Terima kasih telah mengunjungi Nature.com. Versi peramban yang Anda gunakan memiliki dukungan terbatas untuk CSS. Untuk pengalaman terbaik, kami sarankan Anda menggunakan peramban yang diperbarui (atau matikan mode kompatibilitas di Internet Explorer). Sementara itu, untuk memastikan dukungan berkelanjutan, kami akan menampilkan situs tanpa gaya dan JavaScript.
Tidak seperti vertebrata, serangga secara umum dianggap tidak memiliki hormon steroid seks yang didominasi jantan. Pada Anopheles gambiae, steroid ekdison 20-hidroksiekdison (20E) tampaknya telah berevolusi untuk mengontrol perkembangan telur ketika disintesis oleh betina² dan untuk menginduksi periode refraktori perkawinan ketika ditransfer secara seksual oleh jantan³. Karena perkembangan telur dan perkawinan merupakan sifat reproduksi yang penting, memahami bagaimana nyamuk Anopheles betina mengintegrasikan sinyal hormonal ini dapat memfasilitasi desain program pengendalian malaria baru. Di sini, kami mengungkapkan bahwa fungsi reproduksi ini diatur oleh steroid seks yang berbeda melalui jaringan kompleks enzim pengaktif/penonaktif ekdisteroid. Kami mengidentifikasi ekdison teroksidasi spesifik jantan, 3-dehidro-20E (3D20E), yang melindungi keturunan dengan mematikan penerimaan seksual betina setelah transfer seksual dan aktivasi melalui defosforilasi. Yang penting, transfer 3D20E juga menginduksi ekspresi gen reproduksi yang mempertahankan perkembangan telur selama infeksi Plasmodium, memastikan kesehatan individu yang terinfeksi. Hormon 20E yang berasal dari betina tidak memicu respons seksual, tetapi memungkinkan individu yang kawin untuk bertelur setelah kinase penghambat 20E dihambat. Identifikasi hormon steroid serangga spesifik jantan ini dan perannya dalam mengatur penerimaan seksual betina, kesuburan, dan interaksi dengan Plasmodium menunjukkan potensi untuk mengurangi keberhasilan reproduksi nyamuk pembawa malaria.
Kasus dan kematian akibat malaria kembali meningkat4 karena resistensi insektisida yang meluas pada nyamuk Anopheles, satu-satunya vektor parasit malaria pada manusia. Biologi perkawinan nyamuk ini merupakan target yang sangat menarik untuk intervensi pengendalian malaria yang baru karena nyamuk betina hanya kawin sekali5; menjadikan peristiwa perkawinan tunggal ini steril berpotensi besar untuk mengurangi populasi nyamuk di lapangan.
Wanita menjadi tidak mampu secara seksual setelah menerima hormon steroid titer tinggi dari pria. Studi telah menunjukkan bahwa pemicu kesulitan dalam perkawinan lebih lanjut adalah 20-hidroksiekdison (20E), hormon steroid yang lebih dikenal sebagai pengatur siklus pergantian kulit pada tahap larva. Kemampuan jantan untuk mensintesis dan mentransfer 20E telah berevolusi secara khusus pada spesies Anopheles yang merupakan bagian dari subgenus Cellia7, yang tersebar di Afrika dan mencakup vektor malaria paling berbahaya, termasuk Anopheles gambiae. Hal ini sangat penting karena pada spesies ini betina juga menghasilkan 20E setelah setiap kali menghisap darah, dan 20E mendorong siklus oogenesis (lihat ref. 8). Namun, sedikit yang diketahui tentang cara betina mengintegrasikan sinyal dari dua sumber ekdison yang berbeda (transfer jantan dan induksi penghisapan darah) tanpa mengganggu kemampuan mereka sendiri untuk kawin. Bahkan, jika 20E yang diproduksi oleh betina memicu intoleransi seksual, ini akan menyebabkan infertilitas pada individu yang belum pernah berhubungan seksual sebelumnya. perilaku yang sangat umum pada nyamuk-nyamuk ini5.
Salah satu kemungkinan penjelasannya adalah bahwa jantan A. gambiae mentransfer ekdison spesifik jantan yang telah dimodifikasi, yang mengaktifkan kaskade sinyal di saluran reproduksi betina, sehingga menyebabkan ketidakstabilan perkawinan. Namun, meskipun vertebrata memiliki banyak hormon steroid, seperti estrogen dan androgen (diulas dalam ref. 9), sepengetahuan kami, steroid yang cenderung androgenik belum diidentifikasi pada serangga.
Kami berupaya menentukan repertoar hormon steroid di kelenjar aksesori jantan (MAG) A. gambiae yang sudah dewasa secara seksual untuk mencari kemungkinan steroid pengubah. Dengan menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi yang digabungkan dengan spektrometri massa tandem (HPLC-MS/MS) daripada metode yang kurang spesifik yang digunakan sebelumnya, kami mendeteksi ekdison (E) dan 20E dalam jaringan ini, yang mengkonfirmasi hasil sebelumnya. Namun, sampel didominasi oleh steroid terfosforilasi teroksidasi, sesuai dengan rumus 3-dehidro-20E-22-fosfat (3D20E22P)12 (Gambar 1). Bentuk lain termasuk 3-dehidro-20E (3D20E) dan 20E-22-fosfat (20E22P). Intensitas sinyal HPLC-MS/MS dari 3D20E22P dua orde magnitudo lebih tinggi daripada bentuk defosforilasinya, 3D20E, dan tiga orde magnitudo lebih tinggi daripada E dan 20E. (Gambar 1). Meskipun di bagian tubuh lain dan saluran reproduksi bagian bawah (LRT; Gambar Data Tambahan 1a). Kami juga menganalisis ekdisteroid pada jantan dan betina yang baru tertutup (<1 hari) dan mendeteksi 3D20E dan 3D20E22P hanya di MAG; E, 20E dan 20E22P hadir pada kedua jenis kelamin (Gambar Data Tambahan 1b). Data ini menunjukkan bahwa jantan dewasa A. gambiae menghasilkan titer hormon pengubah yang tinggi di MAG mereka yang tidak disintesis oleh betina.
MAG dan LRT betina (termasuk atrium, vesikula seminalis, dan parovarium) dibedah dari jantan perawan berumur 4 hari (4 hari) dan betina perawan dan yang telah kawin (0,5, 3, dan 12 jam pasca kawin). Ecdysone dalam jaringan ini dianalisis dengan HPLC-MS/MS (rata-rata ± sem; uji t tidak berpasangan, dua sisi, dikoreksi dengan false discovery rate (FDR); NS, tidak signifikan; *P < 0,05, **P < 0,01). 3D20E: 3 jam vs. 0,5 jam, P = 0,035; 12 jam vs. 3 jam, P = 0,0015; 12 jam vs. 0,5 jam, P = 0,030. 3D20E22P: 3 jam vs. 0,5 jam, P = 0,25; 12 jam vs. 3 jam jam, P = 0,0032; 12 jam vs. 0,5 jam, P = 0,015). Data berasal dari tiga replikasi biologis. Luas puncak untuk setiap ekdison yang diteliti dihitung dan dinormalisasi berdasarkan jumlah nyamuk. Ekdison direpresentasikan oleh warna sebagai berikut: E, hijau; 20E, oranye; 20E22P, ungu; 3D20E, biru; 3D20E22P, merah muda. Sisipan meningkatkan skala pada sumbu y untuk menunjukkan tingkat ekdison yang lebih rendah.
