Pemilahan protein dalam jalur sekresi sangat penting untuk menjaga kompartementalisasi sel dan homeostasis. Selain pemilahan yang dimediasi oleh cangkang, peran lipid dalam pemilahan kinesin dalam proses transpor sekresi merupakan pertanyaan mendasar yang telah lama ada dan belum terjawab. Di sini, kami melakukan pencitraan real-time resolusi tinggi multiwarna simultan 3D untuk membuktikan secara in vivo bahwa protein glikosilfosfatidilinositol yang baru disintesis dengan gugus lipid seramida yang sangat panjang dikelompokkan dan diklasifikasikan ke dalam situs keluar endoplasma khusus, yang berbeda dari yang digunakan oleh protein transmembran. Selain itu, kami menunjukkan bahwa panjang rantai seramida dalam membran retikulum endoplasma sangat penting untuk selektivitas pemilahan ini. Studi kami memberikan bukti langsung in vivo pertama untuk mengklasifikasikan muatan protein berdasarkan panjang rantai lipid ke dalam situs ekspor selektif dalam jalur sekresi.
Pada sel eukariotik, protein yang disintesis di retikulum endoplasma (ER) kemudian disortir selama transportasi melalui jalur sekresi untuk dikirim ke tujuan seluler yang sesuai (1). Selain penyortiran yang dimediasi oleh lapisan pelindung, telah lama diperkirakan bahwa lipid tertentu juga dapat berfungsi sebagai titik keluar selektif dengan mengelompokkannya ke dalam domain membran spesifik yang mengikat protein tertentu (2-5). Namun, masih kurang bukti langsung in vivo untuk membuktikan mekanisme berbasis lipid ini. Untuk memecahkan masalah mendasar ini, kami mempelajari pada ragi bagaimana protein yang terikat glikosilfosfatidilinositol (GPI) (GPI-AP) diekspor secara berbeda dari ER. GPI-AP adalah berbagai protein permukaan sel yang terhubung dengan lipid (6, 7). GPI-AP adalah protein yang disekresikan yang melekat pada lapisan luar membran plasma melalui bagian glikolipid (jangkar GPI). Mereka menerima jangkar GPI sebagai modifikasi pasca-translasi konservatif di lumen ER (8). Setelah menempel, GPI-AP melewati aparatus Golgi (5, 9) dari ER ke membran plasma. Kehadiran jangkar GPI menyebabkan GPI-AP diangkut secara terpisah dari protein sekresi transmembran (termasuk protein membran plasma lainnya) di sepanjang jalur sekresi (5, 9, 10). Pada sel ragi, GPI-AP dipisahkan dari protein sekresi lainnya di retikulum endoplasma, dan kemudian dikemas ke dalam vesikel unik yang dibungkus oleh kompleks protein pelapis II (COPII) (6, 7). Penentu proses klasifikasi ini dalam proses ekspor ER tidak jelas, tetapi diperkirakan bahwa mekanisme ini mungkin membutuhkan lipid, terutama penataan ulang struktural bagian lipid dari jangkar GPI (5, 8). Pada ragi, penataan ulang lipid GPI dimulai segera setelah GPI menempel, dan dalam banyak kasus, hal itu menyebabkan seramida berikatan dengan asam lemak jenuh rantai panjang 26 karbon (C26:0) (11, 12). Ceramide C26 adalah ceramide utama yang diproduksi oleh sel ragi hingga saat ini. Ceramide ini disintesis di ER dan sebagian besar diekspor ke aparatus Golgi melalui vesikel COPII (13). Ekspor GPI-AP dari ER secara khusus membutuhkan sintesis ceramide yang berkelanjutan (14, 15), dan pada gilirannya, konversi ceramide menjadi inositol fosfat ceramide (IPC) di aparatus Golgi bergantung pada sintesis jangkar GPI (16). Studi biofisika dengan membran buatan telah menunjukkan bahwa ceramide rantai asil yang sangat panjang dapat bergabung membentuk domain teratur dengan sifat fisik yang unik (17, 18). Data ini mengarah pada hipotesis bahwa ceramide C26 dan GPI-AP dengan ceramide C26 menggunakan sifat fisiknya untuk bergabung menjadi daerah atau wilayah teratur dalam lingkungan lipid membran ER yang relatif berantakan. Lingkungan ini terutama terdiri dari gliserolipid pendek dan tak jenuh (C16:1 dan C18:1) (19, 20). Wilayah-wilayah ini akan difokuskan secara selektif pada lokasi keluaran ER (ERES) tertentu, di mana ceramide dan GPI-AP berbasis ceramide dapat diangkut bersama ke Golgi dalam vesikel COPII khusus yang sama (5).
Dalam penelitian ini, kami telah secara langsung menguji mekanisme berbasis lipid ini dengan menggunakan mikroskop pencitraan waktu nyata konfokal super-resolusi (SCLIM), yang merupakan teknik mikroskop mutakhir yang dapat secara simultan mengamati protein berlabel fluoresen. Gambar tiga warna dan tiga dimensi (3D) memiliki resolusi dan kecepatan yang sangat tinggi dalam sel hidup (21, 22).
Kami pertama kali menerapkan teknologi SCLIM untuk lebih mendefinisikan bagaimana GPI-AP normal dengan gugus seramida C26 disaring dari protein yang disekresikan transmembran setelah meninggalkan ER di S. cerevisiae. Untuk memeriksa klasifikasi ER, kami menggunakan sistem genetik yang dapat secara langsung memvisualisasikan kargo yang baru disintesis yang memasuki ERES secara in vivo (7, 23). Sebagai kargo, kami memilih GPI-AP Gas1 berbasis seramida C26 yang diberi label protein fluoresen hijau (GFP) dan protein yang disekresikan transmembran Mid2 yang diberi label protein fluoresen inframerah dekat (iRFP), yang keduanya menargetkan membran plasma (24–26). Pada mutan sensitif suhu sec31-1, kedua kargo ini diekspresikan di bawah promotor yang dapat diinduksi galaktosa dan penanda ERES konstitutif. Pada suhu ekstrem (37°C), karena mutasi sec31-1 memengaruhi fungsi komponen pelapis COPII Sec31 untuk menghambat perkecambahan COPII dan ekspor ER, kargo yang baru disintesis terakumulasi di ER (23). Setelah didinginkan hingga suhu rendah (24°C), sel mutan sec31-1 pulih dari area sekresi, dan kargo sintetis baru yang terakumulasi mulai diekspor dari ER. Visualisasi CLIM menunjukkan bahwa sebagian besar Gas1-GFP dan Mid2-iRFP yang baru disintesis masih terakumulasi di ER sel mutan sec31-1 setelah inkubasi pada 37°C dan kemudian dilepaskan pada 24°C selama 5 menit (Gambar 1). Karena Mid2-iRFP terdistribusi di seluruh membran ER, dan Gas1-GFP terkonsentrasi dan berkumpul di area membran ER yang tidak kontinu, distribusinya sangat berbeda (Gambar 1, A hingga C dan Video S1). Selain itu, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1D, kluster Gas1-GFP tidak memiliki Mid2-iRFP. Hasil ini menunjukkan bahwa GPI-AP dan protein transmembran terpisah ke wilayah membran ER yang berbeda sejak dini. Kluster Gas1-GFP berdekatan dengan ERES spesifik yang diberi label dengan protein selubung COPII mCherry Sec13 (Gambar 1, E dan F, dan video S1) (23).
