ini. Sebagai contoh, Akkermansia, Bacteroides, Clostridium, Lactobacillus, Desulfovibrio, dan genus lainnya lebih melimpah dalam mikrobiota pasien autisme (Tomova et al., 2015; Golubeva et al., 2017; Cristiano et al., 2018; Zurita et al., 2020). Perlu dicatat, spesies anggota dari beberapa genus ini diketahui memiliki gen yang terkait dengan produksi PPA (Reichardt et al., 2014; Yun dan Lee, 2016; Zhang et al., 2019; Baur dan Dürre, 2023). Mengingat sifat antimikroba PPA, peningkatan kelimpahannya dapat bermanfaat bagi pertumbuhan bakteri penghasil PPA (Jacobson et al., 2018). Dengan demikian, lingkungan yang kaya PPA dapat menyebabkan perubahan pada mikrobiota usus, termasuk patogen gastrointestinal, yang mungkin merupakan faktor potensial penyebab gejala gastrointestinal.
Pertanyaan sentral dalam penelitian mikrobioma adalah apakah perbedaan komposisi mikroba merupakan penyebab atau gejala dari penyakit yang mendasarinya. Langkah pertama untuk menjelaskan hubungan kompleks antara diet, mikrobioma usus, dan penyakit neurologis adalah dengan menilai efek diet pada komposisi mikroba. Untuk tujuan ini, kami menggunakan sekuensing metagenomik bacaan panjang untuk membandingkan mikrobioma usus keturunan tikus yang diberi diet kaya PPA atau diet rendah PPA. Keturunan tersebut diberi diet yang sama dengan induknya. Kami berhipotesis bahwa diet kaya PPA akan menghasilkan perubahan dalam komposisi mikroba usus dan jalur fungsional mikroba, khususnya yang terkait dengan metabolisme PPA dan/atau produksi PPA.
Penelitian ini menggunakan tikus transgenik FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J (Jackson Laboratories) yang mengekspresikan protein fluoresen hijau (GFP) secara berlebihan di bawah kendali promotor GFAP spesifik glia, mengikuti pedoman Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan Institusional Universitas Central Florida (UCF-IACUC) (Nomor Izin Penggunaan Hewan: PROTO202000002). Setelah disapih, tikus ditempatkan secara individual dalam kandang dengan 1–5 tikus jantan dan betina per kandang. Tikus diberi makan ad libitum dengan diet kontrol murni (diet standar label terbuka yang dimodifikasi, 16 kkal% lemak) atau diet yang dilengkapi natrium propionat (diet standar label terbuka yang dimodifikasi, 16 kkal% lemak, mengandung 5.000 ppm natrium propionat). Jumlah natrium propionat yang digunakan setara dengan 5.000 mg PFA/kg berat makanan total. Ini adalah konsentrasi PPA tertinggi yang disetujui untuk digunakan sebagai pengawet makanan. Untuk mempersiapkan penelitian ini, tikus induk diberi makan kedua jenis makanan selama 4 minggu sebelum kawin dan dilanjutkan selama kehamilan induk betina. Tikus keturunan [22 tikus, 9 kontrol (6 jantan, 3 betina) dan 13 PPA (4 jantan, 9 betina)] disapih dan kemudian melanjutkan diet yang sama dengan induk betina selama 5 bulan. Tikus keturunan dikorbankan pada usia 5 bulan dan isi feses ususnya dikumpulkan dan awalnya disimpan dalam tabung mikrosentrifuga 1,5 ml pada suhu -20°C dan kemudian dipindahkan ke freezer -80°C sampai DNA inang habis dan asam nukleat mikroba diekstrak.
DNA inang dihilangkan sesuai dengan protokol yang dimodifikasi (Charalampous et al., 2019). Singkatnya, isi feses dipindahkan ke 500 µl InhibitEX (Qiagen, Cat#/ID: 19593) dan disimpan dalam keadaan beku. Proses maksimal 1-2 pelet feses per ekstraksi. Isi feses kemudian dihomogenkan secara mekanis menggunakan alu plastik di dalam tabung untuk membentuk bubur. Sentrifugasi sampel pada 10.000 RCF selama 5 menit atau sampai sampel membentuk pelet, kemudian sedot supernatan dan suspensikan kembali pelet dalam 250 µl 1× PBS. Tambahkan 250 µl larutan saponin 4,4% (TCI, nomor produk S0019) ke sampel sebagai deterjen untuk melonggarkan membran sel eukariotik. Sampel dicampur perlahan hingga halus dan diinkubasi pada suhu kamar selama 10 menit. Selanjutnya, untuk menghancurkan sel eukariotik, 350 μl air bebas nuklease ditambahkan ke sampel, diinkubasi selama 30 detik, dan kemudian ditambahkan 12 μl NaCl 5 M. Sampel kemudian disentrifugasi pada 6000 RCF selama 5 menit. Sedot supernatan dan suspensikan kembali pelet dalam 100 μl PBS 1X. Untuk menghilangkan DNA inang, tambahkan 100 μl buffer HL-SAN (12,8568 g NaCl, 4 ml MgCl2 1M, 36 ml air bebas nuklease) dan 10 μl enzim HL-SAN (ArticZymes P/N 70910-202). Sampel dicampur secara menyeluruh dengan pipet dan diinkubasi pada suhu 37 °C selama 30 menit dengan kecepatan 800 rpm menggunakan Eppendorf™ ThermoMixer C. Setelah inkubasi, sampel disentrifugasi pada 6000 RCF selama 3 menit dan dicuci dua kali dengan 800 µl dan 1000 µl 1X PBS. Terakhir, endapan dilarutkan kembali dalam 100 µl 1X PBS.