Untuk menyelidiki apakah 3D20E22P dan 3D20E ditransfer selama perkawinan, kami membedah LRT betina pada berbagai titik waktu setelah perkawinan. Meskipun ekdison tidak ditemukan pada betina perawan, kami mengamati sejumlah besar 3D20E22P di LRT segera setelah perkawinan (0,5 jam setelah perkawinan, hpm), yang menurun seiring waktu, sementara kadar 3D20E meningkat secara signifikan (Gambar 1). Dengan menggunakan 3D20E yang disintesis secara kimia sebagai standar, kami menentukan bahwa kadar hormon steroid ini di LRT perkawinan setidaknya 100 kali lebih tinggi daripada 20E (Tabel Data Tambahan 1). Dengan demikian, 3D20E22P adalah ekdison jantan utama yang ditransfer ke LRT betina selama perkawinan, dan bentuknya yang terde fosforilasi, 3D20E, menjadi sangat melimpah segera setelah perkawinan. Ini menunjukkan peran penting ekdison yang terakhir dalam biologi pasca-perkawinan betina.
Setelah menghasilkan dataset pengurutan RNA (RNA-seq) baru (Gambar 2a), menggunakan pipeline bioinformatika yang dibuat khusus, kami mencari gen ecdysone kinase (EcK), ecdysone oxidase (EO), dan gen ecdysone encoding 20E-modified phosphatase (EPP) yang diekspresikan dalam jaringan reproduksi. Kami mengidentifikasi satu gen EPP kandidat dan dua gen EcK potensial (EcK1 dan EcK2), tetapi tidak dapat menemukan gen EO kandidat yang baik. Perlu dicatat, gen EPP individu diekspresikan pada tingkat tinggi (persentil ke-98,9) di MAG Gambia tetapi tidak di LRT betina (Gambar 2b), bertentangan dengan harapan kami karena defosforilasi 3D20E22P terjadi di jaringan betina ini. Oleh karena itu, kami percaya bahwa EPP jantan dapat ditransfer selama perkawinan. Memang, kami menggunakan pelabelan isotop stabil in vivo untuk menutupi protein betina setelah perkawinan, enzim yang diidentifikasi oleh MS pada betina. atrium (Gambar 2c dan Tabel Tambahan 1). Keberadaan EPP pada MAG dan LRT betina yang telah kawin (tetapi bukan yang masih perawan) juga dikonfirmasi menggunakan antibodi spesifik (Gambar 2d).
a, Sebuah alur kerja bioinformatika yang dibuat khusus untuk mencari gen yang mengkode EcK, EO, dan EPP pada jaringan reproduksi masing-masing jenis kelamin. Angka di samping panah menunjukkan jumlah kandidat jantan dan betina pada setiap langkah. Analisis ini mengidentifikasi satu gen EPP (EPP) dan satu gen EcK (EcK1) yang diekspresikan pada jantan, dan satu gen EcK (EcK2) yang diekspresikan pada kedua jenis kelamin tetapi tidak menghasilkan gen kandidat EO. b, Peta panas yang membandingkan ekspresi gen kandidat pada jaringan Anopheles gambiae dan Anopheles albicans yang belum kawin (V) dan yang sedang kawin (M). Spca, fertilisasi; MAGs, kelenjar aksesori pada jantan; bagian tubuh lainnya, termasuk payudara, sayap, kaki, jaringan lemak, dan organ dalam pada kedua jenis kelamin, dan ovarium pada betina. EcK2 diekspresikan secara tinggi di MAG dan atrium Gambia, sedangkan EPP hanya ditemukan di MAG. c, Analisis proteomik translokasi kelompok ejakulasi jantan ke atrium betina pada 3, 12 dan 24 hpm, menunjukkan 67 protein yang paling melimpah. Betina dibesarkan dengan diet yang mengandung 15N untuk memberi label (dan menutupi) semua protein. Jantan tanpa label dikawinkan dengan betina berlabel, dan LRT betina dibedah pada 3, 12 dan 24 hpm untuk analisis proteomik (lihat Tabel Tambahan 1 untuk daftar lengkap protein ejakulasi). Sisipan, EPP, Eck1 dan EcK2 terdeteksi di MAG jantan perawan melalui analisis proteomik jaringan ini. d, EPP terdeteksi dengan western blot di MAG dan LRT betina yang telah kawin, tetapi tidak di betina atau jantan perawan atau bagian tubuh betina lainnya. Membran secara bersamaan diperiksa dengan antibodi anti-aktin (kontrol pemuatan) dan anti-EPP. Semua jantan adalah perawan. Lihat Gambar Tambahan 1 untuk data sumber gel. Western blot dilakukan dua kali dengan hasil yang serupa.
Aktivitas ecdysteroid phosphophosphatase dari EPP diverifikasi setelah inkubasi dengan HPLC-MS/MS dengan 3D20E22P yang diisolasi dari MAG (Gambar Data Tambahan 2a). Selanjutnya, ketika kami menonaktifkan EPP dengan interferensi yang dimediasi RNA (RNAi), kami mendeteksi pengurangan yang kuat dalam aktivitas fosfatase di jaringan reproduksi jantan ini (Gambar 3a), dan betina yang dikawinkan dengan jantan yang EPP-nya dinonaktifkan menunjukkan proporsi 3D20E yang terdephosphorylasi secara signifikan lebih rendah (Gambar 3b) meskipun terjadi penonaktifan gen sebagian (Gambar Data Tambahan 2b,c). Sebaliknya, kami tidak mendeteksi perubahan signifikan dalam rasio 20E22P/20E pada nyamuk yang sama, yang mungkin menunjukkan bahwa enzim tersebut spesifik untuk 3D20E22P (Gambar 3b).
