Terima kasih telah mengunjungi nature.com. Versi peramban yang Anda gunakan memiliki dukungan CSS yang terbatas. Untuk pengalaman terbaik, kami sarankan menggunakan versi peramban terbaru (atau menonaktifkan mode kompatibilitas di Internet Explorer). Selain itu, untuk memastikan dukungan berkelanjutan, situs ini tidak akan menyertakan gaya atau JavaScript.
Hidrogen sulfida (H2S) memiliki berbagai efek fisiologis dan patologis pada tubuh manusia. Natrium hidrosulfida (NaHS) banyak digunakan sebagai alat farmakologis untuk mengevaluasi efek H2S dalam percobaan biologis. Meskipun hilangnya H2S dari larutan NaHS hanya membutuhkan beberapa menit, larutan NaHS telah digunakan sebagai senyawa donor untuk H2S dalam air minum pada beberapa penelitian hewan. Penelitian ini menyelidiki apakah air minum dengan konsentrasi NaHS 30 μM yang disiapkan dalam botol tikus/mencit dapat tetap stabil setidaknya selama 12–24 jam, seperti yang disarankan oleh beberapa penulis. Siapkan larutan NaHS (30 μM) dalam air minum dan segera tuangkan ke dalam botol air tikus/mencit. Sampel dikumpulkan dari ujung dan bagian dalam botol air pada waktu 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 dan 24 jam untuk mengukur kandungan sulfida menggunakan metode metilen biru. Selain itu, tikus jantan dan betina disuntik dengan NaHS (30 μM) selama dua minggu dan konsentrasi sulfida serum diukur setiap dua hari sekali selama minggu pertama dan pada akhir minggu kedua. Larutan NaHS dalam sampel yang diperoleh dari ujung botol air tidak stabil; larutan tersebut menurun sebesar 72% dan 75% setelah 12 dan 24 jam, berturut-turut. Pada sampel yang diperoleh dari bagian dalam botol air, penurunan NaHS tidak signifikan dalam waktu 2 jam; namun, larutan tersebut menurun sebesar 47% dan 72% setelah 12 dan 24 jam, berturut-turut. Suntikan NaHS tidak memengaruhi kadar sulfida serum pada tikus jantan dan betina. Kesimpulannya, larutan NaHS yang dibuat dari air minum tidak boleh digunakan untuk donasi H2S karena larutan tersebut tidak stabil. Rute pemberian ini akan membuat hewan terpapar jumlah NaHS yang tidak teratur dan lebih kecil dari yang diharapkan.
Hidrogen sulfida (H2S) telah digunakan sebagai racun sejak tahun 1700; namun, peran potensialnya sebagai molekul biosinyal endogen dijelaskan oleh Abe dan Kimura pada tahun 1996. Selama tiga dekade terakhir, banyak fungsi H2S dalam berbagai sistem manusia telah diuraikan, yang mengarah pada kesimpulan bahwa molekul donor H2S mungkin memiliki aplikasi klinis dalam pengobatan atau pengelolaan penyakit tertentu; lihat Chirino dkk. untuk tinjauan terbaru.
Natrium hidrosulfida (NaHS) telah banyak digunakan sebagai alat farmakologis untuk menilai efek H2S dalam banyak kultur sel dan penelitian hewan5,6,7,8. Namun, NaHS bukanlah donor H2S yang ideal karena cepat diubah menjadi H2S/HS- dalam larutan, mudah terkontaminasi dengan polisulfida, dan mudah teroksidasi dan menguap4,9. Dalam banyak percobaan biologi, NaHS dilarutkan dalam air, yang mengakibatkan penguapan pasif dan hilangnya H2S10,11,12, oksidasi spontan H2S11,12,13, dan fotolisis14. Sulfida dalam larutan awal hilang sangat cepat karena penguapan H2S11. Dalam wadah terbuka, waktu paruh (t1/2) H2S sekitar 5 menit, dan konsentrasinya menurun sekitar 13% per menit10. Meskipun hilangnya hidrogen sulfida dari larutan NaHS hanya membutuhkan beberapa menit, beberapa penelitian pada hewan telah menggunakan larutan NaHS sebagai sumber hidrogen sulfida dalam air minum selama 1–21 minggu, dengan mengganti larutan yang mengandung NaHS setiap 12–24 jam.15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 Praktik ini tidak sesuai dengan prinsip-prinsip penelitian ilmiah, karena dosis obat harus didasarkan pada penggunaannya pada spesies lain, terutama manusia.27
Penelitian praklinis dalam biomedis bertujuan untuk meningkatkan kualitas perawatan pasien atau hasil pengobatan. Namun, hasil sebagian besar penelitian pada hewan belum dapat diterapkan pada manusia28,29,30. Salah satu alasan kegagalan translasi ini adalah kurangnya perhatian terhadap kualitas metodologi penelitian pada hewan30. Oleh karena itu, tujuan penelitian ini adalah untuk menyelidiki apakah larutan NaHS 30 μM yang disiapkan dalam botol air minum tikus/marmut dapat tetap stabil dalam air minum selama 12–24 jam, seperti yang diklaim atau disarankan dalam beberapa penelitian.