DNA bakteri total diisolasi menggunakan Kit Pemurnian DNA Genomik Monarch New England Biolabs (New England Biolabs, Ipswich, MA, Cat# T3010L). Prosedur operasi standar yang disediakan dalam kit sedikit dimodifikasi. Inkubasi dan pertahankan air bebas nuklease pada suhu 60°C sebelum operasi untuk elusi akhir. Tambahkan 10 µl Proteinase K dan 3 µl RNase A ke setiap sampel. Kemudian tambahkan 100 µl Buffer Lisis Sel dan campur perlahan. Sampel kemudian diinkubasi dalam Eppendorf™ ThermoMixer C pada suhu 56°C dan 1400 rpm selama minimal 1 jam dan maksimal 3 jam. Sampel yang telah diinkubasi disentrifugasi pada 12.000 RCF selama 3 menit dan supernatan dari setiap sampel dipindahkan ke tabung mikrosentrifugasi 1,5 mL terpisah yang berisi 400 µL larutan pengikat. Tabung kemudian divortex secara berulang selama 5–10 detik dengan interval 1 detik. Pindahkan seluruh isi cairan dari setiap sampel (sekitar 600–700 µL) ke kartrid filter yang ditempatkan dalam tabung pengumpul aliran. Tabung disentrifugasi pada 1.000 RCF selama 3 menit untuk memungkinkan pengikatan DNA awal dan kemudian disentrifugasi pada 12.000 RCF selama 1 menit untuk menghilangkan sisa cairan. Kolom sampel dipindahkan ke tabung pengumpul baru dan kemudian dicuci dua kali. Untuk pencucian pertama, tambahkan 500 µL buffer pencuci ke setiap tabung. Balikkan tabung 3–5 kali dan kemudian sentrifugasi pada 12.000 RCF selama 1 menit. Buang cairan dari tabung pengumpul dan tempatkan kembali kartrid filter ke dalam tabung pengumpul yang sama. Untuk pencucian kedua, tambahkan 500 µL buffer pencuci ke filter tanpa membalikkannya. Sampel disentrifugasi pada 12.000 RCF selama 1 menit. Pindahkan filter ke tabung LoBind® 1,5 mL dan tambahkan 100 µL air bebas nuklease yang telah dihangatkan sebelumnya. Filter diinkubasi pada suhu kamar selama 1 menit dan kemudian disentrifugasi pada 12.000 RCF selama 1 menit. DNA yang telah dieluasi disimpan pada suhu -80°C.
Konsentrasi DNA diukur menggunakan Fluorometer Qubit™ 4.0. DNA disiapkan menggunakan Kit Sensitivitas Tinggi Qubit™ 1X dsDNA (No. Katalog Q33231) sesuai petunjuk pabrik. Distribusi panjang fragmen DNA diukur menggunakan TapeStation Agilent™ 4150 atau 4200. DNA disiapkan menggunakan Reagen DNA Genomik Agilent™ (No. Katalog 5067-5366) dan ScreenTape DNA Genomik (No. Katalog 5067-5365). Preparasi pustaka dilakukan menggunakan Kit Barcoding PCR Cepat Oxford Nanopore Technologies™ (ONT) (SQK-RPB004) sesuai petunjuk pabrik. DNA diurutkan menggunakan sequencer ONT GridION™ Mk1 dengan sel aliran Min106D (R 9.4.1). Pengaturan sekuensing adalah: penentuan basa dengan akurasi tinggi, nilai q minimum 9, pengaturan barcode, dan pemangkasan barcode. Sampel diurutkan selama 72 jam, setelah itu data penentuan basa dikirim untuk diproses dan dianalisis lebih lanjut.
Pemrosesan bioinformatika dilakukan menggunakan metode yang telah dijelaskan sebelumnya (Greenman et al., 2024). File FASTQ yang diperoleh dari sekuensing dibagi ke dalam direktori untuk setiap sampel. Sebelum analisis bioinformatika, data diproses menggunakan alur kerja berikut: pertama, file FASTQ dari sampel digabungkan menjadi satu file FASTQ. Kemudian, bacaan yang lebih pendek dari 1000 bp difilter menggunakan Filtlong v. 0.2.1, dengan satu-satunya parameter yang diubah adalah –min_length 1000 (Wick, 2024). Sebelum penyaringan lebih lanjut, kualitas bacaan dikontrol menggunakan NanoPlot v. 1.41.3 dengan parameter berikut: –fastq –plots dot –N50 -o
Untuk klasifikasi taksonomi, bacaan dan kontig yang dirakit diklasifikasikan menggunakan Kraken2 v. 2.1.2 (Wood et al., 2019). Hasilkan laporan dan file keluaran untuk bacaan dan rakitan, masing-masing. Gunakan opsi –use-names untuk menganalisis bacaan dan rakitan. Opsi –gzip-compressed dan –paired ditentukan untuk segmen bacaan. Kelimpahan relatif taksa dalam metagenom diperkirakan menggunakan Bracken v. 2.8 (Lu et al., 2017). Pertama-tama kami membuat basis data kmer yang berisi 1000 basa menggunakan bracken-build dengan parameter berikut: -d
Anotasi gen dan estimasi kelimpahan relatif dilakukan menggunakan versi modifikasi dari protokol yang dijelaskan oleh Maranga et al. (Maranga et al., 2023). Pertama, kontig yang lebih pendek dari 500 bp dihilangkan dari semua rakitan menggunakan SeqKit v. 2.5.1 (Shen et al., 2016). Rakitan yang dipilih kemudian digabungkan menjadi pan-metagenom. Kerangka baca terbuka (ORF) diidentifikasi menggunakan Prodigal v. 1.0.1 (versi paralel dari Prodigal v. 2.6.3) dengan parameter berikut: -d
Gen-gen pertama kali dikelompokkan berdasarkan pengidentifikasi ortolog (KO) Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) yang ditetapkan oleh eggNOG untuk membandingkan kelimpahan jalur gen. Gen tanpa knockout atau gen dengan beberapa knockout dihilangkan sebelum analisis. Kelimpahan rata-rata setiap KO per sampel kemudian dihitung dan analisis statistik dilakukan. Gen metabolisme PPA didefinisikan sebagai gen apa pun yang diberi baris ko00640 di kolom KEGG_Pathway, yang menunjukkan peran dalam metabolisme propionat menurut KEGG. Gen yang diidentifikasi terkait dengan produksi PPA tercantum dalam Tabel Tambahan 1 (Reichardt et al., 2014; Yang et al., 2017). Uji permutasi dilakukan untuk mengidentifikasi gen metabolisme dan produksi PPA yang secara signifikan lebih melimpah di setiap jenis sampel. Seribu permutasi dilakukan untuk setiap gen yang dianalisis. Nilai p 0,05 digunakan sebagai batas untuk menentukan signifikansi statistik. Anotasi fungsional diberikan kepada gen individual dalam suatu klaster berdasarkan anotasi gen representatif dalam klaster tersebut. Taksa yang terkait dengan metabolisme PPA dan/atau produksi PPA dapat diidentifikasi dengan mencocokkan ID kontig dalam file keluaran Kraken2 dengan ID kontig yang sama yang dipertahankan selama anotasi fungsional menggunakan eggNOG. Pengujian signifikansi dilakukan menggunakan uji Mann-Whitney U yang telah dijelaskan sebelumnya. Koreksi untuk pengujian berganda dilakukan menggunakan prosedur Benjamini-Hochberg. Nilai p ≤ 0,05 digunakan sebagai batas untuk menentukan signifikansi statistik.