a, Penurunan aktivitas fosfatase pada MAG yang disebabkan oleh penekanan EPP menggunakan kontrol RNA EPP untai ganda (dsEPP) atau RNA GFP untai ganda (dsGFP). Dua puluh kumpulan MAG digunakan dalam setiap replikasi (P = 0,0046, uji t berpasangan, dua sisi), yang diwakili oleh titik-titik terpisah. b, Betina yang dikawinkan dengan jantan yang EPP-nya ditekan memiliki proporsi 3D20E yang terdephosphorylasi secara signifikan lebih rendah pada 3 jam pasca pembuahan (P = 0,0043, uji t tidak berpasangan, dua sisi), sedangkan kadar 20E tidak terpengaruh (P = 0,063, tidak berpasangan). uji-t, dua sisi). Data disajikan sebagai mean ± sem dari tiga kelompok yang masing-masing terdiri dari 13, 16, dan 19 betina.c, Betina yang dikawinkan dengan jantan yang gen EPP-nya dinonaktifkan memiliki tingkat perkawinan ulang yang secara signifikan lebih tinggi (P = 0,0002, uji eksak Fisher, dua sisi). Betina pertama kali dipaksa untuk kawin untuk memastikan status perkawinan mereka; 2 hari kemudian, mereka dihubungi dengan jantan lain yang membawa sperma transgenik untuk menilai tingkat perkawinan ulang dengan deteksi PCR kuantitatif transgen.d, Betina yang telah menghisap darah dan dikawinkan dengan jantan yang gen EPP-nya dinonaktifkan memiliki kesuburan yang berkurang secara signifikan (P < 0,0001; uji Mann-Whitney, dua sisi) dan jumlah telur yang sedikit berkurang (P = 0,088, uji Mann-Whitney, dua sisi), sedangkan tingkat pemijahan tidak terpengaruh (P = 0,94, uji Fisher's exact, dua sisi). Pada semua panel, n mewakili jumlah sampel nyamuk yang secara biologis independen. NS, tidak signifikan.*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001.
Selanjutnya, kami menilai apakah defosforilasi ekdison penting untuk menginduksi resistensi kawin pada betina. Perlu dicatat, betina yang dikawinkan dengan jantan yang kekurangan EPP melakukan perkawinan ulang dengan frekuensi jauh lebih tinggi (44,9%) daripada betina kontrol (10,4%) ketika terpapar jantan tambahan (transgenik) (Gambar 3c). Kami juga mengamati penurunan kesuburan yang signifikan (Gambar 3d, kiri) dan sedikit penurunan jumlah telur yang diletakkan oleh betina ini (Gambar 3d, tengah), sementara persentase telur yang diletakkan oleh betina (respons lain yang ditimbulkan pada betina oleh perkawinan) tidak terpengaruh (Gambar 3d, kanan). Mengingat spesifisitas EPP yang diamati untuk 3D20E22P, hasil ini menunjukkan bahwa aktivasi 3D20E oleh EPP yang ditransfer selama perkawinan mungkin memiliki peran penting dalam mematikan penerimaan betina terhadap perkawinan lebih lanjut, perilaku yang sebelumnya dikaitkan dengan transfer seksual 20E. Oleh karena itu, spesifisitas jantan ini Hormon juga sangat memengaruhi kesuburan wanita.
Selanjutnya, kami membandingkan aktivitas 20E dan 3D20E dalam percobaan injeksi pada betina perawan yang sudah dewasa secara seksual menggunakan 3D20E yang disintesis secara kimia (Gambar 4a–c) dan 20E yang tersedia secara komersial. Kami mengamati bahwa 3D20E secara signifikan lebih efektif daripada 20E dalam mematikan sensitivitas betina terhadap perkawinan pada kedua konsentrasi (Gambar 4d). Yang perlu diperhatikan, setengah dari tingkat fisiologis 3D20E dalam LRT (1.066 pg pasca-injeksi vs. 2.022 pg pasca-kawin) menginduksi proporsi betina refraktori yang 20 kali lebih tinggi daripada tingkat fisiologis 20E (361 pg pasca-injeksi) 24 jam setelah injeksi pada konsentrasi tertinggi 18 pg pasca-kawin; Tabel Data Tambahan 1). Hasil ini konsisten dengan anggapan bahwa transfer seksual 20E tidak menyebabkan periode refraktori perkawinan, dan lebih lanjut menunjukkan 3D20E sebagai faktor utama dalam memastikan hubungan orang tua-anak. 3D20E juga secara signifikan lebih aktif daripada 20E dalam uji peletakan telur pada betina perawan (Gambar 4e), menunjukkan bahwa tingkat peletakan telur normal yang kami amati setelah pembungkaman EPP parsial disebabkan oleh adanya aktivitas 3D20E residual yang masih dihasilkan oleh faktor betina yang diinduksi perkawinan.
(a,b) 3D20E disintesis secara kimia dari 20E (a) dengan konversi/efisiensi yang sangat tinggi (data disajikan sebagai mean ± sem dari tiga reaksi sintesis independen) (b).c, Spektrum massa (bagian bawah) persis sesuai dengan ekdison yang ditemukan pada LRT betina yang telah kawin (bagian atas).d, Dibandingkan dengan 20E (0,63 µg, P = 0,02; 0,21 µg, P < 0,0001; uji eksak Fisher, dua sisi) dan etanol 10% (0,63 µg, P < 0,0001; 0,21 µg, P < 0,0001; uji eksak Fisher, 2 sisi), sedangkan 20E secara signifikan lebih tinggi daripada kontrol hanya pada dosis yang lebih tinggi (0,63 µg, P = 0,0002; 0,21 µg, P = 0,54; (Uji eksak Fisher, 2 sisi). Injeksi 3D20E menginduksi tingkat pemijahan yang secara signifikan lebih tinggi pada nyamuk betina perawan dibandingkan dengan kontrol etanol 10% (0,21 µg, P < 0,0001; 0,13 µg, P = 0,0003; Uji eksak Fisher, dua sisi), sedangkan 20E dibandingkan dengan kontrol hanya pada dosis yang lebih tinggi (0,21 µg, P = 0,022; 0,13 µg, P = 0,0823; Uji eksak Fisher, dua sisi). 3D20E menginduksi tingkat pemijahan yang secara signifikan lebih tinggi daripada 20E pada dosis yang lebih tinggi (0,21 µg, P = 0,0019; 0,13 µg, P = 0,075; Uji eksak Fisher, dua sisi). Pada semua panel, n mewakili jumlah sampel nyamuk yang secara biologis independen. NS, tidak signifikan. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001. Data berasal dari tiga replikasi.