Semua percobaan dalam penelitian ini dilakukan sesuai dengan pedoman yang diterbitkan untuk perawatan dan penggunaan hewan laboratorium di Iran31. Semua laporan percobaan dalam penelitian ini juga mengikuti pedoman ARRIVE32. Komite Etika Institut Ilmu Endokrin, Universitas Ilmu Kedokteran Shahid Beheshti, menyetujui semua prosedur percobaan dalam penelitian ini.
Seng asetat dihidrat (CAS: 5970-45-6) dan besi(III) klorida anhidrat (CAS: 7705-08-0) dibeli dari Biochem, Chemopahrama (Cosne-sur-Loire, Prancis). Natrium hidrosulfida hidrat (CAS: 207683-19-0) dan N,N-dimetil-p-fenilenediamin (DMPD) (CAS: 535-47-0) dibeli dari Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, AS). Isofluran dibeli dari Piramal (Bethlehem, PA, AS). Asam klorida (HCl) dibeli dari Merck (Darmstadt, Jerman).
Siapkan larutan NaHS (30 μM) dalam air minum dan segera tuangkan ke dalam botol air tikus/mencit. Konsentrasi ini dipilih berdasarkan banyak publikasi yang menggunakan NaHS sebagai sumber H2S; lihat bagian Diskusi. NaHS adalah molekul terhidrasi yang dapat mengandung berbagai jumlah air hidrasi (yaitu, NaHS•xH2O); menurut produsen, persentase NaHS yang digunakan dalam penelitian kami adalah 70,7% (yaitu, NaHS•1,3 H2O), dan kami memperhitungkan nilai ini dalam perhitungan kami, di mana kami menggunakan berat molekul 56,06 g/mol, yang merupakan berat molekul NaHS anhidrat. Air hidrasi (juga disebut air kristalisasi) adalah molekul air yang membentuk struktur kristal33. Hidrat memiliki sifat fisik dan termodinamika yang berbeda dibandingkan dengan anhidrat34.
Sebelum menambahkan NaHS ke air minum, ukur pH dan suhu pelarut. Segera tuangkan larutan NaHS ke dalam botol air tikus/mencit di dalam kandang hewan. Sampel dikumpulkan dari ujung dan dari bagian dalam botol air pada 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, dan 24 jam untuk mengukur kandungan sulfida. Pengukuran sulfida dilakukan segera setelah setiap pengambilan sampel. Kami mengambil sampel dari ujung tabung karena beberapa penelitian menunjukkan bahwa ukuran pori kecil tabung air dapat meminimalkan penguapan H2S15,19. Masalah ini tampaknya juga berlaku untuk larutan di dalam botol. Namun, hal ini tidak terjadi pada larutan di leher botol air, yang memiliki laju penguapan lebih tinggi dan mengalami autoksidasi; bahkan, hewan-hewan tersebut meminum air ini terlebih dahulu.
Tikus Wistar jantan dan betina digunakan dalam penelitian ini. Tikus-tikus tersebut ditempatkan dalam kandang polipropilen (2–3 tikus per kandang) di bawah kondisi standar (suhu 21–26 °C, kelembapan 32–40%) dengan 12 jam cahaya (pukul 7 pagi hingga 7 malam) dan 12 jam kegelapan (pukul 7 malam hingga 7 pagi). Tikus-tikus tersebut memiliki akses bebas ke air keran dan diberi makan pakan standar (Khorak Dam Pars Company, Tehran, Iran). Tikus Wistar betina (n=10, berat badan: 190–230 g) dan jantan (n=10, berat badan: 320–370 g) yang berusia sama (6 bulan) dibagi secara acak menjadi kelompok kontrol dan kelompok yang diberi perlakuan NaHS (30 μM) (n=5 per kelompok). Untuk menentukan ukuran sampel, kami menggunakan pendekatan KISS (Keep It Simple, Stupid), yang menggabungkan pengalaman sebelumnya dan analisis kekuatan35. Pertama, kami melakukan studi percontohan pada 3 tikus dan menentukan rata-rata kadar total sulfida serum dan deviasi standar (8,1 ± 0,81 μM). Kemudian, dengan mempertimbangkan kekuatan 80% dan mengasumsikan tingkat signifikansi dua sisi 5%, kami menentukan ukuran sampel awal (n = 5 berdasarkan literatur sebelumnya) yang sesuai dengan ukuran efek standar 2,02 dengan nilai yang telah ditentukan sebelumnya yang disarankan oleh Festing untuk menghitung ukuran sampel hewan percobaan35. Setelah mengalikan nilai ini dengan SD (2,02 × 0,81), ukuran efek yang diprediksi dapat dideteksi (1,6 μM) adalah 20%, yang dapat diterima. Ini berarti bahwa n = 5/kelompok cukup untuk mendeteksi perubahan rata-rata 20% antar kelompok. Tikus dibagi secara acak menjadi kelompok kontrol dan kelompok yang diberi perlakuan NaSH menggunakan fungsi acak perangkat lunak Excel 36 (Gambar Tambahan 1). Penyamaran dilakukan pada tingkat hasil, dan para peneliti yang melakukan pengukuran biokimia tidak mengetahui penugasan kelompok.