Keragaman mikrobioma usus tikus dinilai menggunakan indeks keragaman Simpson. Tidak ada perbedaan signifikan yang diamati antara sampel kontrol dan PPA dalam hal keragaman genus dan spesies (nilai p untuk genus: 0,18, nilai p untuk spesies: 0,16) (Gambar 1). Komposisi mikroba kemudian dibandingkan menggunakan analisis komponen utama (PCA). Gambar 2 menunjukkan pengelompokan sampel berdasarkan filumnya, yang menunjukkan bahwa terdapat perbedaan komposisi spesies mikrobioma antara sampel PPA dan kontrol. Pengelompokan ini kurang jelas pada tingkat genus, menunjukkan bahwa PPA memengaruhi bakteri tertentu (Gambar Tambahan 1).
Gambar 1. Keragaman alfa genus dan komposisi spesies mikrobioma usus tikus. Plot kotak menunjukkan indeks keragaman Simpson genus (A) dan spesies (B) pada sampel PPA dan kontrol. Signifikansi ditentukan menggunakan uji Mann-Whitney U, dan koreksi berganda dilakukan menggunakan prosedur Benjamini-Hochberg. ns, nilai p tidak signifikan (p>0,05).
Gambar 2. Hasil analisis komponen utama komposisi mikrobioma usus tikus pada tingkat spesies. Plot analisis komponen utama menampilkan distribusi sampel di seluruh dua komponen utama pertama mereka. Warna menunjukkan jenis sampel: tikus yang terpapar PPA berwarna ungu dan tikus kontrol berwarna kuning. Komponen utama 1 dan 2 diplot pada sumbu x dan sumbu y, masing-masing, dan dinyatakan sebagai rasio varians yang dijelaskan.
Dengan menggunakan data hitungan yang ditransformasikan RLE, penurunan signifikan pada rasio Bacteroidetes/Bacilli median diamati pada tikus kontrol dan PPA (kontrol: 9,66, PPA: 3,02; nilai p = 0,0011). Perbedaan ini disebabkan oleh kelimpahan Bacteroidetes yang lebih tinggi pada tikus PPA dibandingkan dengan kontrol, meskipun perbedaannya tidak signifikan (rata-rata CLR kontrol: 5,51, rata-rata CLR PPA: 6,62; nilai p = 0,054), sementara kelimpahan Bacteroidetes serupa (rata-rata CLR kontrol: 7,76, rata-rata CLR PPA: 7,60; nilai p = 0,18).
Analisis kelimpahan anggota taksonomi mikrobioma usus mengungkapkan bahwa 1 filum dan 77 spesies berbeda secara signifikan antara sampel PPA dan kontrol (Tabel Tambahan 2). Kelimpahan 59 spesies dalam sampel PPA secara signifikan lebih tinggi daripada dalam sampel kontrol, sedangkan kelimpahan hanya 16 spesies dalam sampel kontrol lebih tinggi daripada dalam sampel PPA (Gambar 3).
Gambar 3. Perbedaan kelimpahan taksa dalam mikrobioma usus tikus PPA dan kontrol. Plot gunung berapi menampilkan perbedaan kelimpahan genus (A) atau spesies (B) antara sampel PPA dan kontrol. Titik abu-abu menunjukkan tidak ada perbedaan signifikan dalam kelimpahan taksa. Titik berwarna menunjukkan perbedaan signifikan dalam kelimpahan (nilai p ≤ 0,05). 20 taksa teratas dengan perbedaan kelimpahan terbesar antara jenis sampel ditunjukkan dengan warna merah dan biru muda (sampel kontrol dan PPA), masing-masing. Titik kuning dan ungu setidaknya 2,7 kali lebih melimpah pada sampel kontrol atau PPA daripada pada kontrol. Titik hitam mewakili taksa dengan kelimpahan yang berbeda secara signifikan, dengan perbedaan CLR rata-rata antara -1 dan 1. Nilai p dihitung menggunakan uji Mann-Whitney U dan dikoreksi untuk pengujian berganda menggunakan prosedur Benjamini-Hochberg. Perbedaan CLR rata-rata yang dicetak tebal menunjukkan perbedaan kelimpahan yang signifikan.