Dalam penelitian sebelumnya, kami menentukan bahwa transfer seksual hormon steroid menginduksi ekspresi MISO (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11), gen reproduksi betina yang melindungi nyamuk betina A. gambiae dari infeksi P. falciparum 13, parasit malaria manusia yang paling mematikan. Mengingat pentingnya MISO bagi kebugaran reproduksi Anopheles di daerah endemik malaria, kami memutuskan untuk menentukan hormon mana, 3D20E atau 20E, yang memicu ekspresi gen ini. Kami menemukan bahwa sementara injeksi 20E secara spesifik atau lebih kuat menginduksi beberapa reseptor hormon nuklir (HR), seperti HR3 dan HR4, dan target steroid hilir yang khas, seperti gen yolkogenik Vg14, 15, 16, MISO lebih kuat diinduksi oleh 3D20E (Gambar Data Tambahan 3). Dengan demikian, transfer seksual hormon steroid androgenik ini tampaknya menginduksi mekanisme yang melindungi betina dari biaya yang ditimbulkan oleh infeksi parasit. Lebih lanjut, 3D20E secara berbeda memengaruhi kedua isoform reseptor E EcR, menginduksi EcR-A dan menekan EcR-B, serta lebih kuat memicu gen penginduksi perkawinan lainnya, termasuk HPX15, yang memengaruhi kesuburan betina. Hal ini dapat menjelaskan infertilitas signifikan yang diamati pada betina yang dikawinkan dengan jantan yang gen EPP-nya dinonaktifkan (Gambar Data Tambahan 3). Data ini menunjukkan adanya jalur hilir yang diaktifkan secara preferensial oleh dua hormon ekdison yang mungkin mendasari fungsi spesifik jenis kelamin.
Selanjutnya, kami menguji fungsi dari dua gen EcK yang diidentifikasi dalam pipeline bioinformatika kami. Pembisuan EcK1 atau EcK2 mengakibatkan mortalitas yang signifikan pada jantan (Gambar Data Tambahan 4a), menunjukkan bahwa fosforilasi ekdison, dan dengan demikian inaktivasi, penting untuk kelangsungan hidup. Karena EcK2 diekspresikan pada tingkat yang lebih tinggi daripada EcK1 dan terdeteksi dalam MAG melalui proteomik (Gambar 2b,c dan Tabel Tambahan 2), kami memvalidasi aktivitas kinase ekdisteroidnya dengan menginkubasinya dengan 20E, yang menghasilkan fosforilasi 20E22P (Gambar Data Tambahan 2).4b). Ketika menggunakan 3D20E sebagai substrat, kami tidak dapat mendeteksi produk terfosforilasi 3D20E22P (Gambar Data Tambahan 4c), menunjukkan bahwa 20E dan bukan 3D20E mungkin merupakan target pilihan EcK2.
Menurut analisis RNA-seq kami, EcK2 juga diekspresikan secara tinggi di LRT betina perawan, di mana ekspresinya menurun setelah kawin (Gambar 2b). Kami mengkonfirmasi data ini dan menentukan bahwa ekspresi EcK2 tidak dipengaruhi oleh pemberian makan darah (Gambar Data Tambahan 5a). Memperluas eksperimen MS awal kami, kami menentukan bahwa puncak 20E22P terkait erat dengan puncak 20E (22-26 jam setelah makan darah; Gambar Data Tambahan 5b). Penonaktifan EcK2 pada betina perawan menghasilkan peningkatan 3 kali lipat dalam rasio relatif 20E terhadap 20E22P pada 26 jam setelah makan darah (Gambar Data Tambahan 2c dan 5c), yang mengkonfirmasi bahwa EcK2 juga memfosforilasi 20E pada betina. Yang perlu diperhatikan, betina perawan yang kekurangan EcK2 mempertahankan penerimaan seksual penuh (Gambar Data Tambahan 5d,e), yang selanjutnya menunjukkan bahwa produksi 20E oleh betina tidak menginduksi periode refraktori perkawinan. Namun, betina-betina ini memiliki tingkat peletakan telur yang meningkat secara signifikan dibandingkan dengan kelompok kontrol, dengan lebih dari 30% betina perawan bertelur (Gambar Data Tambahan 5f). Jika injeksi RNA Eck2 untai ganda (dsEcK2) dilakukan setelah menghisap darah, pemijahan tidak terjadi, di mana puncak 20E akibat konsumsi darah telah menurun. Secara keseluruhan, hasil ini mendukung model bahwa 20E yang diproduksi setelah menghisap darah dapat menginduksi pemijahan, tetapi hanya ketika blok pemijahan (EcK2 dan mungkin faktor lain) dimatikan oleh perkawinan. Baik injeksi 20E maupun 3D20E tidak menghambat ekspresi EcK2 pada betina perawan (Gambar Data Tambahan 5g), menunjukkan bahwa faktor lain memediasi penghambatan kinase ini. Namun, kadar 20E setelah menghisap darah tidak cukup untuk menginduksi ketidaknyamanan perkawinan, tetapi secara efektif dipicu oleh titer tinggi 3D20E yang ditransfer secara seksual.
Hasil penelitian kami memberikan wawasan penting tentang mekanisme yang mengatur keberhasilan reproduksi A. gambiae. Sebuah model telah muncul di mana jantan telah berevolusi untuk mensintesis titer tinggi 3D20E, ekdison termodifikasi spesifik jantan yang memastikan keturunan dengan mendesensitisasi betina terhadap perkawinan lebih lanjut. Pada saat yang sama, vektor malaria ini juga telah mengembangkan sistem yang efisien untuk mengaktifkan 3D20E pada betina sebagai respons terhadap transfer seksual EPP spesifik jantan. Sepengetahuan kami, ini adalah contoh pertama dari sistem hormon steroid yang didominasi jantan dan betina yang melakukan fungsi unik dan penting pada serangga. Fungsi ekdison spesifik jantan telah dipostulasikan tetapi belum dibuktikan secara definitif. Misalnya, hipotesis yang sebagian besar telah dibantah¹⁸ adalah bahwa fungsi-fungsi ini dapat dilakukan oleh prekursor 20E, E1. Sudah diketahui bahwa pada Drosophila, monandri dipicu oleh transfer seksual peptida seks kecil¹⁹,²⁰ yang berinteraksi dengan neuron yang mempersarafi saluran reproduksi betina melalui peptida seks spesifik. reseptor21,22. Penelitian lebih lanjut diperlukan untuk menentukan kaskade sinyal hilir yang dikendalikan oleh 3D20E pada nyamuk betina A. gambiae dan untuk menentukan apakah kaskade ini dapat dipertahankan antara nyamuk dan Drosophila.
Mengingat peran penting 3D20E pada kesuburan dan perilaku betina yang diidentifikasi dalam penelitian kami, jalur yang mengarah pada sintesis dan aktivasi 3D20E menawarkan peluang baru untuk strategi pengendalian nyamuk di masa depan, seperti menghasilkan jantan steril yang kompetitif dalam strategi teknologi serangga steril untuk pelepasan ke alam liar atau untuk meniru 3D20E dalam permainan perkawinan. Fungsi spesifik jantan dari 3D20E mungkin telah berevolusi ketika A. gambiae dan spesies Cellia lainnya memperoleh kemampuan untuk menggumpalkan air mani mereka menjadi sumbat perkawinan, karena ini memungkinkan transfer hormon dan enzim pengaktif hormon dalam jumlah besar secara efisien. Pada gilirannya, evolusi 3D20E yang menerapkan monandri menyediakan mekanisme bagi betina (melalui ekspresi MISO yang tinggi) untuk meningkatkan kebugaran reproduksi mereka di daerah dengan prevalensi malaria yang tinggi, yang secara tidak langsung berkontribusi pada penularan Plasmodium. Mengingat bahwa 20E betina telah terbukti memiliki efek yang mendalam pada kelangsungan hidup dan pertumbuhan P. falciparum pada nyamuk Anopheles betina,24 baik jalur hormon steroid jantan maupun betina sekarang menjadi aspek kunci dari interaksi nyamuk-parasit.