Sel sec31-1 mengekspresikan sekresi yang diinduksi galaktosa, rantai asil panjang (C26) seramida GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, hijau) dan protein transmembran Mid2-iRFP (TMP, biru) dan pelabelan ERES konstruktif Sec13-mCherry (ERES, magenta) ini diinkubasi pada suhu 37°C selama 30 menit, dipindahkan ke 24°C, dan diimajinasikan dengan SCLIM 5 menit kemudian. (A hingga C) menunjukkan gambar 2D gabungan atau tunggal yang representatif dari sebuah bidang (A), gambar proyeksi 2D dari 10 penampang z (B) atau gambar hemisfer sel 3D dari kargo dan penanda ERES (C). Skala bar 1μm (A dan B). Satuan skala adalah 0,551μm (C). Gas1-GFP terdeteksi di wilayah atau gugus ER diskrit, sedangkan Mid2-iRFP terdeteksi dan tersebar di seluruh membran ER (C). (D) Grafik menunjukkan intensitas fluoresensi relatif Gas1-GFP dan Mid2-iRFP dalam gugus Gas1-GFP di sepanjang garis panah putih (kiri). AU, satuan arbitrer. (E dan F) mewakili gambar 3D yang menggabungkan barang dan tanda ERES. Gugus Gas1-GFP terdeteksi di dekat ERES spesifik. Satuan skala adalah 0,551μm. (F) Panah putih solid menandai gugus Gas1-GFP yang terkait dengan ERES. Panel tengah dan kanan menunjukkan gambar 3D yang diperbesar dan tampilan yang diputar dari gugus Gas1-GFP yang dipilih.
Hubungan spasial yang erat antara kluster Gas1-GFP dan ERES spesifik menunjukkan bahwa Gas1-GFP dapat memasuki ERES selektif, yang berbeda dari selektivitas yang digunakan oleh Mid2-iRFP untuk meninggalkan ER. Untuk mengatasi kemungkinan ini, kami mengkuantifikasi rasio ERES hanya untuk satu atau dua jenis kargo (Gambar 2, A hingga C). Kami menemukan bahwa sebagian besar ERES (70%) hanya mengandung satu jenis kargo. Gambar bawah pada Gambar 2C menunjukkan dua contoh tipikal ERES yang hanya mengandung Gas1-GFP (Gambar 1) atau hanya Mid2-iRFP (Gambar 2). Sebaliknya, sekitar 20% ERES mengandung dua jenis kargo yang tumpang tindih di area yang sama. Ditemukan bahwa beberapa ERES (10%) mengandung dua jenis kargo, tetapi terisolasi di area yang jelas berbeda. Oleh karena itu, analisis statistik ini menunjukkan bahwa setelah ER diekspor, GPI-AP Gas1-GFP dan kargo transmembran Mid2-iRFP terbagi ke dalam ERES yang berbeda (Gambar 2D). Efisiensi penyortiran ini sangat konsisten dengan analisis biokimia sebelumnya (6) dan penentuan morfologi (7). Kita juga dapat mengamati perilaku kargo yang dikarantina yang memasuki ERES (Gambar 2E dan Video S2). Gambar 2E menunjukkan bahwa hanya sebagian kecil Gas1-GFP (panel 3) atau Mid2-iRFP (panel 4) yang memasuki ERES dari satu sisi dan terbatas pada area tertentu. Panel 5 pada Gambar 2E menunjukkan bahwa Gas1-GFP dan Mid2-iRFP terkadang ditemukan di ERES yang sama, tetapi mereka masuk dari sisi yang berbeda dan terkonsentrasi di wilayah terpisah yang mungkin mewakili vesikel COPII yang berbeda. Kami juga mengkonfirmasi bahwa pemisahan dan klasifikasi GPI-AP Gas1 berbasis seramida C26 yang diamati sebagai ERES selektif bersifat spesifik karena kargo sekresi transmembran lainnya, protein membran plasma berlabel GFP Axl2 (27), menunjukkan perilaku yang mirip dengan Mid2-iRFP. (Gambar S1 dan Video S3). Axl2-GFP yang baru disintesis didistribusikan melalui membran ER seperti Mid2-iRFP (Gambar S1, A dan B), dan berlokasi bersama dengan Mid2-iRFP di sebagian besar ERES (Gambar S1, B hingga D). Panel 1 dan 2 dari Gambar 1. S1C menunjukkan dua contoh tipikal ERES di mana dua kargo transmembran tumpang tindih. Dalam kasus ini, kedua barang tersebut masuk ke ERES bersama-sama (Gambar S1E, Panel 3 dan Video S3).
Sel sec31-1 yang mengekspresikan sekresi yang diinduksi galaktosa, Gas1-GFP (GPI-AP, hijau) dan Mid2-iRFP (TMP, biru) dan pelabelan ERES konstitutif Sec13-mCherry (ERES, magenta) ditempatkan pada suhu 37 °C. Setelah diinkubasi selama 30 menit pada suhu tersebut, pindahkan ke 24 °C untuk melepaskan blok sekresi, dan ambil gambar dengan SCLIM setelah 20 menit. (A hingga C) Gambar proyeksi 2D representatif (A; skala bar, 1μm) atau gambar belahan sel 3D (B dan C; satuan skala, 0,456μm) dari kargo dan 10 penampang z yang ditandai oleh ERES. Panel bawah pada (B) dan panel pada (C) menampilkan gambar yang diproses untuk hanya menampilkan barang yang ada di ERES (magenta) [Gas1-GFP (abu-abu) dan Mid2-iRFP (biru muda)]. (C) Panah terbuka: ERES hanya membawa satu bagian kargo (1 hingga 4). Panah abu-abu: ERES berisi kargo terpisah (5). Panah putih padat: ERES berisi kargo yang berada di lokasi yang sama. Di bawah: ERES tunggal yang dipilih hanya berisi Gas1-GFP (1) atau Mid2-iRFP (2). Skala bar, 100 nm. (D) Kuantifikasi fotomikrograf yang dijelaskan dalam (C). Persentase rata-rata ERES yang hanya berisi satu kargo (Gas1-GFP atau Mid2-iRFP), kargo terpisah, dan kargo yang tumpang tindih. Dalam tiga percobaan independen, n=432 dalam 54 sel. Batang kesalahan = SD. Uji t tidak berpasangan dua arah. *** P = 0,0002. (E) Gambar 3D dari ERES terpilih dari kargo yang dikarantina yang ditandai dengan (C). Gas1-GFP (hijau) (3) atau Mid2-iRFP (biru) (4) memasuki ERES (magenta) dari satu sisi dan dibatasi pada area kecil di dalam ERES. Terkadang, kedua jenis kargo memasuki ERES yang sama (5) dari sisi yang sama dan dibatasi pada area terisolasi di dalam ERES. Skala bar, 100 nm.