Setelah menganalisis komposisi mikrobiota usus, kami melakukan anotasi fungsional mikrobioma. Setelah menyaring gen berkualitas rendah, total 378.355 gen unik diidentifikasi di seluruh sampel. Kelimpahan gen yang telah ditransformasi ini digunakan untuk analisis komponen utama (PCA), dan hasilnya menunjukkan tingkat pengelompokan tipe sampel yang tinggi berdasarkan profil fungsionalnya (Gambar 4).
Gambar 4. Hasil PCA menggunakan profil fungsional mikrobioma usus tikus. Plot PCA menampilkan distribusi sampel di seluruh dua komponen utama pertama mereka. Warna menunjukkan jenis sampel: tikus yang terpapar PPA berwarna ungu dan tikus kontrol berwarna kuning. Komponen utama 1 dan 2 diplot pada sumbu x dan sumbu y, masing-masing, dan dinyatakan sebagai rasio varians yang dijelaskan.
Selanjutnya, kami memeriksa kelimpahan knockout KEGG pada berbagai jenis sampel. Sebanyak 3648 knockout unik diidentifikasi, di mana 196 di antaranya secara signifikan lebih melimpah pada sampel kontrol dan 106 lebih melimpah pada sampel PPA (Gambar 5). Sebanyak 145 gen terdeteksi pada sampel kontrol dan 61 gen pada sampel PPA, dengan kelimpahan yang berbeda secara signifikan. Jalur yang terkait dengan metabolisme lipid dan aminosugar secara signifikan lebih banyak ditemukan pada sampel PPA (Tabel Tambahan 3). Jalur yang terkait dengan metabolisme nitrogen dan sistem relai sulfur secara signifikan lebih banyak ditemukan pada sampel kontrol (Tabel Tambahan 3). Kelimpahan gen yang terkait dengan metabolisme aminosugar/nukleotida (ko:K21279) dan metabolisme inositol fosfat (ko:K07291) secara signifikan lebih tinggi pada sampel PPA (Gambar 5). Sampel kontrol memiliki gen yang terkait dengan metabolisme benzoat (ko:K22270), metabolisme nitrogen (ko:K00368), dan glikolisis/glukoneogenesis (ko:K00131) secara signifikan lebih banyak (Gambar 5).
Gambar 5. Perbedaan kelimpahan KO dalam mikrobioma usus tikus PPA dan kontrol. Plot gunung berapi menggambarkan perbedaan kelimpahan kelompok fungsional (KO). Titik abu-abu menunjukkan KO yang kelimpahannya tidak berbeda secara signifikan antara jenis sampel (nilai p > 0,05). Titik berwarna menunjukkan perbedaan kelimpahan yang signifikan (nilai p ≤ 0,05). 20 KO dengan perbedaan kelimpahan terbesar antara jenis sampel ditunjukkan dengan warna merah dan biru muda, yang masing-masing sesuai dengan sampel kontrol dan PPA. Titik kuning dan ungu menunjukkan KO yang setidaknya 2,7 kali lebih melimpah pada sampel kontrol dan PPA. Titik hitam menunjukkan KO dengan kelimpahan yang berbeda secara signifikan, dengan perbedaan CLR rata-rata antara -1 dan 1. Nilai p dihitung menggunakan uji Mann-Whitney U dan disesuaikan untuk perbandingan berganda menggunakan prosedur Benjamini-Hochberg. NaN menunjukkan bahwa KO tidak termasuk dalam jalur di KEGG. Nilai perbedaan CLR yang dicetak tebal menunjukkan perbedaan kelimpahan yang signifikan. Untuk informasi detail tentang jalur yang terkait dengan KO yang tercantum, lihat Tabel Tambahan 3.
Di antara gen yang dianotasi, 1601 gen memiliki kelimpahan yang berbeda secara signifikan antara jenis sampel (p ≤ 0,05), dengan setiap gen setidaknya 2,7 kali lebih melimpah. Dari gen-gen ini, 4 gen lebih melimpah pada sampel kontrol dan 1597 gen lebih melimpah pada sampel PPA. Karena PPA memiliki sifat antimikroba, kami memeriksa kelimpahan gen metabolisme dan produksi PPA antara jenis sampel. Di antara 1332 gen yang terkait dengan metabolisme PPA, 27 gen secara signifikan lebih melimpah pada sampel kontrol dan 12 gen lebih melimpah pada sampel PPA. Di antara 223 gen yang terkait dengan produksi PPA, 1 gen secara signifikan lebih melimpah pada sampel PPA. Gambar 6A lebih lanjut menunjukkan kelimpahan gen yang terlibat dalam metabolisme PPA yang lebih tinggi, dengan kelimpahan yang secara signifikan lebih tinggi pada sampel kontrol dan ukuran efek yang besar, sementara Gambar 6B menyoroti gen individual dengan kelimpahan yang secara signifikan lebih tinggi yang diamati pada sampel PPA.
Gambar 6. Perbedaan kelimpahan gen terkait PPA dalam mikrobioma usus tikus. Plot gunung berapi menggambarkan perbedaan kelimpahan gen yang terkait dengan metabolisme PPA (A) dan produksi PPA (B). Titik abu-abu menunjukkan gen yang kelimpahannya tidak berbeda secara signifikan antara jenis sampel (nilai p > 0,05). Titik berwarna menunjukkan perbedaan kelimpahan yang signifikan (nilai p ≤ 0,05). 20 gen dengan perbedaan kelimpahan terbesar ditunjukkan dengan warna merah dan biru muda (sampel kontrol dan PPA), masing-masing. Kelimpahan titik kuning dan ungu setidaknya 2,7 kali lebih besar pada sampel kontrol dan PPA daripada pada sampel kontrol. Titik hitam mewakili gen dengan kelimpahan yang berbeda secara signifikan, dengan perbedaan CLR rata-rata antara -1 dan 1. Nilai p dihitung menggunakan uji Mann-Whitney U dan dikoreksi untuk perbandingan berganda menggunakan prosedur Benjamini-Hochberg. Gen sesuai dengan gen representatif dalam katalog gen non-redundan. Nama gen terdiri dari simbol KEGG yang menunjukkan gen KO. Huruf tebal berarti perbedaan CLR menunjukkan kelimpahan yang berbeda secara signifikan. Tanda hubung (-) menunjukkan bahwa tidak ada simbol untuk gen tersebut dalam basis data KEGG.