Kelompok NaHS dari kedua jenis kelamin diberi larutan NaHS 30 μM yang dicampur dalam air minum selama 2 minggu; larutan segar diberikan setiap 24 jam, selama waktu tersebut berat badan diukur. Sampel darah diambil dari ujung ekor semua tikus di bawah anestesi isoflurane setiap dua hari sekali pada akhir minggu pertama dan kedua. Sampel darah disentrifugasi pada 3000 g selama 10 menit, serum dipisahkan dan disimpan pada suhu –80°C untuk pengukuran selanjutnya kadar urea serum, kreatinin (Cr), dan total sulfida. Kadar urea serum ditentukan dengan metode urease enzimatik, dan kreatinin serum ditentukan dengan metode fotometrik Jaffe menggunakan kit yang tersedia secara komersial (Man Company, Tehran, Iran) dan alat analisis otomatis (Selectra E, nomor seri 0-2124, Belanda). Koefisien variasi intra- dan interassay untuk urea dan Cr kurang dari 2,5%.
Metode metilen biru (MB) digunakan untuk mengukur total sulfida dalam air minum dan serum yang mengandung NaHS; MB adalah metode yang paling umum digunakan untuk mengukur sulfida dalam larutan massal dan sampel biologis11,37. Metode MB dapat digunakan untuk memperkirakan total kumpulan sulfida38 dan mengukur sulfida anorganik dalam bentuk H2S, HS- dan S2 dalam fase air39. Dalam metode ini, sulfur diendapkan sebagai seng sulfida (ZnS) dengan adanya seng asetat11,38. Pengendapan seng asetat adalah metode yang paling banyak digunakan untuk memisahkan sulfida dari kromofor lainnya11. ZnS dilarutkan kembali menggunakan HCl11 dalam kondisi asam kuat. Sulfida bereaksi dengan DMPD dalam rasio stoikiometri 1:2 dalam reaksi yang dikatalisis oleh ferri klorida (Fe3+ bertindak sebagai agen pengoksidasi) untuk membentuk pewarna MB, yang dideteksi secara spektrofotometri pada 670 nm40,41. Batas deteksi metode MB adalah sekitar 1 μM11.
Dalam penelitian ini, 100 μL dari setiap sampel (larutan atau serum) ditambahkan ke dalam tabung; kemudian ditambahkan 200 μL seng asetat (1% b/v dalam air suling), 100 μL DMPD (20 mM dalam 7,2 M HCl), dan 133 μL FeCl3 (30 mM dalam 1,2 M HCl). Campuran diinkubasi pada suhu 37°C dalam gelap selama 30 menit. Larutan disentrifugasi pada 10.000 g selama 10 menit, dan absorbansi supernatan dibaca pada 670 nm menggunakan pembaca mikroplat (BioTek, MQX2000R2, Winooski, VT, USA). Konsentrasi sulfida ditentukan menggunakan kurva kalibrasi NaHS (0–100 μM) dalam ddH2O (Gambar Tambahan 2). Semua larutan yang digunakan untuk pengukuran disiapkan secara segar. Koefisien variasi intra- dan interassay untuk pengukuran sulfida masing-masing adalah 2,8% dan 3,4%. Kami juga menentukan total sulfida yang diperoleh dari sampel air minum dan serum yang mengandung natrium tiosulfat menggunakan metode sampel yang diperkaya42. Perolehan untuk sampel air minum dan serum yang mengandung natrium tiosulfat masing-masing adalah 91 ± 1,1% (n = 6) dan 93 ± 2,4% (n = 6).
Analisis statistik dilakukan menggunakan perangkat lunak GraphPad Prism versi 8.0.2 untuk Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, USA, www.graphpad.com). Uji t berpasangan digunakan untuk membandingkan suhu dan pH air minum sebelum dan setelah penambahan NaHS. Kehilangan H2S dalam larutan yang mengandung NaHS dihitung sebagai persentase penurunan dari penyerapan dasar, dan untuk menilai apakah kehilangan tersebut signifikan secara statistik, kami melakukan ANOVA satu arah berulang diikuti oleh uji perbandingan berganda Dunnett. Berat badan, urea serum, kreatinin serum, dan total sulfida serum dari waktu ke waktu dibandingkan antara tikus kontrol dan tikus yang diberi NaHS dari jenis kelamin yang berbeda menggunakan ANOVA campuran dua arah (antar-dalam) diikuti oleh uji post hoc Bonferroni. Nilai P dua arah < 0,05 dianggap signifikan secara statistik.