Selanjutnya, kami menguji hipotesis bahwa seramida rantai asil panjang (C26) yang ada di membran ER mendorong pengelompokan dan penyortiran spesifik Gas1 ke dalam ERES selektif. Untuk tujuan ini, kami menggunakan strain ragi GhLag1 yang dimodifikasi, di mana dua sintase seramida endogen Lag1 dan Lac1 digantikan oleh GhLag1 (homolog Lag1 dari kapas), menghasilkan strain ragi dengan membran sel seramida yang lebih pendek daripada tipe liar (Gambar 3A) (28). Analisis spektrometri massa (MS) menunjukkan bahwa pada strain tipe liar, 95% dari total seramida adalah seramida rantai sangat panjang (C26), sedangkan pada GhLag1, 85% dari seramida adalah seramida rantai sangat panjang (C18 dan C16). ), hanya 2% dari seramida adalah seramida rantai sangat panjang (C26). Meskipun ceramida C18 dan C16 adalah ceramida utama yang terdeteksi di membran GhLag1 sejauh ini, analisis MS juga mengkonfirmasi bahwa jangkar GPI dari Gas1-GFP yang diekspresikan dalam strain GhLag1 mengandung ceramida C26, yang sebanding dengan lipid tipe liar. Kualitasnya sama (Gambar 3A) (26). Oleh karena itu, ini berarti bahwa enzim remodeling ceramida Cwh43 sangat selektif terhadap ceramida C26, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 26, enzim ini lebih memilih untuk menggabungkan jangkar GPI dari sejumlah kecil ceramida C26 dalam strain GhLag1. S2 (29). Meskipun demikian, membran sel GhLag1 pada dasarnya hanya mengandung ceramida C18-C16, sedangkan Gas1-GFP masih memiliki ceramida C26. Fakta ini menjadikan strain ini alat yang ideal untuk secara spesifik memecahkan masalah panjang rantai asil ceramida membran di ER. Peran hipotetis kelas dan penyortiran. Kemudian, pertama-tama kami mempelajari kemampuan C26 Gas1-GFP untuk terakumulasi dalam gugus di GhLag1 dengan alel mutan sensitif suhu sec31-1 melalui mikroskop fluoresensi konvensional, di mana hanya rantai panjang (C18-C16) yang ada di membran ER Ceramide (Gambar 3). Kami mengamati bahwa di sec31-1, sebagian besar Gas1-GFP terkonsentrasi dalam gugus, sedangkan Gas1-GFP di sec31-1 GhLag1 dengan membran ER ceramide panjang (C18-C16) sebagian besar tidak bergugus dan tersebar di seluruh membran ER. Lebih tepatnya, karena pengelompokan berbasis ceramide C26 terkait erat dengan ERES spesifik (Gambar 1), selanjutnya kami menyelidiki apakah proses ini juga melibatkan fungsi mekanisme protein ekspor ER. GPI-AP menggunakan sistem COPII khusus untuk ekspor ER, yang secara aktif diatur oleh penataan ulang struktural Ted1 pada bagian glikan dari jangkar GPI (30, 31). Glikan GPI rekombinan kemudian dikenali oleh kompleks reseptor kargo transmembran p24, yang pada gilirannya secara selektif merekrut Lst1, yang merupakan isoform spesifik dari subunit pengikat kargo COPII utama Sec24, membentuk vesikel COPII kaya GPI-AP yang diperlukan (31-33). Oleh karena itu, kami membuat mutan ganda yang menggabungkan penghapusan protein tunggal ini (komponen kompleks p24 Emp24, enzim penataan ulang glikan GPI Ted1 dan subunit COPII spesifik Lst1) dengan strain mutan sec31-1, dan mempelajari apakah mungkin untuk membentuk gugus Gas1-GFP (Gambar 3). Kami mengamati bahwa pada sec31-1emp24Δ dan sec31-1ted1Δ, Gas1-GFP sebagian besar tidak mengumpul dan tersebar di seluruh membran ER, seperti yang sebelumnya terlihat pada sec31-1 GhLag1, sedangkan pada sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP seperti sec31-1. Hasil ini menunjukkan bahwa selain keberadaan seramida C26 di membran ER, pengumpulan Gas1-GFP juga perlu berikatan dengan kompleks p24, dan tidak memerlukan perekrutan Lst1 spesifik. Kemudian, kami mengeksplorasi kemungkinan bahwa panjang rantai seramida di membran ER dapat mengatur pengikatan Gas1-GFP ke p24. Namun, kami menemukan bahwa keberadaan seramida C18-C16 di membran tidak memengaruhi glikan GPI yang direkonstruksi oleh kompleks p24 (Gambar S3 dan S4, A dan B) atau pengikatan ke GPI-AP dan ekspor GPI-AP. kemampuan. Merekrut subtipe COPII Lst1 (Gambar S4C). Oleh karena itu, pengelompokan yang bergantung pada seramida C26 tidak memerlukan interaksi protein dengan mekanisme protein ekspor ER yang berbeda, tetapi mendukung mekanisme penyortiran alternatif yang didorong oleh panjang lipid. Kemudian, kami menganalisis apakah panjang rantai asil seramida di membran ER penting untuk klasifikasi Gas1-GFP yang efektif sebagai ERES selektif. Karena Gas1 dalam strain GhLag1 dengan seramida rantai pendek meninggalkan ER dan memasuki membran plasma (Gambar S5), kami percaya bahwa jika penyortiran didorong oleh panjang rantai asil seramida, Gas1 dalam strain GhLag1 dapat dialihkan dan melewati barang ERES dengan membran yang sama.
(A) Membran sel GhLag1 terutama mengandung ceramida C18-C16 yang lebih pendek, sedangkan jangkar GPI Gas1-GFP masih memiliki IPC C26 yang sama seperti sel tipe liar. Atas: analisis panjang rantai asil ceramida dalam membran sel strain tipe liar (Wt) dan GhLag1p dengan spektrometri massa (MS). Data mewakili persentase total ceramida. Rata-rata dari tiga percobaan independen. Batang kesalahan = SD. Uji t tidak berpasangan dua arah. **** P ＜0,0001. Panel bawah: analisis MS panjang rantai asil IPC yang ada dalam jangkar GPI Gas1-GFP (GPI-IPC) yang diekspresikan dalam strain tipe liar dan GhLag1p. Data mewakili persentase total sinyal IPC. Rata-rata dari lima percobaan independen. Batang kesalahan = SD. Uji t tidak berpasangan dua arah. ns, tidak penting. P = 0,9134. (B) Mikrograf fluoresensi sel sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ dan sec31-1lst1Δ yang mengekspresikan Gas1-GFP yang diinduksi galaktosa diinkubasi pada suhu 37°C selama 30 menit dan kemudian dipindahkan ke suhu 24°C untuk dilakukan mikroskopi fluoresensi rutin. Panah putih: Gugus Gas1-GFP ER. Panah terbuka: Gas1-GFP yang tidak berkelompok tersebar di seluruh membran ER, menunjukkan pewarnaan cincin nuklir karakteristik ER. Skala bar, 5μm. (C) Kuantifikasi fotomikrograf yang dijelaskan pada (B). Persentase rata-rata sel dengan struktur Gas1-GFP bintik-bintik. Dalam tiga percobaan independen, n≥300 sel. Batang kesalahan = SD. Uji t tidak berpasangan dua arah. **** P ＜0,0001.