Taksa dengan gen yang terkait dengan metabolisme dan/atau produksi PPA diidentifikasi dengan mencocokkan identitas taksonomi kontig dengan ID kontig gen tersebut. Pada tingkat genus, ditemukan 130 genus yang memiliki gen terkait dengan metabolisme PPA dan 61 genus yang memiliki gen terkait dengan produksi PPA (Tabel Tambahan 4). Namun, tidak ada genus yang menunjukkan perbedaan kelimpahan yang signifikan (p > 0,05).
Pada tingkat spesies, ditemukan 144 spesies bakteri yang memiliki gen yang terkait dengan metabolisme PPA dan 68 spesies bakteri yang memiliki gen yang terkait dengan produksi PPA (Tabel Tambahan 5). Di antara bakteri pengmetabolisme PPA, delapan bakteri menunjukkan peningkatan kelimpahan yang signifikan antara jenis sampel, dan semuanya menunjukkan perubahan efek yang signifikan (Tabel Tambahan 6). Semua bakteri pengmetabolisme PPA yang teridentifikasi dengan perbedaan kelimpahan yang signifikan lebih melimpah pada sampel PPA. Klasifikasi tingkat spesies mengungkapkan perwakilan genus yang tidak berbeda secara signifikan antara jenis sampel, termasuk beberapa spesies Bacteroides dan Ruminococcus, serta Duncania dubois, Myxobacterium enterica, Monococcus pectinolyticus, dan Alcaligenes polymorpha. Di antara bakteri penghasil PPA, empat bakteri menunjukkan perbedaan kelimpahan yang signifikan antara jenis sampel. Spesies dengan perbedaan kelimpahan yang signifikan termasuk Bacteroides novorossi, Duncania dubois, Myxobacterium enteritidis, dan Ruminococcus bovis.
Dalam penelitian ini, kami meneliti efek paparan PPA pada mikrobiota usus tikus. PPA dapat memicu respons yang berbeda pada bakteri karena diproduksi oleh spesies tertentu, digunakan sebagai sumber makanan oleh spesies lain, atau memiliki efek antimikroba. Oleh karena itu, penambahannya ke lingkungan usus melalui suplemen makanan dapat memiliki efek yang berbeda tergantung pada toleransi, kerentanan, dan kemampuan untuk memanfaatkannya sebagai sumber nutrisi. Spesies bakteri yang sensitif dapat dieliminasi dan digantikan oleh spesies yang lebih resisten terhadap PPA atau mampu memanfaatkannya sebagai sumber makanan, yang menyebabkan perubahan komposisi mikrobiota usus. Hasil kami menunjukkan perbedaan signifikan dalam komposisi mikroba tetapi tidak ada efek pada keanekaragaman mikroba secara keseluruhan. Efek terbesar diamati pada tingkat spesies, dengan lebih dari 70 taksa yang berbeda secara signifikan dalam kelimpahan antara sampel PPA dan kontrol (Tabel Tambahan 2). Evaluasi lebih lanjut terhadap komposisi sampel yang terpapar PPA mengungkapkan heterogenitas spesies mikroba yang lebih besar dibandingkan dengan sampel yang tidak terpapar, menunjukkan bahwa PPA dapat meningkatkan karakteristik pertumbuhan bakteri dan membatasi populasi bakteri yang dapat bertahan hidup di lingkungan yang kaya PPA. Dengan demikian, PPA mungkin secara selektif menginduksi perubahan daripada menyebabkan gangguan luas pada keanekaragaman mikrobiota usus.
Pengawet makanan seperti PPA sebelumnya telah terbukti mengubah kelimpahan komponen mikrobioma usus tanpa memengaruhi keanekaragaman secara keseluruhan (Nagpal et al., 2021). Di sini, kami mengamati perbedaan yang paling mencolok antara spesies Bacteroidetes dalam filum Bacteroidetes (sebelumnya dikenal sebagai Bacteroidetes), yang secara signifikan diperkaya pada tikus yang terpapar PPA. Peningkatan kelimpahan spesies Bacteroides dikaitkan dengan peningkatan degradasi lendir, yang dapat meningkatkan risiko infeksi dan memicu peradangan (Cornick et al., 2015; Desai et al., 2016; Penzol et al., 2019). Sebuah studi menemukan bahwa tikus jantan neonatal yang diobati dengan Bacteroides fragilis menunjukkan perilaku sosial yang menyerupai gangguan spektrum autisme (ASD) (Carmel et al., 2023), dan studi lain menunjukkan bahwa spesies Bacteroides dapat mengubah aktivitas imun dan menyebabkan kardiomiopati inflamasi autoimun (Gil-Cruz et al., 2019). Spesies yang termasuk dalam genus Ruminococcus, Prevotella, dan Parabacteroides juga meningkat secara signifikan pada tikus yang terpapar PPA (Coretti et al., 2018). Spesies Ruminococcus tertentu dikaitkan dengan penyakit seperti penyakit Crohn melalui produksi sitokin proinflamasi (Henke et al., 2019), sementara spesies Prevotella seperti Prevotella humani dikaitkan dengan penyakit metabolik seperti hipertensi dan sensitivitas insulin (Pedersen et al., 2016; Li et al., 2017). Terakhir, kami menemukan bahwa rasio Bacteroidetes (sebelumnya dikenal sebagai Firmicutes) terhadap Bacteroidetes secara signifikan lebih rendah pada tikus yang terpapar PPA dibandingkan pada tikus kontrol karena kelimpahan total spesies Bacteroidetes yang lebih tinggi. Rasio ini sebelumnya telah terbukti sebagai indikator penting homeostasis usus, dan gangguan pada rasio ini telah dikaitkan dengan berbagai kondisi penyakit (Turpin et al., 2016; Takezawa et al., 2021; An et al., 2023), termasuk penyakit radang usus (Stojanov et al., 2020). Secara kolektif, spesies dari filum Bacteroidetes tampaknya paling terpengaruh oleh peningkatan PPA dalam makanan. Hal ini mungkin disebabkan oleh toleransi yang lebih tinggi terhadap PPA atau kemampuan untuk menggunakan PPA sebagai sumber energi, yang telah terbukti benar setidaknya untuk satu spesies, Hoylesella enocea (Hitch et al., 2022). Alternatifnya, paparan PPA pada ibu dapat meningkatkan perkembangan janin dengan membuat usus anak tikus lebih rentan terhadap kolonisasi Bacteroidetes; namun, desain penelitian kami tidak memungkinkan penilaian tersebut.