Strain A. gambiae G3 dibiakkan dalam kondisi serangga standar (26-28 °C, kelembaban relatif 65-80%, fotoperiode terang/gelap 12:12 jam). Larva diberi makan makanan ikan bubuk (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets, dan Tetra Pond Sticks dengan rasio 7:7:2). Nyamuk dewasa diberi makan larutan dekstrosa 10% secara ad libitum dan darah manusia setiap minggu (komponen darah yang diteliti). Nyamuk perawan diperoleh dengan memisahkan jenis kelamin pada tahap pupa setelah memeriksa ujungnya dengan mikroskop. Nyamuk jantan yang membawa transgen DsRed telah dijelaskan sebelumnya.
Eksperimen perkawinan paksa dilakukan sesuai dengan protokol yang telah dijelaskan sebelumnya. Untuk perkawinan alami, betina perawan berumur 4 hari dipelihara dengan perbandingan 1:3 dengan jantan perawan yang sudah dewasa secara seksual selama dua malam. Untuk eksperimen di mana jantan disuntik dengan dsEPP, pengurungan bersama bertepatan dengan hari ke-3-4 setelah penyuntikan, ketika aktivitas fosfatase ditekan secara maksimal (Gambar Data Tambahan 2b).
Jaringan nyamuk, sisa bangkai (bagian tubuh lainnya), atau seluruh tubuh dibedah ke dalam metanol 100% dan dihomogenkan dengan alat pengaduk manik-manik (manik-manik kaca 2 mm, 2.400 rpm, 90 detik). Jumlah jaringan dan volume metanol adalah sebagai berikut: bagian tubuh lainnya, 50 µl dalam 1.000 µl; MAG, 50–100 µl dalam 80 µl; LRT betina, 25–50 µl dalam 80 µl. Endapan tersebut kemudian diekstraksi dengan metanol kedua dengan volume metanol yang sama. Sisa sel dihilangkan dengan sentrifugasi. Metanol dari kedua ekstraksi digabungkan dan dikeringkan di bawah aliran nitrogen, kemudian dilarutkan kembali dalam volume metanol 80% dalam air sebagai berikut: bagian tubuh lainnya, 50 µl; MAG dan LRT betina, 30 µl.
Sampel dianalisis menggunakan spektrometer massa (ID-X, Thermo Fisher) yang dihubungkan dengan instrumen LC (Vanquish, Thermo Fisher). 5 µl sampel diinjeksikan ke kolom 3 µm, 100 × 4,6 mm (Inspire C8, Dikma) yang dijaga pada suhu 25 °C. Fase gerak untuk LC adalah A (air, 0,1% asam format) dan B (asetonitril, 0,1% asam format). Gradien LC adalah sebagai berikut: 5% B selama 1 menit, kemudian ditingkatkan menjadi 100% B selama 11 menit. Setelah 8 menit pada 100%, kolom diseimbangkan kembali pada 5% B selama 4 menit. Laju alir adalah 0,3 ml min-1. Ionisasi di sumber MS dilakukan dengan ionisasi elektrospray yang dipanaskan dalam mode positif dan negatif.
Spektrometer massa mengukur data dalam rentang m/z dari 350 hingga 680 pada resolusi 60.000 dalam mode MS penuh. Data MS/MS diperoleh pada [M + H]+ (semua target), [M - H2O + H]+ (semua target), dan [M - H]- (target terfosforilasi). Data MS/MS digunakan untuk mengkonfirmasi sifat ekdison dari target yang tidak tersedia standarnya. Untuk mengidentifikasi ekdisteroid non-target, data MS/MS untuk semua puncak HPLC dengan kelimpahan relatif >15% dianalisis. Kuantifikasi dilakukan menggunakan kurva standar yang dibuat dari standar murni (20E, 3D20E) untuk menghitung jumlah absolut atau pengenceran dari satu sampel spesifik (semua target lainnya) untuk menghitung kesetaraannya dengan jumlah yang ditemukan pada satu pria. Untuk 3D20E, kuantifikasi dilakukan menggunakan jumlah aduk berikut: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + [Cl]-, [M + NO3]-. Data diekstraksi dan dikuantifikasi menggunakan Tracefinder (versi 4.1). Data MS/MS dianalisis menggunakan Xcalibur (versi 4.4). Spektrum MS dari E, 20E dan 3D20E dibandingkan dengan standar masing-masing. 3D20E22P dianalisis dengan derivatisasi menggunakan reagen Girard. 20E22P dianalisis dengan rasio m/z.
3D20E22P dimurnikan dari MAG. Pemurnian dilakukan dalam skala analitik menggunakan kromatograf cair kinerja ultra (Acquity, Waters) dengan detektor berbasis massa kuadrupol (QDa, Acquity, Waters) di bawah kondisi LC yang sama dengan analisis HPLC-MS/MS. Pengumpulan fraksi dipicu ketika m/z yang sesuai dengan 3D20E22P terdeteksi pada waktu retensi yang sama seperti yang telah ditentukan sebelumnya. Kemurnian senyawa yang diekstrak kemudian diperiksa dengan HPLC-MS/MS seperti yang dijelaskan di atas.
Total RNA diekstraksi dari 10-12 jaringan reproduksi atau bagian tubuh lainnya (tanpa kepala) menggunakan reagen TRI (Thermo Fisher) mengikuti instruksi pabrik. RNA diolah dengan TURBO DNase (Thermo Fisher). cDNA disintesis menggunakan reverse transcriptase virus leukemia murine Moloney (M-MLV RT; Thermo Fisher) mengikuti instruksi pabrik. Primer untuk PCR kuantitatif transkripsi balik (RT-qPCR; Tabel Data Tambahan 2) telah dipublikasikan sebelumnya24 atau dirancang menggunakan Primer-BLAST26, dengan preferensi diberikan pada produk berukuran 70-150 bp dan mencakup persimpangan ekson-ekson atau pasangan primer yang memisahkan ekson. Sampel cDNA dari tiga hingga empat replikasi biologis diencerkan empat kali lipat dalam air untuk RT-qPCR. Kuantifikasi dilakukan dalam reaksi replikasi 15 µl yang mengandung 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), primer, dan 5 µl larutan yang diencerkan. cDNA. Reaksi dijalankan pada sistem PCR waktu nyata QuantStudio 6 Pro (Thermo Fisher) dan data dikumpulkan dan dianalisis menggunakan Desain dan Analisis (versi 2.4.3). Seperti yang ditunjukkan dalam penelitian ini, jumlah relatif dinormalisasi terhadap gen ribosom RpL19 (AGAP004422), yang ekspresinya tidak berubah secara signifikan dengan pemberian makan darah 27 atau perkawinan 3.