Untuk menyelesaikan masalah ini secara langsung, kami melakukan visualisasi SCLIM dari Gas1-GFP dan Mid2-iRFP pada GhLag1 dengan alel mutan sensitif suhu sec31-1 (Gambar 4 dan Video S4). Setelah ER dipertahankan pada suhu 37°C dan kemudian dilepaskan pada suhu 24°C, sebagian besar Gas1-GFP yang baru disintesis tidak mengumpul dan tersebar di seluruh membran ER, seperti yang diamati oleh mikroskop konvensional (Gambar 4, A dan B). Selain itu, sebagian besar ERES (67%) mencakup dua jenis kargo yang berlokasi bersamaan di dalamnya (Gambar 4D). Panel 1 dan 2 pada Gambar 4C menunjukkan dua contoh tipikal ERES dengan Gas1-GFP dan Mid2-GFP yang tumpang tindih. Selain itu, kedua barang tersebut direkrut ke dalam ERES yang sama (Gambar 4E, panel 3 dan video S4). Oleh karena itu, hasil penelitian kami menunjukkan bahwa panjang rantai asil seramida dalam membran ER merupakan penentu penting agregasi dan klasifikasi protein ER.
Sel Sec31-1 GhLag1 yang mengekspresikan sekresi yang diinduksi galaktosa, Gas1-GFP (GPI-AP, hijau) dan Mid2-iRFP (TMP, biru) dan Sec13-mCherry berlabel ERES konstitutif (ERES, magenta) diinkubasi pada suhu 37°C. Lanjutkan selama 30 menit, turunkan suhu menjadi 24°C untuk melepaskan sekresi, dan ambil gambar dengan SCLIM setelah 20 menit. (A hingga C) Gambar proyeksi 2D representatif (A; skala bar, 1μm) atau gambar belahan sel 3D (B dan C; satuan skala, 0,45μm) dari 10 penampang z yang ditandai dengan kargo dan ERES. Panel bawah pada (B) dan panel pada (C) menampilkan gambar yang diproses untuk hanya menampilkan barang yang ada di ERES (magenta) [Gas1-GFP (abu-abu) dan Mid2-iRFP (biru muda)]. (C) Panah putih terisi: ERES, barang tumpang tindih. Panah terbuka: ERES hanya berisi satu item. Panel bawah: ERES yang dipilih memiliki barang tumpang tindih (1 dan 2) yang ditandai pada (C). Skala bar, 100 nm. (D) Kuantifikasi fotomikrograf yang dijelaskan pada (C). Pada unit sec31-1 dan sec31-1 GhLag1, hanya satu kargo (Gas1-GFP atau Mid2-iRFP) yang disertakan, dan persentase rata-rata ERES untuk kargo terisolasi dan kargo tumpang tindih. Dalam tiga percobaan independen, n = 432 dalam 54 sel (sec31-1) dan n = 430 dalam 47 sel (sec31-1 GhLag1). Batang kesalahan = SD. Uji t tidak berpasangan dua arah. *** P = 0,0002 (sec31-1) dan ** P = 0,0031 (sec31-1 GhLag1). (E) Gambar 3D ERES terpilih dengan muatan tumpang tindih (3) yang ditandai pada (C). Gas1-GFP (hijau) dan Mid2-iRFP (biru) mendekati ERES (magenta) dari sisi yang sama dan tetap berada di area terbatas ERES yang sama. Skala bar, 100 nm.
Studi ini memberikan bukti langsung in vivo bahwa muatan protein berbasis lipid diklasifikasikan ke dalam situs ekspor selektif di jalur sekresi, dan mengungkapkan pentingnya panjang rantai asil untuk selektivitas klasifikasi. Menggunakan teknik mikroskopis yang canggih dan mutakhir yang disebut SCLIM, kami mendemonstrasikan Gas1-GFP yang baru disintesis (GPI-AP membran plasma utama dengan bagian lipid seramida rantai asil yang sangat panjang (C26)) pada ragi. Daerah yang berkelompok di ER diskrit dikaitkan dengan ERES spesifik, sementara protein yang disekresikan transmembran didistribusikan di seluruh membran ER (Gambar 1). Selain itu, kedua jenis barang ini memasuki ERES yang berbeda secara selektif (Gambar 2). Panjang rantai asil seramida seluler di membran berkurang dari C26 menjadi C18-C16, gugus Gas1-GFP terganggu ke dalam wilayah ER diskrit, dan Gas1-GFP dialihkan untuk meninggalkan ER bersama protein transmembran melalui ERES yang sama (Gambar 3 dan Gambar 3). 4).
Meskipun GPI-AP menggunakan mekanisme protein khusus untuk keluar dari ER, kami menemukan bahwa pemisahan yang bergantung pada seramida C26 tidak bergantung pada interaksi protein diferensial yang dapat menyebabkan spesialisasi ERES (Gambar S4 dan S5). Sebaliknya, temuan kami mendukung mekanisme klasifikasi alternatif yang didorong oleh pengelompokan protein berbasis lipid dan selanjutnya pengecualian kargo lain. Pengamatan kami menunjukkan bahwa wilayah atau gugus Gas1-GFP yang terkait dengan ERES tertentu tidak memiliki protein sekresi transmembran Mid2-iRFP, yang menunjukkan bahwa gugus GPI-AP yang bergantung pada seramida C26 akan memfasilitasi masuknya protein tersebut ke ERES yang relevan, dan pada saat yang sama, mengecualikan sekresi transmembran yang masuk ke ERES tertentu ini (Gambar 1 dan 2). Sebaliknya, keberadaan seramida C18-C16 di membran ER tidak menyebabkan GPI-AP membentuk wilayah atau gugus, sehingga mereka tidak mengecualikan atau mengganti protein sekresi transmembran ke ERES yang sama (Gambar 3 dan 4). Oleh karena itu, kami mengusulkan bahwa seramida C26 mendorong pemisahan dan klasifikasi dengan memfasilitasi pengelompokan protein yang terkait dengan ERES spesifik.