Penilaian kandungan metagenomik mengungkapkan perbedaan signifikan dalam kelimpahan gen yang terkait dengan metabolisme dan produksi PPA, dengan tikus yang terpapar PPA menunjukkan kelimpahan gen yang lebih tinggi yang bertanggung jawab untuk produksi PPA, sedangkan tikus yang tidak terpapar PPA menunjukkan kelimpahan gen yang lebih tinggi yang bertanggung jawab untuk metabolisme PAA (Gambar 6). Hasil ini menunjukkan bahwa efek PPA pada komposisi mikroba mungkin bukan semata-mata karena penggunaannya, jika tidak, kelimpahan gen yang terkait dengan metabolisme PPA seharusnya menunjukkan kelimpahan yang lebih tinggi dalam mikrobioma usus tikus yang terpapar PPA. Salah satu penjelasannya adalah bahwa PPA memediasi kelimpahan bakteri terutama melalui efek antimikrobanya daripada melalui penggunaannya oleh bakteri sebagai nutrisi. Studi sebelumnya telah menunjukkan bahwa PPA menghambat pertumbuhan Salmonella Typhimurium secara bergantung pada dosis (Jacobson dkk., 2018). Paparan konsentrasi PPA yang lebih tinggi dapat menyeleksi bakteri yang resisten terhadap sifat antimikrobanya dan mungkin tidak selalu mampu memetabolisme atau memproduksinya. Misalnya, beberapa spesies Parabacteroides menunjukkan kelimpahan yang jauh lebih tinggi pada sampel PPA, tetapi tidak ada gen yang terkait dengan metabolisme atau produksi PPA yang terdeteksi (Tabel Tambahan 2, 4, dan 5). Lebih lanjut, produksi PPA sebagai produk sampingan fermentasi tersebar luas di antara berbagai bakteri (Gonzalez-Garcia et al., 2017). Keragaman bakteri yang lebih tinggi mungkin menjadi alasan kelimpahan gen yang terkait dengan metabolisme PPA yang lebih tinggi pada sampel kontrol (Averina et al., 2020). Selain itu, hanya 27 (2,14%) dari 1332 gen yang diprediksi sebagai gen yang terkait secara eksklusif dengan metabolisme PPA. Banyak gen yang terkait dengan metabolisme PPA juga terlibat dalam jalur metabolisme lainnya. Hal ini lebih lanjut menunjukkan bahwa kelimpahan gen yang terlibat dalam metabolisme PPA lebih tinggi pada sampel kontrol; gen-gen ini mungkin berfungsi dalam jalur yang tidak menghasilkan pemanfaatan atau pembentukan PPA sebagai produk sampingan. Dalam hal ini, hanya satu gen yang terkait dengan pembentukan PPA yang menunjukkan perbedaan kelimpahan yang signifikan antara jenis sampel. Berbeda dengan gen yang terkait dengan metabolisme PPA, gen penanda untuk produksi PPA dipilih karena gen tersebut secara langsung terlibat dalam jalur bakteri untuk produksi PPA. Pada tikus yang terpapar PPA, semua spesies ditemukan memiliki peningkatan kelimpahan dan kapasitas yang signifikan untuk memproduksi PPA. Hal ini mendukung prediksi bahwa PPA akan menyeleksi produsen PPA dan oleh karena itu memprediksi bahwa kapasitas produksi PPA akan meningkat. Namun, kelimpahan gen tidak selalu berkorelasi dengan ekspresi gen; dengan demikian, meskipun kelimpahan gen yang terkait dengan metabolisme PPA lebih tinggi pada sampel kontrol, tingkat ekspresinya mungkin berbeda (Shi et al., 2014). Untuk mengkonfirmasi hubungan antara prevalensi gen penghasil PPA dan produksi PPA, diperlukan studi tentang ekspresi gen yang terlibat dalam produksi PPA.