pH air minum adalah 7,60 ± 0,01 sebelum penambahan NaHS dan 7,71 ± 0,03 setelah penambahan NaHS (n = 13, p = 0,0029). Suhu air minum adalah 26,5 ± 0,2 dan menurun menjadi 26,2 ± 0,2 setelah penambahan NaHS (n = 13, p = 0,0128). Siapkan larutan NaHS 30 μM dalam air minum dan simpan dalam botol air. Larutan NaHS tidak stabil dan konsentrasinya menurun seiring waktu. Saat pengambilan sampel dari leher botol air, penurunan yang signifikan (68,0%) diamati dalam satu jam pertama, dan kandungan NaHS dalam larutan menurun sebesar 72% dan 75% setelah 12 dan 24 jam, masing-masing. Pada sampel yang diperoleh dari botol air, penurunan NaHS tidak signifikan hingga 2 jam, tetapi setelah 12 dan 24 jam telah menurun masing-masing sebesar 47% dan 72%. Data ini menunjukkan bahwa persentase NaHS dalam larutan 30 μM yang dibuat dalam air minum telah menurun menjadi sekitar seperempat dari nilai awal setelah 24 jam, terlepas dari lokasi pengambilan sampel (Gambar 1).
Stabilitas larutan NaHS (30 μM) dalam air minum pada botol tikus/mencit. Setelah persiapan larutan, sampel diambil dari ujung dan bagian dalam botol air. Data disajikan sebagai mean ± SD (n = 6/kelompok). * dan #, P < 0,05 dibandingkan dengan waktu 0. Foto botol air menunjukkan ujung (dengan bukaan) dan badan botol. Volume ujung botol sekitar 740 μL.
Konsentrasi NaHS dalam larutan 30 μM yang baru disiapkan adalah 30,3 ± 0,4 μM (kisaran: 28,7–31,9 μM, n = 12). Namun, setelah 24 jam, konsentrasi NaHS menurun ke nilai yang lebih rendah (rata-rata: 3,0 ± 0,6 μM). Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2, konsentrasi NaHS yang terpapar pada tikus tidak konstan selama periode penelitian.
Berat badan tikus betina meningkat secara signifikan seiring waktu (dari 205,2 ± 5,2 g menjadi 213,8 ​​± 7,0 g pada kelompok kontrol dan dari 204,0 ± 8,6 g menjadi 211,8 ± 7,5 g pada kelompok yang diberi NaHS); namun, perlakuan NaHS tidak berpengaruh pada berat badan (Gambar 3). Berat badan tikus jantan meningkat secara signifikan seiring waktu (dari 338,6 ± 8,3 g menjadi 352,4 ± 6,0 g pada kelompok kontrol dan dari 352,4 ± 5,9 g menjadi 363,2 ± 4,3 g pada kelompok yang diberi NaHS); namun, perlakuan NaHS tidak berpengaruh pada berat badan (Gambar 3).
Perubahan berat badan pada tikus betina dan jantan setelah pemberian NaHS (30 μM). Data disajikan sebagai mean ± SEM dan dibandingkan menggunakan analisis varians campuran dua arah (dalam-antar kelompok) dengan uji post hoc Bonferroni. n = 5 untuk setiap jenis kelamin dalam setiap kelompok.
Konsentrasi urea dan kreatin fosfat serum sebanding pada tikus kontrol dan tikus yang diberi NaSH sepanjang penelitian. Lebih lanjut, pemberian NaSH tidak memengaruhi konsentrasi urea dan kreatin kromium serum (Tabel 1).
Konsentrasi total sulfida serum awal sebanding antara tikus jantan (8,1 ± 0,5 μM vs. 9,3 ± 0,2 μM) dan betina (9,1 ± 1,0 μM vs. 6,1 ± 1,1 μM) kelompok kontrol dan yang diberi NaHS. Pemberian NaHS selama 14 hari tidak berpengaruh pada kadar total sulfida serum pada tikus jantan maupun betina (Gambar 4).
Perubahan konsentrasi total sulfida serum pada tikus jantan dan betina setelah pemberian NaHS (30 μM). Data disajikan sebagai mean ± SEM dan dibandingkan menggunakan analisis varians campuran dua arah (dalam-dalam) dengan uji post hoc Bonferroni. Masing-masing jenis kelamin, n = 5/kelompok.
Kesimpulan utama dari penelitian ini adalah bahwa air minum yang mengandung NaHS tidak stabil: hanya sekitar seperempat dari total kandungan sulfida awal yang dapat terdeteksi 24 jam setelah pengambilan sampel dari ujung dan bagian dalam botol air minum tikus/mencit. Lebih lanjut, tikus terpapar konsentrasi NaHS yang tidak stabil karena hilangnya H2S dalam larutan NaHS, dan penambahan NaHS ke air minum tidak memengaruhi berat badan, urea serum dan kromium kreatin, atau total sulfida serum.