Kualitas RNA diperiksa menggunakan Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent). Pustaka Illumina paired-end disiapkan dan dijalankan di Broad Institute of MIT dan Harvard. Bacaan sekuensing diselaraskan dengan genom A. gambiae (strain PEST, versi 4.12) menggunakan HISAT2 (versi 2.0.5) dengan parameter default. Bacaan dengan skor kualitas pemetaan (MAPQ) <30 dihapus menggunakan Samtools (versi 1.3.1). Jumlah bacaan yang dipetakan ke gen dihitung menggunakan htseq-count (versi 0.9.1) dengan parameter default. Jumlah bacaan yang dinormalisasi dihitung dan ekspresi gen diferensial dianalisis menggunakan paket DESeq2 (versi 1.28.1) di R (versi 4.0.3).
Kandidat gen pengubah ekdison diidentifikasi dengan pertama-tama mencari genom A. gambiae menggunakan algoritma PSI-BLAST (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/), menggunakan nilai default Parameter dengan urutan protein kueri berikut: dari Bombyx mori (Nomor Aksesi NP_001038956.1), Musca domestica (Nomor Aksesi XP_005182020.1, XP_005175332.1 dan XP_011294434.1) dan Microplitis demolitor (Nomor Aksesi XP_008552646.1 dan XP_008552645.1) EcK dari B. mori (Nomor Aksesi NP_001036900), Drosophila melanogaster (Nomor Aksesi...). NP_651202), Apis mellifera (Nomor Aksesi XP_394838) dan Acyrthosiphon pisum (Nomor Aksesi XP_001947166); dan EPP dari B. mori (Nomor Aksesi XP_001947166) NP_001177919.1 dan NP_001243996.1) dan EO dari D. melanogaster (Nomor Aksesi NP_572986.1) (langkah 1). Selanjutnya, saring hasil berdasarkan ekspresi mRNA tinggi (>100 fragmen/kilobase ekson per juta pembacaan yang dipetakan (FPKM) atau >85%) pada jaringan reproduksi (LRT betina atau MAG) di Gambia (langkah 2). Untuk meningkatkan spesifisitas, kami memilih enzim kandidat yang juga diekspresikan dalam jaringan reproduksi A. albimanus, spesies Anopheles yang tidak mensintesis atau mentransfer ekdison selama perkawinan. Gen kandidat disaring berdasarkan ekspresi rendah (<100 FPKM atau
Betina perawan berusia 4-6 hari yang diberi tag 15N dipaksa untuk kawin dengan jantan perawan tak bertag yang seusia. Keberhasilan perkawinan diverifikasi dengan mendeteksi sumbat kawin di bawah mikroskop epifluoresensi. Pada 3, 12, dan 24 jam pasca kawin, atrium dari 45-55 betina yang telah kawin dibedah ke dalam 50 µl larutan penyangga amonium bikarbonat (pH 7,8) dan dihomogenkan dengan alu. Homogenat disentrifugasi dan supernatan dicampur dengan 50 µl RapiGest 0,1% (186001860, Waters) dalam amonium bikarbonat 50 mM. Supernatan dan pelet dari setiap sampel dibekukan cepat di atas es kering dan dikirim semalaman ke laboratorium MacCoss di Universitas Washington, tempat persiapan sampel untuk LC-MS/MS diselesaikan. Suspensi ulang pelet dalam 50 µl 0,1% RapiGest dilarutkan dalam 50 mM amonium bikarbonat dan disonikasi dalam penangas air. Konsentrasi protein pelet dan supernatan diukur dengan uji BCA. Sampel direduksi dengan 5 mM ditiotreitol (DTT; Sigma), dialkilasi dengan 15 mM iodoasetamida (Sigma), dan diinkubasi pada suhu 37 °C (1:0,50) selama 1 jam dengan tripsinasi (rasio tripsin:substrat). RapiGest dilisis dengan penambahan 200 mM HCl, diikuti dengan inkubasi pada suhu 37 °C selama 45 menit dan sentrifugasi pada 14.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4 °C untuk menghilangkan debris. Sampel dicuci dengan ekstraksi fase padat mode ganda (kartrid Oasis MCX, Waters) dan disuspensikan kembali dalam asam format 0,1% untuk konsentrasi protein akhir 0,33 µg. µl-1. Proteom MAG yang tidak berlabel juga dianalisis dari jantan perawan. Dua replikasi analitik dianalisis untuk setiap sampel. Selanjutnya, 1 µg dari masing-masing sampel dianalisis menggunakan kolom silika leburan 25 cm 75 μm dengan perangkap frit silika leburan Kasil1 (PQ) 4 cm yang diisi dengan resin fase terbalik Jupiter C12 (Phenomenex) dan kromatografi cair selama 180 menit. Pencernaan sampel – MS/MS dijalankan pada spektrometer massa Q-Exactive HF (Thermo Fisher) dengan Sistem nanoACQUITY UPLC (Waters). Data akuisisi terkait data yang dihasilkan untuk setiap run dikonversi ke format mzML menggunakan Proteowizard (versi 3.0.20287) dan menggunakan Comet31 (versi 3.2) terhadap basis data FASTA yang berisi sekuens protein dari Anopheles gambiae (VectorBase versi 54), Anopheles coluzzi. Pencarian dilakukan pada Mali-NIH (VectorBase versi 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, Maret 2021), RNA-seq A. gambiae, dan terjemahan tiga bingkai dari kontaminan manusia yang diketahui. FDR yang cocok dengan peta peptida ditentukan menggunakan Percolator32 (versi 3.05) dengan ambang batas 0,01, dan peptida dirakit menjadi identifikasi protein menggunakan parsimoni protein di Limelight33. (versi 2.2.0). Kelimpahan protein relatif diperkirakan menggunakan faktor kelimpahan spektral ternormalisasi (NSAF) yang dihitung untuk setiap protein dalam setiap run seperti yang dijelaskan sebelumnya. NSAF relatif terhadap setiap protein dirata-ratakan di seluruh sampel dari dua replikasi biologis yang berbeda. Pelabelan 15N berhasil menutupi proteom betina, meskipun sejumlah kecil protein tak berlabel dapat dideteksi dari betina perawan yang diberi label. Kami mencatat deteksi pengurangan protein jantan (1-5 spektrum) dalam sampel mentah betina hanya pada run teknis, di mana sampel mentah dijalankan setelah sampel jantan/kawin, sebagai akibat dari "carry over" HPLC. Protein sesekali yang ditemukan sebagai 'kontaminan' dari betina perawan yang diberi label tercantum dalam Tabel Tambahan 1.