Anotasi fungsional metagenom PPA dan kontrol mengungkapkan beberapa perbedaan. Analisis PCA dari kandungan gen mengungkapkan kelompok-kelompok diskrit antara sampel PPA dan kontrol (Gambar 5). Pengelompokan dalam sampel mengungkapkan bahwa kandungan gen kontrol lebih beragam, sementara sampel PPA berkelompok bersama. Pengelompokan berdasarkan kandungan gen sebanding dengan pengelompokan berdasarkan komposisi spesies. Dengan demikian, perbedaan kelimpahan jalur konsisten dengan perubahan kelimpahan spesies dan strain spesifik di dalamnya. Pada sampel PPA, dua jalur dengan kelimpahan yang secara signifikan lebih tinggi terkait dengan metabolisme aminosugar/gula nukleotida (ko:K21279) dan beberapa jalur metabolisme lipid (ko:K00647, ko:K03801; Tabel Tambahan 3). Gen yang terkait dengan ko:K21279 diketahui terkait dengan genus Bacteroides, salah satu genus dengan jumlah spesies yang secara signifikan lebih tinggi pada sampel PPA. Enzim ini dapat menghindari respons imun dengan mengekspresikan polisakarida kapsular (Wang dkk., 2008). Hal ini mungkin menjelaskan peningkatan Bacteroidetes yang diamati pada tikus yang terpapar PPA. Ini melengkapi peningkatan sintesis asam lemak yang diamati pada mikrobioma PPA. Bakteri menggunakan jalur FASIIko:K00647 (fabB) untuk menghasilkan asam lemak, yang dapat memengaruhi jalur metabolisme inang (Yao dan Rock, 2015; Johnson dkk., 2020), dan perubahan metabolisme lipid dapat berperan dalam perkembangan saraf (Yu dkk., 2020). Jalur lain yang menunjukkan peningkatan kelimpahan dalam sampel PPA adalah biosintesis hormon steroid (ko:K12343). Terdapat bukti yang semakin banyak bahwa ada hubungan terbalik antara kemampuan mikrobiota usus untuk memengaruhi kadar hormon dan dipengaruhi oleh hormon, sehingga peningkatan kadar steroid dapat memiliki konsekuensi kesehatan selanjutnya (Tetel dkk., 2018).
Studi ini tidak lepas dari keterbatasan dan pertimbangan. Perbedaan penting adalah bahwa kami tidak melakukan penilaian fisiologis pada hewan. Oleh karena itu, tidak mungkin untuk secara langsung menyimpulkan apakah perubahan mikrobioma berhubungan dengan penyakit apa pun. Pertimbangan lain adalah bahwa tikus dalam penelitian ini diberi makan makanan yang sama dengan induknya. Studi di masa mendatang dapat menentukan apakah peralihan dari diet kaya PPA ke diet bebas PPA meningkatkan efeknya pada mikrobioma. Salah satu keterbatasan penelitian kami, seperti banyak penelitian lainnya, adalah ukuran sampel yang terbatas. Meskipun kesimpulan yang valid dapat ditarik, ukuran sampel yang lebih besar akan memberikan kekuatan statistik yang lebih besar saat menganalisis hasilnya. Kami juga berhati-hati dalam menarik kesimpulan tentang hubungan antara perubahan mikrobioma usus dan penyakit apa pun (Yap dkk., 2021). Faktor-faktor pengganggu termasuk usia, jenis kelamin, dan diet dapat secara signifikan memengaruhi komposisi mikroorganisme. Faktor-faktor ini dapat menjelaskan inkonsistensi yang diamati dalam literatur mengenai hubungan mikrobioma usus dengan penyakit kompleks (Johnson dkk., 2019; Lagod dan Naser, 2023). Sebagai contoh, anggota genus Bacteroidetes telah terbukti mengalami peningkatan atau penurunan pada hewan dan manusia dengan ASD (Angelis et al., 2013; Kushak et al., 2017). Demikian pula, studi komposisi usus pada pasien dengan penyakit radang usus telah menemukan peningkatan dan penurunan pada taksa yang sama (Walters et al., 2014; Forbes et al., 2018; Upadhyay et al., 2023). Untuk membatasi dampak bias gender, kami mencoba memastikan representasi yang setara antara kedua jenis kelamin sehingga perbedaan tersebut kemungkinan besar disebabkan oleh diet. Salah satu tantangan anotasi fungsional adalah penghapusan sekuens gen yang berlebihan. Metode pengelompokan gen kami membutuhkan identitas sekuens 95% dan kemiripan panjang 85%, serta cakupan penyelarasan 90% untuk menghilangkan pengelompokan palsu. Namun, dalam beberapa kasus, kami mengamati COG dengan anotasi yang sama (misalnya, MUT) (Gambar 6). Studi lebih lanjut diperlukan untuk menentukan apakah ortolog-ortolog ini berbeda, terkait dengan genus tertentu, atau apakah ini merupakan keterbatasan dari pendekatan pengelompokan gen. Keterbatasan lain dari anotasi fungsional adalah potensi kesalahan klasifikasi; gen bakteri mmdA adalah enzim yang diketahui terlibat dalam sintesis propionat, tetapi KEGG tidak mengaitkannya dengan jalur metabolisme propionat. Sebaliknya, ortolog scpB dan mmcD terkait. Sejumlah besar gen tanpa penonaktifan yang ditentukan dapat mengakibatkan ketidakmampuan untuk mengidentifikasi gen terkait PPA ketika menilai kelimpahan gen. Studi di masa mendatang akan mendapat manfaat dari analisis metatranskriptom, yang dapat memberikan pemahaman yang lebih dalam tentang karakteristik fungsional mikrobiota usus dan menghubungkan ekspresi gen dengan potensi efek hilir. Untuk studi yang melibatkan gangguan perkembangan saraf spesifik atau penyakit radang usus, penilaian fisiologis dan perilaku hewan diperlukan untuk menghubungkan perubahan komposisi mikrobioma dengan gangguan ini. Studi tambahan yang mentransplantasikan mikrobioma usus ke tikus bebas kuman juga akan berguna untuk menentukan apakah mikrobioma merupakan pendorong atau karakteristik penyakit.