Dalam penelitian ini, laju kehilangan H2S dari larutan NaHS 30 μM yang disiapkan dalam air minum adalah sekitar 3% per jam. Dalam larutan penyangga (natrium sulfida 100 μM dalam PBS 10 mM, pH 7,4), konsentrasi sulfida dilaporkan menurun sebesar 7% seiring waktu selama 8 jam¹¹. Sebelumnya, kami telah membela pemberian NaHS secara intraperitoneal dengan melaporkan bahwa laju kehilangan sulfida dari larutan NaHS 54 μM dalam air minum adalah sekitar 2,3% per jam (4%/jam dalam 12 jam pertama dan 1,4%/jam dalam 12 jam terakhir setelah persiapan)⁸. Studi sebelumnya⁴³ menemukan kehilangan H2S yang konstan dari larutan NaHS, terutama karena penguapan dan oksidasi. Bahkan tanpa penambahan gelembung, sulfida dalam larutan stok cepat hilang karena penguapan H2S¹¹. Penelitian menunjukkan bahwa selama proses pengenceran, yang memakan waktu sekitar 30–60 detik, sekitar 5–10% H2S hilang karena penguapan6. Untuk mencegah penguapan H2S dari larutan, para peneliti telah mengambil beberapa tindakan, termasuk pengadukan larutan secara perlahan12, menutup larutan stok dengan plastik6, dan meminimalkan paparan larutan terhadap udara, karena laju penguapan H2S bergantung pada antarmuka udara-cair.13 Oksidasi spontan H2S terutama terjadi karena ion logam transisi, khususnya besi feri, yang merupakan pengotor dalam air.13 Oksidasi H2S menghasilkan pembentukan polisulfida (atom sulfur yang dihubungkan oleh ikatan kovalen)11. Untuk menghindari oksidasinya, larutan yang mengandung H2S disiapkan dalam pelarut yang telah dihilangkan oksigennya44,45 dan kemudian dialiri argon atau nitrogen selama 20–30 menit untuk memastikan penghilangan oksigen.11,12,37,44,45,46 Asam dietilenetriaminapentaasetat (DTPA) adalah pengkelat logam (10–4 M) yang mencegah autoksidasi HS- dalam larutan aerobik. Tanpa DTPA, laju autoksidasi HS- kira-kira 50% selama kurang lebih 3 jam pada suhu 25°C37,47. Selain itu, karena oksidasi 1e-sulfida dikatalisis oleh sinar ultraviolet, larutan tersebut harus disimpan di atas es dan dilindungi dari cahaya11.
Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 5, NaHS berdisosiasi menjadi Na+ dan HS-6 ketika dilarutkan dalam air; disosiasi ini ditentukan oleh pK1 reaksi, yang bergantung pada suhu: pK1 = 3,122 + 1132/T, di mana T berkisar dari 5 hingga 30°C dan diukur dalam derajat Kelvin (K), K = °C + 273,1548. HS- memiliki pK2 yang tinggi (pK2 = 19), sehingga pada pH < 96,49, S2- tidak terbentuk atau terbentuk dalam jumlah yang sangat kecil. Sebaliknya, HS- bertindak sebagai basa dan menerima H+ dari molekul H2O, dan H2O bertindak sebagai asam dan diubah menjadi H2S dan OH-.
Pembentukan gas H2S terlarut dalam larutan NaHS (30 µM). aq, larutan berair; g, gas; l, cair. Semua perhitungan mengasumsikan bahwa pH air = 7,0 dan suhu air = 20 °C. Dibuat dengan BioRender.com.
Meskipun terdapat bukti bahwa larutan NaHS tidak stabil, beberapa penelitian pada hewan telah menggunakan larutan NaHS dalam air minum sebagai senyawa donor H2S15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 dengan durasi intervensi berkisar antara 1 hingga 21 minggu (Tabel 2). Selama penelitian ini, larutan NaHS diganti setiap 12 jam, 15, 17, 18, 24, 25 jam atau 24 jam, 19, 20, 21, 22, 23 jam. Hasil kami menunjukkan bahwa tikus terpapar konsentrasi obat yang tidak stabil karena hilangnya H2S dari larutan NaHS, dan kandungan NaHS dalam air minum tikus berfluktuasi secara signifikan selama 12 atau 24 jam (lihat Gambar 2). Dua dari studi ini melaporkan bahwa kadar H2S dalam air tetap stabil selama 24 jam22 atau hanya terjadi kehilangan H2S sebesar 2–3% selama 12 jam15, tetapi mereka tidak memberikan data pendukung atau detail pengukuran. Dua studi menunjukkan bahwa diameter botol air yang kecil dapat meminimalkan penguapan H2S15,19. Namun, hasil kami menunjukkan bahwa hal ini mungkin hanya menunda kehilangan H2S dari botol air selama 2 jam, bukan 12–24 jam. Kedua studi tersebut mencatat bahwa kami berasumsi bahwa kadar NaHS dalam air minum tidak berubah karena kami tidak mengamati perubahan warna pada air; oleh karena itu, oksidasi H2S oleh udara tidak signifikan19,20. Yang mengejutkan, metode subjektif ini menilai stabilitas NaHS dalam air, bukan mengukur perubahan konsentrasinya dari waktu ke waktu.