Bagaimana cara mencapai pengelompokan yang bergantung pada seramida C26 ke area ER tertentu? Kecenderungan seramida membran untuk terpisah secara lateral dapat menyebabkan GPI-AP dan seramida C26 membentuk lipid kecil dan teratur secara instan dalam lingkungan lipid yang lebih tidak teratur dari membran ER yang mengandung gliserolipid yang lebih pendek dan tidak jenuh. Gugus berkualitas (17, 18). Gugus sementara kecil ini dapat lebih lanjut menyatu menjadi gugus yang lebih besar dan lebih stabil setelah berikatan dengan kompleks p24 (34). Sesuai dengan hal ini, kami menunjukkan bahwa C26 Gas1-GFP perlu berinteraksi dengan kompleks p24 untuk membentuk gugus yang lebih besar dan terlihat (Gambar 3). Kompleks p24 adalah oligomer heterozigot yang terdiri dari empat protein transmembran p24 yang berbeda pada ragi (35), yang menyediakan pengikatan multivalen, yang dapat menyebabkan ikatan silang gugus GPI-AP kecil, sehingga menghasilkan gugus stabil yang lebih besar (34). Interaksi antara domain eksternal protein GPI-AP juga dapat berkontribusi pada agregasinya, seperti yang ditunjukkan selama transportasi Golgi pada sel epitel terpolarisasi mamalia (36). Namun, ketika seramida C18-C16 hadir di membran ER, ketika kompleks p24 mengikat Gas1-GFP, gugus terpisah yang besar tidak akan terbentuk. Mekanisme yang mendasarinya mungkin bergantung pada sifat fisik dan kimia spesifik dari seramida rantai asil panjang. Studi biofisika membran buatan menunjukkan bahwa meskipun seramida rantai asil panjang (C24) dan pendek (C18-C16) dapat menyebabkan pemisahan fase, hanya seramida rantai asil panjang (C24) yang dapat meningkatkan kelengkungan tinggi dan pembengkokan film untuk membentuk kembali film tersebut. Melalui referensi timbal balik (17, 37, 38). Telah ditunjukkan bahwa heliks transmembran TMED2, homolog manusia dari Emp24, berinteraksi secara selektif dengan sfingomielin berbasis seramida C18 di lobulus sitoplasma (39). Dengan menggunakan simulasi dinamika molekuler (MD), kami menemukan bahwa seramida C18 dan C26 terakumulasi di sekitar lobulus sitoplasma heliks transmembran Emp24, dan keduanya memiliki preferensi yang serupa (Gambar S6). Perlu dicatat bahwa ini menunjukkan bahwa heliks transmembran Emp24 dapat menyebabkan distribusi lipid yang asimetris di membran. Ini adalah hasil terbaru berdasarkan sel mamalia. Simulasi MD serupa juga menunjukkan adanya lipid eter (40). Oleh karena itu, kami berspekulasi bahwa seramida C26 di dua lobulus ER26 diperkaya secara lokal. Ketika GPI-AP di lobulus luminal secara langsung mengikat p24 multivalen dan akumulasi seramida C26 di sekitar p24 di lobulus sitoplasma, hal ini dapat mendorong agregasi protein dan kelengkungan membran yang menyertainya melalui jari-jari (41), menyebabkan GPI-AP terpisah menjadi daerah-daerah diskrit yang berdekatan dengan ERES, yang juga mendukung daerah-daerah yang sangat melengkung dari membran ER (42). Laporan sebelumnya mendukung mekanisme yang diusulkan (43, 44). Pengikatan multivalen oligolektin, patogen, atau antibodi ke glikosfingolipid (GSL) berbasis seramida pada membran plasma memicu agregasi GSL yang besar, meningkatkan pemisahan fase, dan menyebabkan deformasi dan internalisasi membran (44). Iwabuchi dkk. (43) Ditemukan bahwa dengan adanya rantai asil panjang (C24) tetapi bukan rantai asil pendek (C16), ligan multivalen yang terikat pada GSL laktosilseramida menginduksi pembentukan gugus besar dan invaginasi membran, dan transduksi sinyal yang dimediasi Lyn sitoplasma pada lapisan saling bertautan dengan rantai asil pada neutrofil yang berpasangan.
Pada sel epitel terpolarisasi mamalia, konsentrasi jaringan anti-Golgi (TGN) hingga tingkat membran plasma apikal mengontrol pemisahan dan penyortiran GPI-AP (10, 45). Agregasi ini didorong oleh oligomerisasi GPI-AP (36), tetapi mungkin juga bergantung pada panjang rantai seramida yang kita temukan pada ragi. Meskipun GPI-AP mamalia memiliki jangkar berbasis lipid eter, dan struktur kimianya sangat berbeda dari seramida rantai asil yang sangat panjang, sebuah studi baru-baru ini menemukan bahwa kedua lipid tersebut memiliki sifat fisik dan kimia serta fungsi yang serupa secara evolusioner (40). Oleh karena itu, bagian lipid eter pada sel mamalia mungkin mirip dengan seramida C26 pada ragi, dan perannya adalah untuk berasosiasi dengan seramida rantai panjang di membran untuk mendorong agregasi dan penyortiran GPI-AP. Meskipun kemungkinan ini masih perlu diuji secara langsung, temuan sebelumnya mendukung bahwa pengangkutan seramida rantai asil panjang ke badan Golgi tidak dilakukan oleh protein transfer sitoplasma, tetapi bergantung pada sintesis jangkar GPI seperti pada ragi. Oleh karena itu, mekanisme konservatif evolusioner tampaknya mampu secara selektif mengangkut seramida rantai asil yang sangat panjang dan GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) dalam vesikel pengangkut yang sama.
Pada sistem sel epitel terpolarisasi ragi dan mamalia, agregasi GPI-AP dan pemisahan dari protein membran plasma lainnya semuanya terjadi sebelum mencapai permukaan sel. Paladino dkk. (48) menemukan bahwa pada TGN sel epitel terpolarisasi mamalia, pengelompokan GPI-AP tidak hanya diperlukan untuk klasifikasi selektif GPI-AP ke membran plasma apikal, tetapi juga mengatur organisasi pengelompokan GPI-AP dan aktivitas biologisnya. Pada ragi, penelitian ini menunjukkan bahwa gugus GPI-AP yang bergantung pada seramida C26 pada ER dapat mengatur organisasi gugus dan aktivitas fungsional GPI-AP pada membran plasma (24, 49). Konsisten dengan model ini, sel GhLag1 alergi terhadap inhibitor GPI atau obat yang memengaruhi integritas dinding sel (28), dan kebutuhan akan gugus Gas1-GFP fungsional (49) dari proyeksi seramida ujung pada perkawinan sel ragi menunjukkan kemungkinan konsekuensi fisiologis pada sel hLag1. Kesalahan GPI-AP. Namun, pengujian lebih lanjut mengenai apakah organisasi fungsional permukaan sel telah diprogram dari ER dengan metode penyortiran berdasarkan panjang lipid akan menjadi subjek penelitian kami di masa mendatang.