Singkatnya, kami menunjukkan bahwa PPA dalam makanan berperan sebagai faktor yang mengubah komposisi mikrobiota usus. PPA adalah pengawet yang disetujui FDA dan banyak ditemukan dalam berbagai makanan yang, jika terpapar dalam jangka panjang, dapat menyebabkan gangguan flora usus normal. Kami menemukan perubahan dalam kelimpahan beberapa bakteri, yang menunjukkan bahwa PPA dapat memengaruhi komposisi mikrobiota usus. Perubahan pada mikrobiota dapat menyebabkan perubahan pada tingkat jalur metabolisme tertentu, yang dapat menyebabkan perubahan fisiologis yang relevan dengan kesehatan inang. Studi lebih lanjut diperlukan untuk menentukan apakah efek PPA dalam makanan terhadap komposisi mikroba dapat menyebabkan disbiosis atau penyakit lainnya. Studi ini meletakkan dasar untuk studi masa depan tentang bagaimana efek PPA pada komposisi usus dapat berdampak pada kesehatan manusia.
Kumpulan data yang disajikan dalam penelitian ini tersedia di repositori daring. Nama repositori dan nomor aksesnya adalah: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1092431.
Penelitian pada hewan ini telah disetujui oleh Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan Institusional Universitas Central Florida (UCF-IACUC) (Nomor Izin Penggunaan Hewan: PROTO202000002). Penelitian ini mematuhi hukum, peraturan, dan persyaratan institusional setempat.
NG: Konseptualisasi, Kurasi data, Analisis formal, Investigasi, Metodologi, Perangkat lunak, Visualisasi, Penulisan (draf asli), Penulisan (ulasan & penyuntingan). LA: Konseptualisasi, Kurasi data, Metodologi, Sumber daya, Penulisan (ulasan & penyuntingan). SH: Analisis formal, Perangkat lunak, Penulisan (ulasan & penyuntingan). SA: Investigasi, Penulisan (ulasan & penyuntingan). Ketua Juri: Investigasi, Penulisan (ulasan & penyuntingan). SN: Konseptualisasi, Administrasi proyek, Sumber daya, Pengawasan, Penulisan (ulasan & penyuntingan). TA: Konseptualisasi, Administrasi proyek, Pengawasan, Penulisan (ulasan & penyuntingan).
Para penulis menyatakan bahwa mereka tidak menerima dukungan finansial apa pun untuk penelitian, penulisan, dan/atau publikasi artikel ini.
Para penulis menyatakan bahwa penelitian ini dilakukan tanpa adanya hubungan komersial atau keuangan apa pun yang dapat dianggap sebagai potensi konflik kepentingan. Tidak berlaku.
Semua opini yang dinyatakan dalam artikel ini sepenuhnya merupakan pendapat penulis dan tidak selalu mencerminkan pandangan lembaga, penerbit, editor, atau peninjau mereka. Produk apa pun yang dievaluasi dalam artikel ini, atau klaim apa pun yang dibuat oleh produsennya, tidak dijamin atau didukung oleh penerbit.
Materi tambahan untuk artikel ini dapat ditemukan secara online: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/frmbi.2024.1451735/full#supplementary-material
Abdelli LS, Samsam A, Nasser SA (2019). Asam propionat menginduksi gliosis dan neuroinflamasi dengan mengatur jalur PTEN/AKT pada gangguan spektrum autisme. Laporan ilmiah 9, 8824–8824. doi: 10.1038/s41598-019-45348-z
Aitchison, J. (1982). Analisis statistik data komposisi. JR Stat Soc Ser B Methodol. 44, 139–160. doi: 10.1111/j.2517-6161.1982.tb01195.x
Ahn J, Kwon H, Kim YJ (2023). Rasio Firmicutes/Bacteroidetes sebagai faktor risiko kanker payudara. Jurnal Kedokteran Klinis, 12, 2216. doi: 10.3390/jcm12062216
Anders S., Huber W. (2010). Analisis ekspresi diferensial data hitungan sekuens. Nat Prev. 1–1, 1–10. doi: 10.1038/npre.2010.4282.1
Angelis, MD, Piccolo, M., Vannini, L., Siragusa, S., Giacomo, AD, Serrazanetti, DI, dkk. (2013). Mikrobiota feses dan metabolom pada anak-anak dengan autisme dan gangguan perkembangan pervasif yang tidak ditentukan secara spesifik. PloS One 8, e76993. doi: 10.1371/journal.pone.0076993
Averina OV, Kovtun AS, Polyakova SI, Savilova AM, Rebrikov DV, Danilenko VN (2020). Karakteristik neurometabolik bakteri mikrobiota usus pada anak-anak kecil dengan gangguan spektrum autisme. Jurnal Mikrobiologi Medis 69, 558–571. doi: 10.1099/jmm.0.001178
Baquero F., Nombela K. (2012). Mikrobioma sebagai organ manusia. Mikrobiologi Klinis dan Infeksi 18, 2–4. doi: 10.1111/j.1469-0691.2012.03916.x
Baur T., Dürre P. (2023). Wawasan baru tentang fisiologi bakteri penghasil asam propionat: Anaerotignum propionicum dan Anaerotignum neopropionicum (sebelumnya Clostridium propionicum dan Clostridium neopropionicum). Mikroorganisme 11, 685. doi: 10.3390/microorganisms11030685
Bazer FW, Spencer TE, Wu G, Cudd TA, Meininger SJ (2004). Nutrisi ibu dan perkembangan janin. J Nutrisi. 134, 2169–2172. doi: 10.1093/jn/134.9.2169
Benjamini, Y., dan Hochberg, J. (1995). Mengendalikan tingkat positif palsu: Pendekatan praktis dan efisien untuk pengujian berganda. JR Stat Soc Ser B Methodol. 57, 289–300. doi: 10.1111/j.2517-6161.1995.tb02031.x
Waktu posting: 18 April 2025