Hilangnya H2S dalam larutan NaHS berkaitan dengan pH dan suhu. Seperti yang dicatat dalam penelitian kami, melarutkan NaHS dalam air menghasilkan pembentukan larutan basa50. Ketika NaHS dilarutkan dalam air, pembentukan gas H2S terlarut bergantung pada nilai pH6. Semakin rendah pH larutan, semakin besar proporsi NaHS yang ada sebagai molekul gas H2S dan semakin banyak sulfida yang hilang dari larutan berair11. Tidak satu pun dari penelitian ini melaporkan pH air minum yang digunakan sebagai pelarut untuk NaHS. Menurut rekomendasi WHO, yang diadopsi oleh sebagian besar negara, pH air minum harus berada dalam kisaran 6,5–8,551. Dalam kisaran pH ini, laju oksidasi spontan H2S meningkat sekitar sepuluh kali lipat13. Melarutkan NaHS dalam air dalam kisaran pH ini akan menghasilkan konsentrasi gas H2S terlarut sebesar 1 hingga 22,5 μM, yang menekankan pentingnya memantau pH air sebelum melarutkan NaHS. Selain itu, kisaran suhu yang dilaporkan dalam penelitian di atas (18–26 °C) akan mengakibatkan perubahan konsentrasi gas H2S terlarut dalam larutan sekitar 10%, karena perubahan suhu mengubah pK1, dan perubahan kecil pada pK1 dapat berdampak signifikan pada konsentrasi gas H2S terlarut48. Selain itu, durasi beberapa penelitian yang panjang (5 bulan)22, di mana variabilitas suhu yang besar diperkirakan terjadi, juga memperburuk masalah ini.
Semua penelitian kecuali satu21 menggunakan larutan NaHS 30 μM dalam air minum. Untuk menjelaskan dosis yang digunakan (yaitu 30 μM), beberapa penulis menunjukkan bahwa NaHS dalam fase air menghasilkan konsentrasi gas H2S yang persis sama dan bahwa kisaran fisiologis H2S adalah 10 hingga 100 μM, sehingga dosis ini berada dalam kisaran fisiologis15,16. Yang lain menjelaskan bahwa NaHS 30 μM dapat mempertahankan kadar H2S plasma dalam kisaran fisiologis, yaitu 5–300 μM19,20. Kami mempertimbangkan konsentrasi NaHS dalam air sebesar 30 μM (pH = 7,0, T = 20 °C), yang digunakan dalam beberapa penelitian untuk mempelajari efek H2S. Kita dapat menghitung bahwa konsentrasi gas H2S terlarut adalah 14,7 μM, yang sekitar 50% dari konsentrasi NaHS awal. Nilai ini mirip dengan nilai yang dihitung oleh penulis lain dalam kondisi yang sama13,48.
Dalam penelitian kami, pemberian NaHS tidak mengubah berat badan; hasil ini konsisten dengan hasil penelitian lain pada tikus jantan22,23 dan tikus jantan18; Namun, dua penelitian melaporkan bahwa NaSH mengembalikan penurunan berat badan pada tikus yang menjalani nefrektomi24,26, sedangkan penelitian lain tidak melaporkan efek pemberian NaSH pada berat badan15,16,17,19,20,21,25. Lebih lanjut, dalam penelitian kami, pemberian NaSH tidak memengaruhi kadar urea dan kreatin kromium serum, yang konsisten dengan hasil laporan lain25.
Penelitian ini menemukan bahwa penambahan NaHS ke air minum selama 2 minggu tidak mempengaruhi konsentrasi sulfida serum total pada tikus jantan dan betina. Temuan ini konsisten dengan hasil Sen et al. (16): pengobatan selama 8 minggu dengan 30 μM NaHS dalam air minum tidak mempengaruhi kadar sulfida plasma pada tikus kontrol; namun, mereka melaporkan bahwa intervensi ini mengembalikan penurunan kadar H2S dalam plasma tikus yang telah menjalani nefrektomi. Li et al. (22) juga melaporkan bahwa pengobatan dengan 30 μM NaHS dalam air minum selama 5 bulan meningkatkan kadar sulfida bebas plasma pada tikus tua sekitar 26%. Studi lain belum melaporkan perubahan sulfida yang beredar setelah penambahan NaHS ke air minum.