Strain Saccharomyces cerevisiae yang digunakan dalam penelitian ini tercantum dalam Tabel S1. Strain MMY1583 dan MMY1635 dari SCLIM untuk pencitraan sel hidup dibangun dengan latar belakang W303. Strain yang mengekspresikan Sec13-mCherry dengan tag protein fluoresen ini dibangun menggunakan metode berbasis reaksi rantai polimerase (PCR) dengan plasmid pFA6a sebagai templat (23). Strain yang mengekspresikan Mid2-iRFP yang diberi label protein fluoresen di bawah kendali promotor GAL1 dibangun sebagai berikut. Amplifikasi PCR dari sekuens iRFP-KanMx dari vektor pKTiRFP-KAN (hadiah dari E. O'Shea, nomor plasmid Addgene 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; pengidentifikasi sumber daya penelitian (RRID): Addgene_64687) dan dimasukkan ke dalam C-terminus Mid2 endogen. Setelah sekuens genom Mid2-iRFP diamplifikasi dan dikloning ke dalam promotor GAL1, sekuens tersebut diintegrasikan ke dalam situs Not I-Sac I dari plasmid integrasi pRS306. Plasmid pRGS7 yang dihasilkan kemudian dilinearisasi dengan Pst I untuk diintegrasikan ke dalam lokus URA3.
Gen fusi Gas1-GFP diekspresikan di bawah kendali promotor GAL1 dalam plasmid sentromer (CEN), yang konstruksinya sebagai berikut. Urutan Gas1-GFP diamplifikasi dengan PCR dari plasmid pRS416-GAS1-GFP (24) (hadiah dari L. Popolo) dan dikloning ke situs Xma I–Xho I dari plasmid CEN pBEVY-GL LEU2 (hadiah dari C. Miller; nomor plasmid Addgene 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Plasmid yang dihasilkan diberi nama pRGS6. Gen fusi Axl2-GFP juga diekspresikan di bawah kendali promotor GAL1 dari vektor pBEVY-GL LEU2, dan konstruksinya adalah sebagai berikut. Urutan Axl2-GFP diamplifikasi dari plasmid pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) dengan PCR, dan dikloning ke situs Bam HI-Pst I dari vektor pBEVY-GL LEU2. Plasmid yang dihasilkan diberi nama pRGS12. Urutan oligonukleotida yang digunakan dalam penelitian ini tercantum dalam Tabel S2.
Strain tersebut ditambahkan dengan 0,2% adenin dan 2% glukosa [YP-dekstrosa (YPD)], 2% raffinosa [YP-raffinosa], media protein ekstrak ragi kaya protein (YP) (1% ekstrak ragi dan 2% protein protein (YPR)] atau 2% galaktosa [YP-galaktosa (YPG)] sebagai sumber karbon, atau dalam media minimal sintetik (0,15% basa nitrogen ragi dan 0,5% amonium sulfat) untuk melengkapi asam amino dan basa yang dibutuhkan untuk nutrisi, dan mengandung 2% glukosa (media minimal glukosa sintetik) atau 2% galaktosa (media minimal galaktosa sintetik) sebagai sumber karbon.
Untuk pencitraan waktu nyata, sel mutan sec31-1 yang sensitif terhadap suhu yang mengekspresikan konstruksi di bawah promotor GAL1 ditumbuhkan dalam medium YPR pada suhu 24°C semalaman hingga fase pertengahan logaritmik. Setelah induksi dalam YPG pada suhu 24°C selama 1 jam, sel diinkubasi dalam SG pada suhu 37°C selama 30 menit, dan kemudian dipindahkan ke suhu 24°C untuk melepaskan diri dari blok sekresi. Concanavalin A digunakan untuk memfiksasi sel pada slide kaca dan diimajinasikan dengan SCLIM. SCLIM merupakan kombinasi dari mikroskop fluoresensi terbalik Olympus IX-71 dan lensa minyak UPlanSApo 100×1,4 bukaan numerik (Olympus), pemindai konfokal cakram berputar berkecepatan tinggi dan rasio sinyal-ke-derau tinggi (Yokogawa Electric), spektrometer khusus, dan pendingin khusus. Penguat citra sistem (Hamamatsu Photonics) dapat menyediakan sistem lensa pembesar dengan perbesaran akhir ×266,7 dan kamera perangkat kopling muatan yang memperbanyak elektron (Hamamatsu Photonics) (21). Akuisisi citra dilakukan oleh perangkat lunak khusus (Yokogawa Electric). Untuk citra 3D, kami menggunakan aktuator piezoelektrik buatan khusus untuk menggetarkan lensa objektif secara vertikal, dan mengumpulkan bagian optik yang berjarak 100 nm dalam tumpukan. Citra tumpukan Z dikonversi menjadi data voxel 3D, dan fungsi sebaran titik teoritis yang digunakan untuk mikroskop konfokal cakram berputar digunakan untuk pemrosesan dekonvolusi oleh perangkat lunak Volocity (PerkinElmer). Dengan menggunakan perangkat lunak Volocity untuk secara otomatis menentukan ambang batas analisis kolokasi, ERES termasuk kargo diukur. Analisis pemindaian garis dilakukan menggunakan perangkat lunak MetaMorph (Molecular Devices).
Gunakan perangkat lunak GraphPad Prism untuk menentukan signifikansi statistik. Untuk uji t Student dua arah dan uji analisis varians (ANOVA) satu arah biasa, perbedaan antar kelompok dianggap memiliki dampak signifikan pada P <0,05 (*).
Untuk mikroskop fluoresensi Gas1-GFP, sel fase log ditumbuhkan semalaman dalam YPD dan dikumpulkan dengan sentrifugasi, dicuci dua kali dengan larutan garam fosfat, dan diinkubasi di atas es setidaknya selama 15 menit, dan kemudian dilanjutkan di bawah mikroskop seperti yang dijelaskan sebelumnya (Lihat 24). Mikroskop Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) yang dilengkapi dengan lensa objektif, filter L5 (GFP), kamera Hamamatsu dan perangkat lunak Application Suite X (LAS X) digunakan untuk akuisisi.
Sampel didenaturasi dengan buffer sampel SDS pada suhu 65°C selama 10 menit, kemudian dipisahkan dengan elektroforesis gel SDS-poliakrilamida (PAGE). Untuk analisis imunoblotting, 10 μl sampel dimuat per lajur. Antibodi primer: Gunakan antibodi poliklonal kelinci anti-Gas1 dengan pengenceran 1:3000, antibodi poliklonal kelinci anti-Emp24 dengan pengenceran 1:500, dan antibodi poliklonal kelinci anti-GFP (hadiah dari H. Riezman) dengan pengenceran 1:3000. Antibodi monoklonal tikus anti-Pgk1 digunakan dengan pengenceran 1:5000 (hadiah dari J. de la Cruz). Antibodi sekunder: Imunoglobulin G (IgG) kambing anti-kelinci terkonjugasi peroksidase lobak (HRP) digunakan dengan pengenceran 1:3000 (Pierce). Antibodi IgG anti-tikus yang dikonjugasikan dengan HRP digunakan pada pengenceran 1:3000 (Pierce). Zona respons imun diamati dengan metode kemiluminesensi menggunakan reagen SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific).