Dua peptida antigenik, QTTDRVAPAPDQQQ (dalam isotipe PA) dan MESDGTTPSGDSEQ (dalam isotipe PA dan PB) dalam Genscript. Kedua peptida tersebut digabungkan, kemudian dikonjugasikan ke protein pembawa KLH dan disuntikkan ke kelinci Selandia Baru. Kelinci dikorbankan setelah suntikan keempat, dan total IgG diisolasi dengan pemurnian afinitas. IgG dari kelinci yang paling spesifik terhadap EPP digunakan untuk western blotting lebih lanjut.
Untuk western blot, MAG (n = 10, di mana n mewakili jumlah sampel nyamuk yang secara biologis independen) dan LRT betina (n = 30) dari nyamuk jantan perawan berumur 4 hari dan nyamuk betina perawan atau yang dipaksa kawin (<10 pasca kawin), buffer ekstraksi protein (50 mM Tris, pH 8,0; 1% NP-40; 0,25% natrium deoksikolat; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× koktail penghambat protease (Roche)) ditambahkan secara terpisah. Sampel dihomogenkan segera setelah pembedahan dengan alat penghomogen (manik-manik kaca 2 mm, 2.400 rpm, 90 detik). Serpihan yang tidak larut dihilangkan dengan sentrifugasi pada 20.000 g pada suhu 4 °C. Protein dikuantifikasi dengan uji Bradford (Bio-Rad). Kemudian, 20 µg protein MAG, 40 µg LRT Protein, dan 20 µg protein sisa didenaturasi dan dipisahkan dengan NuPAGE Bis-Tris 10% menggunakan buffer MOPS. Protein dipindahkan ke membran polivinilidena fluorida menggunakan sistem transfer iBlot2 (Thermo Fisher). Membran dicuci dua kali dalam 1× PBS-T (0,1% Tween-20 dalam PBS) dan kemudian diblokir dalam buffer pemblokiran Odyssey (Li-Cor) selama 1 jam pada suhu 22°C. Membran dikocok semalaman pada suhu 4°C dengan antibodi primer poliklonal kelinci anti-EPP khusus (1:700 dalam buffer pemblokiran) dan antibodi primer monoklonal tikus anti-aktin MAC237 (Abeam; 1:4.000). Membran dicuci dengan PBS-T dan kemudian diinkubasi dengan antibodi sekunder (keledai anti-kelinci 800CW dan kambing anti-tikus 680LT (Li-Cor)), keduanya (1:20.000) dalam larutan penyangga pemblokiran yang mengandung 0,01% SDS dan 0,2% Tween-20 selama 1 jam pada suhu 22 °C. Membran dicuci dengan PBS-T dan diimajinasikan dengan pemindai Odyssey CLx. Gambar dikumpulkan dan diproses di Image Studio (versi 5.2). Pita spesifik yang sesuai dengan isoform EPP-RA (82 kDa) tidak terdeteksi.
Wilayah pengkodean EPP (sebagai isoform AGAP002463-RB yang mengandung domain histidin fosfatase, pencarian domain konservasi NCBI 34) dan EcK2 (AGAP002181) dikloning ke dalam plasmid pET-21a(+) (Novagen Millipore Sigma); Primer tercantum dalam Tabel Data Tambahan 2. Delapan linker GS4 (berurutan) dimasukkan sebelum tag 6xHis C-terminal dari konstruksi pET-21a(+)-EcK2. Protein rekombinan diproduksi menggunakan reaksi sintesis protein E. coli bebas sel NEBExpress (New England BioLabs). Protein rekombinan dimurnikan menggunakan kolom putar Ni NEBExpress (New England BioLabs). Protein kontrol dihidrofolat reduktase (DHFR) diproduksi menggunakan templat DNA dari Kit Sintesis Protein E. coli Bebas Sel NEBExpress. Protein disimpan dalam gliserol 50% dalam PBS pada suhu -20 °C hingga 3 bulan.
Aktivitas fosfatase EPP dan ekstrak jaringan diukur menggunakan 4-nitrofenil fosfat (pNPP; Sigma-Aldrich). Larutan penyangga reaksi mengandung 25 mM Tris, 50 mM asam asetat, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, dan 1 mM DTT. Jaringan dihomogenkan dalam larutan penyangga reaksi dan sisa sel dihilangkan dengan sentrifugasi. Reaksi dimulai dengan menambahkan enzim atau ekstrak jaringan ke dalam larutan penyangga reaksi yang mengandung 2,5 mg ml-1 pNPP. Campuran reaksi diinkubasi pada suhu kamar dalam gelap, dan jumlah pNP yang dikonversi dari pNPP dikuantifikasi dengan mengukur absorbansi pada 405 nm pada berbagai waktu.
Untuk aktivitas EcK in vitro, protein diinkubasi dengan 0,2 mg 20E atau 3D20E dalam 200 µl buffer (pH 7,5) yang mengandung 10 mM HEPES–NaOH, 0,1% BSA, 2 mM ATP, dan 10 mM MgCl2 selama 2 jam pada suhu 27 °C. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 800 µl metanol, kemudian didinginkan pada suhu -20 °C selama 1 jam, lalu disentrifugasi pada 20.000 g selama 10 menit pada suhu 4 °C. Supernatan kemudian dianalisis dengan HPLC-MS/MS. Untuk menonaktifkan protein yang digunakan dalam kelompok kontrol dengan pemanasan, protein diinkubasi dalam gliserol 50% dalam PBS selama 20 menit pada suhu 95°C.
Untuk aktivitas EPP in vitro, protein diinkubasi dengan 3D20E22P (setara dengan jumlah yang ditemukan dalam 18 pasang MAG, dimurnikan dengan HPLC-MS/MS) dalam 100 µl buffer (pH 7,5) yang mengandung 25 mM Tris, 50 mM asam asetat, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, dan 1 mM DTT selama 3 jam pada suhu 27 °C. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 400 µl metanol dan didinginkan pada suhu -20 °C selama 1 jam, kemudian disentrifugasi pada 20.000 g selama 10 menit pada suhu 4 °C. Supernatan dianalisis dengan HPLC-MS/MS.
Fragmen PCR untuk EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) dan EcK2 (556 bp) diamplifikasi dari cDNA yang disiapkan dari bangkai nyamuk tanpa kepala campuran jenis kelamin. Fragmen PCR kontrol eGFP (495 bp) diamplifikasi dari pCR2.1-eGFP yang telah dijelaskan sebelumnya; Primer PCR tercantum dalam Tabel Data Tambahan 2. Fragmen PCR dimasukkan di antara promotor T7 terbalik pada plasmid pL4440. Konstruksi plasmid diperoleh dari E. coli kompeten NEB 5-α (New England Biolabs) dan diverifikasi dengan sekuensing DNA sebelum digunakan (lihat Data Tambahan 1 untuk urutan sisipan). Primer yang sesuai dengan promotor T7 (Tabel Data Tambahan 2) digunakan untuk mengamplifikasi sisipan dari plasmid berbasis pL4440. Ukuran produk PCR dikonfirmasi dengan elektroforesis gel agarosa. dsRNA ditranskripsikan dari templat PCR menggunakan Kit Transkripsi Megascript T7 (Thermo Fisher) dan dimurnikan sesuai dengan instruksi pabrik dengan modifikasi yang telah dijelaskan sebelumnya.