Tujuh penelitian melaporkan penggunaan Sigma NaHS15,16,19,20,21,22,23 tetapi tidak memberikan detail lebih lanjut tentang air hidrasi, dan lima penelitian tidak menyebutkan sumber NaHS yang digunakan dalam metode preparasinya17,18,24,25,26. NaHS adalah molekul terhidrasi dan kandungan air hidrasinya dapat bervariasi, yang memengaruhi jumlah NaHS yang dibutuhkan untuk menyiapkan larutan dengan molaritas tertentu. Misalnya, kandungan NaHS dalam penelitian kami adalah NaHS•1,3 H2O. Dengan demikian, konsentrasi NaHS sebenarnya dalam penelitian ini mungkin lebih rendah daripada yang dilaporkan.
“Bagaimana senyawa yang berumur pendek seperti itu dapat memiliki efek yang bertahan lama?” Pozgay dkk.21 mengajukan pertanyaan ini ketika mengevaluasi efek NaHS pada kolitis pada tikus. Mereka berharap bahwa studi di masa mendatang dapat menjawab pertanyaan ini dan berspekulasi bahwa larutan NaHS mungkin mengandung polisulfida yang lebih stabil selain H2S dan disulfida yang memediasi efek NaHS21. Kemungkinan lain adalah bahwa konsentrasi NaHS yang sangat rendah yang tersisa dalam larutan juga dapat memiliki efek yang menguntungkan. Bahkan, Olson dkk. memberikan bukti bahwa kadar H2S dalam darah dalam kisaran mikromolar tidak fisiologis dan seharusnya berada dalam kisaran nanomolar atau sama sekali tidak ada13. H2S dapat bekerja melalui sulfasi protein, modifikasi pasca-translasi reversibel yang memengaruhi fungsi, stabilitas, dan lokalisasi banyak protein52,53,54. Bahkan, dalam kondisi fisiologis, sekitar 10% hingga 25% dari banyak protein hati mengalami sulfilasi53. Kedua penelitian tersebut mengakui kerusakan cepat NaHS19,23 tetapi secara mengejutkan menyatakan bahwa “kami mengontrol konsentrasi NaHS dalam air minum dengan menggantinya setiap hari.”23 Satu penelitian secara tidak sengaja menyatakan bahwa “NaHS adalah donor H2S standar dan umum digunakan dalam praktik klinis untuk menggantikan H2S itu sendiri.”18
Diskusi di atas menunjukkan bahwa NaHS hilang dari larutan melalui penguapan, oksidasi, dan fotolisis, dan oleh karena itu beberapa saran diberikan untuk mengurangi kehilangan H2S dari larutan. Pertama, penguapan H2S bergantung pada antarmuka gas-cair13 dan pH larutan11; oleh karena itu, untuk meminimalkan kehilangan akibat penguapan, leher botol air dapat dibuat sekecil mungkin seperti yang dijelaskan sebelumnya15,19, dan pH air dapat disesuaikan ke batas atas yang dapat diterima (yaitu, 6,5–8,551) untuk meminimalkan kehilangan akibat penguapan11. Kedua, oksidasi spontan H2S terjadi karena pengaruh oksigen dan keberadaan ion logam transisi dalam air minum13, sehingga deoksigenasi air minum dengan argon atau nitrogen44,45 dan penggunaan pengkelat logam37,47 dapat mengurangi oksidasi sulfida. Ketiga, untuk mencegah fotodekomposisi H2S, botol air dapat dibungkus dengan aluminium foil; Praktik ini juga berlaku untuk bahan yang peka terhadap cahaya seperti streptozotocin55. Terakhir, garam sulfida anorganik (NaHS, Na2S, dan CaS) dapat diberikan melalui gavage daripada dilarutkan dalam air minum seperti yang dilaporkan sebelumnya56,57,58; penelitian telah menunjukkan bahwa natrium sulfida radioaktif yang diberikan melalui gavage pada tikus diserap dengan baik dan didistribusikan ke hampir semua jaringan59. Hingga saat ini, sebagian besar penelitian telah memberikan garam sulfida anorganik secara intraperitoneal; namun, rute ini jarang digunakan dalam pengaturan klinis60. Di sisi lain, rute oral adalah rute pemberian yang paling umum dan disukai pada manusia61. Oleh karena itu, kami merekomendasikan untuk mengevaluasi efek donor H2S pada hewan pengerat melalui gavage oral.