Seperti yang dijelaskan dalam (31), percobaan imunopresipitasi alami dilakukan pada fraksi ER yang diperkaya. Singkatnya, cuci sel ragi dengan buffer TNE [50 mM tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM fenilmetilsulfonil fluorida dan campuran penghambat protease] pada 600 nm (OD600) dengan kerapatan optik 100 sebanyak dua kali. Sel dipecah dengan manik-manik kaca, dan kemudian sisa sel dan manik-manik kaca dihilangkan dengan sentrifugasi. Supernatan kemudian disentrifugasi pada 17.000 g selama 15 menit pada suhu 4°C. Pelet diresuspensikan dalam TNE dan saponin digitalis ditambahkan hingga konsentrasi akhir 1%. Suspensi diinkubasi selama 1 jam dengan pengadukan pada suhu 4°C, kemudian komponen yang tidak larut dihilangkan dengan sentrifugasi pada 13.000 g pada suhu 4°C selama 60 menit. Untuk imunopresipitasi Gas1-GFP, pertama-tama sampel diinkubasi terlebih dahulu dengan manik-manik agarosa kosong (ChromoTek) pada suhu 4°C selama 1 jam, kemudian diinkubasi dengan GFP-Trap_A (ChromoTek) pada suhu 4°C selama 3 jam. Manik-manik yang telah diimunopresipitasi dicuci lima kali dengan TNE yang mengandung 0,2% digoxigenin, dielusi dengan buffer sampel SDS, dipisahkan pada SDS-PAGE, dan dianalisis dengan imunoblotting.
Seperti yang dijelaskan dalam (31), penentuan ikatan silang dilakukan pada fraksi ER yang diperkaya. Secara singkat, fraksi ER yang diperkaya diinkubasi dengan 0,5 mM dithiobis(succinimidyl propionate) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20°C, 20 menit). Reaksi ikatan silang dihentikan dengan menambahkan glisin (konsentrasi akhir 50 mM, 5 menit, 20°C).
Seperti yang dijelaskan sebelumnya (50), analisis MS dari seramida pada strain tipe liar dan GhLag1 dilakukan. Singkatnya, sel ditumbuhkan hingga fase eksponensial (3 hingga 4 unit OD600/ml) dalam YPD pada suhu 30°C, dan 25×107 sel dipanen. Metabolisme sel dihentikan dengan asam trikloroasetat. Gunakan pelarut ekstraksi [etanol, air, eter, piridin dan amonium hidroksida 4,2 N (15:15:5:1:0,018 v/v)] dan 1,2 nmol standar internal seramida C17 (860517, lipid polar Avanti). Gunakan reagen monometilamina [metanol, air, n-butanol dan larutan metilamina (4:3:1:5 v/v)] untuk melakukan hidrolisis basa ringan pada ekstrak, dan kemudian gunakan n-butanol jenuh air untuk menghilangkan garam. Akhirnya, ekstrak tersebut dilarutkan kembali dalam pelarut mode positif [kloroform/metanol/air (2:7:1) + 5 mM amonium asetat] dan diinjeksikan ke dalam spektrometer massa. Pemantauan multi-reaksi (MRM) dilakukan untuk identifikasi dan kuantifikasi molekul sfingolipid. Spektrometer massa kuadrupol tersier TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) dilengkapi dengan sumber ion nanoflow robotik Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) untuk analisis lipid. Energi tumbukan dioptimalkan untuk setiap kategori seramida. Data MS diperoleh dalam mode positif. Untuk setiap replikasi biologis, sinyal lipid adalah median dari tiga pengukuran independen.
Seperti yang dijelaskan dalam (31), sel (800×107) yang mengekspresikan Gas1-GFP dikenakan imunopresipitasi alami. Gas1-GFP yang dimurnikan dipisahkan dengan SDS-PAGE dan dipindahkan ke membran polivinilidena fluorida (PVDF). Protein divisualisasikan dengan mewarnai PVDF dengan amida hitam. Pita Gas1-GFP dipotong dari PVDF dan dicuci 5 kali dengan metanol dan sekali dengan air kualitas kromatografi cair-MS (LC-MS). Dengan menginkubasi potongan membran dengan 500μl 0,3 M NaOAc (pH 4,0), buffer dan 500μl campuran natrium nitrit 1 M yang baru dilarutkan pada suhu 37°C selama 3 jam, fraksi lipid dilepaskan dari Gas1-GFP dan dilisiskan. Pelepasan inosin fosfat seramida antara glukosamin dan inositol (51). Setelah itu, strip membran dicuci empat kali dengan air kualitas LC-MS, dikeringkan pada suhu kamar, dan disimpan dalam atmosfer nitrogen pada suhu -80°C hingga analisis. Sebagai kontrol, sampel kosong membran PVDF digunakan untuk setiap percobaan. Lipid yang diekstrak dari Gas1-GFP kemudian dianalisis dengan MS seperti yang dijelaskan (50). Singkatnya, strip PVDF yang mengandung lipid GPI diresuspensikan dalam 75μl pelarut cetakan negatif [kloroform/metanol (1:2) + 5 mM amonium asetat] dan dilewatkan melalui ionisasi elektrospray (ESI)-MRM/MS Analisis spesies sfingolipid (TSQ Vantage). Dalam hal ini, data MS diperoleh dalam mode ion negatif.
Seperti yang disebutkan sebelumnya, bagian lipid dari jangkar GPI dipisahkan dari GPI-AP berlabel [3H]-inositol (16). Lipid dipisahkan dengan kromatografi lapis tipis menggunakan sistem pelarut (55:45:10 kloroform-metanol-0,25% KCl) dan divisualisasikan menggunakan FLA-7000 (Fujifilm).
Sel yang mengekspresikan Gas1-GFP (600×10⁷) dicuci dua kali dengan buffer TNE, dan dihancurkan dengan manik-manik kaca, kemudian disentrifugasi untuk menghilangkan sisa sel dan manik-manik kaca. Supernatan kemudian disentrifugasi pada 17.000 g selama 1 jam pada suhu 4°C. Pelet dicuci dalam TNE dan diinkubasi dengan 1 U PI-PLC (Invitrogen) dalam TNE yang mengandung 0,2% saponin digitalis selama 1 jam pada suhu 37°C. Setelah perlakuan enzim, membran dihilangkan dengan sentrifugasi pada 17.000 g pada suhu 4°C selama 1 jam. Untuk mengimunopresipitasi Gas1-GFP, supernatan diinkubasi dengan GFP-Trap_A (ChromoTek) pada suhu 4°C semalaman. Gas1-GFP murni yang dipisahkan dengan SDS-PAGE diwarnai dengan Coomassie brilliant blue. Pita pewarnaan Gas1-GFP dipotong dari area abu-abu di sekitar akuaduk, kemudian setelah alkilasi dengan iodoasetamida dan reduksi dengan ditiotreitol, dilakukan pencernaan dalam gel dengan tripsin. Ekstrak dan keringkan peptida triptik dan peptida dengan glikan GPI. Peptida kering dilarutkan dalam 20 μl air. Suntikkan sebagian (8 μl) ke dalam LC. Kolom oktadesilsilana (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5; diameter dalam 150 mm × 1,0 mm; Nomura Chemical, Prefektur Aichi, Jepang) digunakan untuk memisahkan peptida di bawah kondisi gradien tertentu. Fase gerak adalah pelarut A (asam format 0,08%) dan pelarut B (asam format 0,15% dalam asetonitril 80%). Sistem HPLC Accela (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) digunakan untuk mengelusi kolom dengan pelarut A dalam waktu 55 menit dengan laju alir 50 μl min-1 selama 5 menit, kemudian konsentrasi pelarut B ditingkatkan menjadi 40%. Eluat terus menerus dimasukkan ke dalam sumber ion ESI, dan peptida triptik serta peptida dengan glikan GPI dianalisis menggunakan LTQ Orbitrap XL (spektrometer massa hibrida linear ion trap-orbitrap; Thermo Fisher Scientific). Dalam pengaturan MS, tegangan sumber kapiler diatur ke 4,5 kV, dan suhu kapiler transfer dijaga pada 300°C. Tegangan kapiler dan tegangan lensa tabung masing-masing diatur ke 15 V dan 50 V. Data MS diperoleh dalam mode ion positif (resolusi 60.000; akurasi massa 10 bagian per juta) dalam rentang massa 300/m/z dengan rasio massa/muatan (m/z) 3000. Data MS/MS diperoleh melalui perangkap ion di LTQ Orbitrap XL [3 digit pertama yang menjadi dasar data, disosiasi terinduksi tumbukan (CID)].