Untuk injeksi dsRNA, 1.380 ng dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) diinjeksikan dengan konsentrasi 10 ng nl-1 ke dalam toraks jantan atau betina dewasa (Nanoject III, Drummond) dalam waktu 1 hari setelah penetasan. Tingkat penurunan gen ditentukan dalam setidaknya tiga replikasi biologis dengan ekstraksi RNA, sintesis cDNA, dan RT-qPCR. Untuk injeksi ekdison, betina perawan berusia 4 hari atau betina perawan berusia 6 hari yang telah diberi makan darah diinjeksikan dengan 0,13, 0,21, atau 0,63 µg 20E atau 3D20E (Nanoject III, Drummond) dengan konsentrasi masing-masing 1,3, 2,1, tergantung pada desain eksperimental atau 6,3 ng nl-1. Suntikkan 100 nl 10% (vol/vol) etanol dalam air; 100 nl 3D20E22P dalam etanol 10% (setara dengan 75% dari jumlah yang ditemukan dalam sepasang MAG). Nyamuk secara acak ditugaskan ke kelompok injeksi.
Untuk pengujian pemijahan, nyamuk betina berumur 3 hari diberi makan darah manusia secara bebas. Singkirkan nyamuk yang sebagian sudah makan atau belum makan. Tergantung pada perlakuan, nyamuk betina ditempatkan dalam wadah pemijahan terpisah selama empat malam, setidaknya 48 jam setelah makan darah. Telur dihitung di bawah mikroskop stereo (Stemi 508, Zeiss); untuk nyamuk betina yang telah kawin, telur yang menetas menjadi larva dianggap subur.
Untuk percobaan perkawinan, betina diberi waktu setidaknya 2 hari, tergantung pada perlakuan, untuk mengembangkan resistensi terhadap perkawinan, dan jantan tipe liar yang seusia kemudian dimasukkan ke dalam kandang yang sama. Dua malam kemudian, vesikel yang telah dibuahi pada betina dibedah dan DNA genom dilepaskan dengan pembekuan-pencairan dan sonikasi dalam buffer yang mengandung 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, dan 25 mM NaCl (pH 8,2). Sampel diinkubasi dengan Proteinase K (0,86 µg µl-1) selama 15 menit pada suhu 55 °C, diikuti dengan 10 menit pada suhu 95 °C. Preparasi DNA genom kasar diencerkan 10 kali lipat dan dilakukan deteksi qPCR terhadap sekuens kromosom Y; primer tercantum dalam Tabel Data Tambahan 2. Tidak adanya sekuens kromosom Y menunjukkan tidak terjadi perkawinan.
Untuk pengujian perkawinan ulang, betina yang dipaksa kawin diperiksa keberadaan sumbat kawin untuk memastikan status perkawinan dan diberi waktu 2 hari untuk mengembangkan resistensi terhadap perkawinan tanpa kehadiran jantan, seperti yang dijelaskan sebelumnya 36. Jantan yang membawa sperma transgenik DsRed kemudian dimasukkan ke dalam kandang betina. Dua malam kemudian, vesikel pembuahan dipisahkan dari betina, dan DNA genomik disiapkan seperti yang dijelaskan di atas dan dikenai deteksi qPCR transgen DsRed; primer tercantum dalam Tabel Data Tambahan 2. Tidak adanya transgen DsRed menunjukkan bahwa tidak terjadi perkawinan ulang.
3D20E disintesis seperti yang dijelaskan sebelumnya 37. Secara singkat, 10 mg 20E (Sigma-Aldrich) dilarutkan dalam 10 ml air, diikuti dengan penambahan 30 mg platinum hitam (dalam bentuk bubuk, Sigma-Aldrich). Aliran O2 yang lembut terus-menerus dialirkan ke dalam campuran reaksi, yang diaduk pada suhu kamar. Setelah 6 jam, 30 mL metanol ditambahkan untuk menghentikan reaksi. Campuran disentrifugasi untuk menghilangkan partikel katalis. Supernatan diuapkan hingga kering dalam vakum pada suhu kamar. Produk reaksi yang dikeringkan dilarutkan dalam etanol dan metanol 10% untuk injeksi untuk analisis HPLC-MS/MS. Tingkat konversi (dari 20E ke 3D20E) sekitar 97% (Gambar 4b), dan spektrum MS dari 3D20E yang disintesis sesuai dengan yang ditemukan pada betina yang telah kawin (Gambar 4c).
Legenda berisi detail spesifik dari uji statistik yang dilakukan. GraphPad (versi 9.0) digunakan untuk melakukan uji Fisher's exact test, uji Mantel-Cox, dan uji t Student. Uji Cochran-Mantel-Haenszel dilakukan menggunakan skrip R khusus (tersedia di https://github.com/duopeng/mantelhaen.test). Distribusi data diuji normalitasnya menggunakan uji Shapiro-Wilk dengan ambang batas signifikansi 0,05. Jika data gagal dalam uji normalitas, uji Mann-Whitney dilakukan. Data kelangsungan hidup dianalisis menggunakan uji Mantel-Cox. Paket DESeq2 (versi 1.28.1) digunakan untuk melakukan analisis ekspresi diferensial tingkat gen RNA-seq. Garis horizontal pada grafik mewakili median. Nilai signifikansi P = 0,05 digunakan sebagai ambang batas untuk semua pengujian.
Untuk informasi lebih lanjut mengenai desain penelitian, lihat abstrak Nature Research Report yang ditautkan pada artikel ini.
Data proteomik MS telah diunggah ke ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) melalui PRIDE Partner Repository (https://www.ebi.ac.uk/pride/) dengan pengidentifikasi dataset PXD032157.
Dataset RNA-seq disimpan di Gene Expression Comprehensive Library (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) dengan nomor seri GSE198665.
Kumpulan data tambahan yang dihasilkan dan/atau dianalisis selama penelitian ini dapat diperoleh dari penulis terkait atas permintaan yang wajar. Artikel ini menyediakan data sumber.
De Loof, A. Ecdysteroids: Steroid seks serangga yang terabaikan? Jantan: Kotak Hitam. Ilmu Serangga. 13, 325–338 (2006).
Redfern, CPF 20-hydroxyecdysone dan perkembangan ovarium pada Anopheles stephens. J. Insect Physiology. 28, 97–109 (1982).
Waktu posting: 08 Juli 2022