Salah satu keterbatasan adalah kami mengukur sulfida dalam larutan berair dan serum menggunakan metode MB. Metode untuk mengukur sulfida meliputi titrasi iodin, spektrofotometri, metode elektrokimia (potensiometri, amperometri, metode coulometri, dan metode amperometri) dan kromatografi (kromatografi gas dan kromatografi cair kinerja tinggi), di antaranya metode yang paling umum digunakan adalah metode spektrofotometri MB62. Keterbatasan metode MB untuk mengukur H2S dalam sampel biologis adalah bahwa metode ini mengukur semua senyawa yang mengandung sulfur dan bukan H2S bebas63 karena dilakukan dalam kondisi asam, yang mengakibatkan ekstraksi sulfur dari sumber biologis64. Namun, menurut American Public Health Association, MB adalah metode standar untuk mengukur sulfida dalam air65. Oleh karena itu, keterbatasan ini tidak memengaruhi hasil utama kami tentang ketidakstabilan larutan yang mengandung NaHS. Lebih lanjut, dalam penelitian kami, pemulihan pengukuran sulfida dalam sampel air dan serum yang mengandung NaHS masing-masing adalah 91% dan 93%. Nilai-nilai ini sejalan dengan rentang yang dilaporkan sebelumnya (77–92)66, menunjukkan presisi analitis yang dapat diterima42. Perlu dicatat bahwa kami menggunakan tikus jantan dan betina sesuai dengan pedoman National Institutes of Health (NIH) untuk menghindari ketergantungan berlebihan pada studi hewan jantan saja dalam studi praklinis67 dan untuk menyertakan tikus jantan dan betina bila memungkinkan68. Hal ini telah ditekankan oleh pihak lain69,70,71.
Kesimpulannya, hasil penelitian ini menunjukkan bahwa larutan NaHS yang dibuat dari air minum tidak dapat digunakan untuk menghasilkan H2S karena ketidakstabilannya. Cara pemberian ini akan membuat hewan terpapar NaHS yang tidak stabil dan lebih rendah dari yang diharapkan; oleh karena itu, temuan ini mungkin tidak dapat diterapkan pada manusia.
Kumpulan data yang digunakan dan/atau dianalisis selama penelitian ini tersedia dari penulis terkait atas permintaan yang wajar.
Szabo, K. Garis waktu penelitian hidrogen sulfida (H2S): dari racun lingkungan menjadi mediator biologis. Biokimia dan Farmakologi 149, 5–19. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2017.09.010 (2018).
Abe, K. dan Kimura, H. Kemungkinan peran hidrogen sulfida sebagai neuromodulator endogen. Journal of Neuroscience, 16, 1066–1071. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.16-03-01066.1996 (1996).
Chirino, G., Szabo, C. dan Papapetropoulos, A. Peran fisiologis hidrogen sulfida dalam sel, jaringan, dan organ mamalia. Tinjauan dalam Fisiologi dan Biologi Molekuler 103, 31–276. https://doi.org/10.1152/physrev.00028.2021 (2023).
Dillon, KM, Carrazzone, RJ, Matson, JB, dan Kashfi, K. Janji yang berkembang dari sistem pengiriman seluler untuk oksida nitrat dan hidrogen sulfida: era baru pengobatan personalisasi. Biokimia dan Farmakologi 176, 113931. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2020.113931 (2020).
Sun, X., dkk. Pemberian jangka panjang donor hidrogen sulfida lepas lambat dapat mencegah cedera iskemia/reperfusi miokard. Laporan ilmiah 7, 3541. https://doi.org/10.1038/s41598-017-03941-0 (2017).
Sitdikova, GF, Fuchs, R., Kainz, W., Weiger, TM dan Hermann, A. Fosforilasi saluran BK mengatur sensitivitas hidrogen sulfida (H2S). Frontiers in Physiology 5, 431. https://doi.org/10.3389/fphys.2014.00431 (2014).
Sitdikova, GF, Weiger, TM dan Hermann, A. Hidrogen sulfida meningkatkan aktivitas saluran kalium (BK) yang diaktifkan kalsium pada sel tumor hipofisis tikus. Archit. Pfluegers. 459, 389–397. https://doi.org/10.1007/s00424-009-0737-0 (2010).
Jeddy, S., dkk. Hidrogen sulfida meningkatkan efek perlindungan nitrit terhadap cedera iskemia-reperfusi miokard pada tikus diabetes tipe 2. Nitric Oxide 124, 15–23. https://doi.org/10.1016/j.niox.2022.04.004 (2022).
Corvino, A., dkk. Tren dalam kimia donor H2S dan dampaknya pada penyakit kardiovaskular. Antioksidan 10, 429. https://doi.org/10.3390/antiox10030429 (2021).
DeLeon, ER, Stoy, GF, dan Olson, KR (2012). Kehilangan pasif hidrogen sulfida dalam eksperimen biologi. Biokimia Analitik 421, 203–207. https://doi.org/10.1016/j.ab.2011.10.016 (2012).
Nagy, P., dkk. Aspek kimia pengukuran hidrogen sulfida dalam sampel fisiologis. Biochimica et Biophysical Acta 1840, 876–891. https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2013.05.037 (2014).
Kline, LL.D. Penentuan spektrofotometri hidrogen sulfida dalam air alami. Limnol. Oceanogr. 14, 454–458. https://doi.org/10.4319/lo.1969.14.3.0454 (1969).
Olson, KR (2012). Pelatihan praktis dalam kimia dan biologi hidrogen sulfida. “Antioksidan.” Redox Signaling. 17, 32–44. https://doi.org/10.1089/ars.2011.4401 (2012).