Simulasi MD dilakukan menggunakan perangkat lunak GROMACS (52) dan medan gaya MARTINI 2 (53-55). GUI CHARMM Membrane Builder (56, 57) kemudian digunakan untuk membangun lapisan ganda yang mengandung dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) dan Cer C18 atau DOPC dan Cer C26. Topologi dan koordinat Cer C26 diperoleh dari DXCE dengan menghilangkan manik-manik tambahan dari ekor sphingosine. Gunakan proses yang dijelaskan di bawah ini untuk menyeimbangkan lapisan ganda dan menjalankannya, kemudian gunakan koordinat terakhir dari sistem untuk membangun sistem yang mengandung Emp24. Domain transmembran Emp24 ragi (residu 173 hingga 193) dibangun sebagai α-helix menggunakan struktur molekul alat visual MD (VMD) (58). Kemudian, setelah menghilangkan lipid yang tumpang tindih, protein digranulasi secara kasar dan dimasukkan ke dalam lapisan ganda menggunakan GUI CHARMM. Sistem akhir mengandung 1202 DOPC dan 302 Cer C26 atau 1197 DOPC dan 295 Cer C18 dan Emp24. Ionisasi sistem hingga konsentrasi 0,150M. Empat replikasi independen dilakukan untuk dua komposisi lapisan ganda.
Lapisan ganda lipid diseimbangkan menggunakan proses GUI CHARMM, yang melibatkan minimisasi dan kemudian penyeimbangan 405.000 langkah, di mana batasan posisi secara bertahap dikurangi dan dihilangkan, dan langkah waktu ditingkatkan dari 0,005 ps menjadi 0,02 ps. Setelah ekuilibrasi, dihasilkan 6 µs dengan langkah waktu 0,02 ps. Setelah memasukkan Emp24, gunakan proses GUI CHARMM yang sama untuk meminimalkan dan menyeimbangkan sistem, lalu jalankan selama 8 detik dalam produksi.
Untuk semua sistem, selama proses penyeimbangan, tekanan dikendalikan oleh barostat Berendsen (59), dan selama proses produksi, tekanan dikendalikan oleh barostat Parrinello-Rahman (60). Dalam semua kasus, tekanan rata-rata adalah 1 bar dan skema kopling tekanan semi-isotropik digunakan. Dalam proses penyeimbangan dan produksi, termostat (61) dengan kalibrasi ulang kecepatan digunakan untuk menghubungkan suhu partikel protein, lipid, dan pelarut masing-masing. Selama seluruh operasi, suhu target adalah 310K. Interaksi non-ikatan dihitung dengan menghasilkan daftar pasangan menggunakan skema Verlet dengan toleransi buffer 0,005. Istilah Coulomb dihitung menggunakan medan reaksi dan jarak cut-off 1,1 nm. Istilah Vander Waals menggunakan skema cut-off dengan jarak cut-off 1,1 nm, dan skema cut-off Verlet digunakan untuk pergeseran potensial (62).
Dengan menggunakan VMD, panjang gelombang batas antara manik-manik fosfat DOPC atau manik-manik seramida AM1 dan protein adalah 0,7 nm, dan jumlah lipid yang berinteraksi dengan protein dihitung. Menurut rumus berikut, hitung faktor deplesi-enrichment (DE) seperti pada (63): Faktor DE = (jumlah total lipid dalam protein 0,7) dalam protein 0,7 (jumlah Cer dalam total lipid)
Nilai yang dilaporkan diperoleh sebagai nilai rata-rata, dan rentang kesalahan (error bar) adalah empat salinan independen dari SE. Signifikansi statistik faktor DE dihitung dengan uji t [(rata-rata faktor DE - 1) / SE]. Hitung nilai P dari distribusi satu sisi.
Alat GROMACS digunakan untuk menghitung peta kerapatan lateral 2D dari sistem yang mengandung Emp24 dalam 250 ns terakhir dari jejak. Untuk mendapatkan peta pengayaan/penipisan seramida, peta kerapatan Cer dibagi dengan jumlah peta Cer dan DOPC, lalu dibagi dengan konsentrasi Cer dalam tubuh. Skala peta warna yang sama digunakan.
Untuk materi tambahan artikel ini, silakan lihat http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Artikel ini merupakan artikel akses terbuka yang didistribusikan di bawah ketentuan Lisensi Creative Commons Attribution-Non-Commercial, yang mengizinkan penggunaan, distribusi, dan reproduksi dalam media apa pun, selama penggunaan akhir bukan untuk keuntungan komersial dan premisnya adalah bahwa karya asli tersebut benar. Referensi.
Catatan: Kami hanya meminta Anda untuk memberikan alamat email Anda agar orang yang Anda rekomendasikan ke halaman ini mengetahui bahwa Anda ingin mereka melihat email tersebut dan bahwa email tersebut bukan spam. Kami tidak akan menyimpan alamat email apa pun.
Pertanyaan ini digunakan untuk menguji apakah Anda adalah pengunjung dan mencegah pengiriman spam otomatis.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Linero), Sergio Lopez (Sergio Lopez), Miho Waga (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Pencitraan real-time resolusi tinggi 3D mengungkapkan pentingnya panjang rantai seramida untuk pemilahan protein di lokasi keluaran selektif.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Linero), Sergio Lopez (Sergio Lopez), Miho Waga (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Pencitraan real-time resolusi tinggi 3D mengungkapkan pentingnya panjang rantai seramida untuk pemilahan protein di lokasi keluaran selektif.
©2020 Asosiasi Amerika untuk Kemajuan Ilmu Pengetahuan. semua hak dilindungi undang-undang. AAAS adalah mitra dari HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef dan COUNTER. ScienceAdvanced ISSN 2375-2548.