Sebelumnya kami melaporkan bahwa kadar serum metabolit triptofan yang berasal dari usus, yaitu asam indol-3-propionat (IPA), lebih rendah pada pasien dengan fibrosis hati. Dalam penelitian ini, kami menyelidiki transkriptom dan metilom DNA pada hati penderita obesitas dalam kaitannya dengan kadar IPA serum, serta peran IPA dalam menginduksi inaktivasi fenotipik sel stellata hepatik (HSC) secara in vitro.
Penelitian ini melibatkan 116 pasien obesitas tanpa diabetes melitus tipe 2 (T2DM) (usia 46,8 ± 9,3 tahun; BMI: 42,7 ± 5,0 kg/m²) yang menjalani operasi bariatrik di Pusat Bedah Bariatrik Kuopio (KOBS). Kadar IPA dalam sirkulasi diukur dengan kromatografi cair-spektrometri massa (LC-MS), analisis transkriptom hati dilakukan dengan sekuensing RNA total, dan analisis metilasi DNA dilakukan menggunakan Infinium HumanMethylation450 BeadChip. Sel stellata hepatik manusia (LX-2) digunakan untuk eksperimen in vitro.
Kadar serum IPA berkorelasi dengan ekspresi gen yang terlibat dalam jalur apoptosis, mitofagosis, dan umur panjang di hati. Gen AKT serine/threonine kinase 1 (AKT1) adalah gen yang paling melimpah dan dominan berinteraksi dalam profil transkrip dan metilasi DNA hati. Perlakuan IPA menginduksi apoptosis, menurunkan respirasi mitokondria, dan mengubah morfologi sel serta dinamika mitokondria dengan memodulasi ekspresi gen yang diketahui mengatur fibrosis, apoptosis, dan kelangsungan hidup sel LX-2.
Secara keseluruhan, data ini mendukung bahwa IPA memiliki potensi efek terapeutik dan dapat menginduksi apoptosis serta menggeser fenotipe HSC ke arah keadaan tidak aktif, sehingga memperluas kemungkinan penghambatan fibrosis hati dengan mengganggu aktivasi HSC dan metabolisme mitokondria.
Prevalensi obesitas dan sindrom metabolik telah dikaitkan dengan peningkatan kejadian penyakit hati berlemak yang berhubungan dengan metabolisme (MASLD); penyakit ini mempengaruhi 25% hingga 30% populasi umum [1]. Konsekuensi utama dari etiologi MASLD adalah fibrosis hati, suatu proses dinamis yang ditandai dengan akumulasi terus-menerus matriks ekstraseluler (ECM) berserat [2]. Sel-sel utama yang terlibat dalam fibrosis hati adalah sel stellata hepatik (HSC), yang menunjukkan empat fenotipe yang diketahui: diam, aktif, tidak aktif, dan menua [3, 4]. HSC dapat diaktifkan dan mengalami transdiferensiasi dari bentuk diam menjadi sel-sel seperti fibroblas yang proliferatif dengan kebutuhan energi yang tinggi, dengan peningkatan ekspresi α-smooth muscle actin (α-SMA) dan kolagen tipe I (Col-I) [5, 6]. Selama pembalikan fibrosis hati, HSC yang aktif dieliminasi melalui apoptosis atau inaktivasi. Proses ini mencakup penurunan regulasi gen fibrogenik dan modulasi gen prosurvival (seperti jalur sinyal NF-κB dan PI3K/Akt) [7, 8], serta perubahan dinamika dan fungsi mitokondria [9].
Kadar serum metabolit triptofan asam indol-3-propionat (IPA), yang diproduksi di usus, telah ditemukan menurun pada penyakit metabolik manusia termasuk MASLD [10–13]. IPA dikaitkan dengan asupan serat makanan, dikenal karena efek antioksidan dan antiinflamasinya, dan melemahkan fenotipe steatohepatitis non-alkoholik (NASH) yang diinduksi diet secara in vivo dan in vitro [11–14]. Beberapa bukti berasal dari penelitian kami sebelumnya, yang menunjukkan bahwa kadar serum IPA lebih rendah pada pasien dengan fibrosis hati dibandingkan pada pasien obesitas tanpa fibrosis hati dalam Studi Bedah Bariatrik Kuopio (KOBS). Lebih lanjut, kami menunjukkan bahwa pengobatan IPA dapat mengurangi ekspresi gen yang merupakan penanda klasik adhesi sel, migrasi sel, dan aktivasi sel induk hematopoietik dalam model sel stellata hati manusia (LX-2) dan merupakan metabolit hepatoprotektif potensial [15]. Namun, masih belum jelas bagaimana IPA menginduksi regresi fibrosis hati dengan mengaktifkan apoptosis HSC dan bioenergetika mitokondria.
Di sini, kami menunjukkan bahwa IPA serum berhubungan dengan ekspresi gen yang diperkaya dalam jalur apoptosis, mitofagi, dan umur panjang di hati individu obesitas tetapi bukan penderita diabetes tipe 2 (KOBS). Lebih lanjut, kami menemukan bahwa IPA dapat menginduksi pembersihan dan degradasi sel punca hematopoietik (HSC) yang teraktivasi melalui jalur inaktivasi. Hasil ini mengungkapkan peran baru IPA, menjadikannya target terapi potensial untuk mendorong regresi fibrosis hati.
Sebuah studi sebelumnya dalam kohort KOBS menunjukkan bahwa pasien dengan fibrosis hati memiliki kadar IPA sirkulasi yang lebih rendah dibandingkan dengan pasien tanpa fibrosis hati [15]. Untuk mengecualikan potensi efek pengganggu dari diabetes tipe 2, kami merekrut 116 pasien obesitas tanpa diabetes tipe 2 (usia rata-rata ± SD: 46,8 ± 9,3 tahun; BMI: 42,7 ± 5,0 kg/m2) (Tabel 1) dari studi KOBS yang sedang berlangsung sebagai populasi penelitian [16]. Semua peserta memberikan persetujuan tertulis dan protokol penelitian disetujui oleh Komite Etika Rumah Sakit Kabupaten Savo Utara sesuai dengan Deklarasi Helsinki (54/2005, 104/2008 dan 27/2010).
Spesimen biopsi hati diperoleh selama operasi bariatrik dan dinilai secara histologis oleh ahli patologi berpengalaman sesuai dengan kriteria yang telah dijelaskan sebelumnya [17, 18]. Kriteria penilaian dirangkum dalam Tabel Tambahan S1 dan telah dijelaskan sebelumnya [19].
Sampel serum puasa dianalisis dengan kromatografi cair-spektrometri massa (LC-MS) tanpa target untuk analisis metabolomik (n = 116). Sampel dianalisis menggunakan sistem UHPLC-qTOF-MS (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Jerman) seperti yang dijelaskan sebelumnya19. Identifikasi isopropil alkohol (IPA) didasarkan pada waktu retensi dan perbandingan spektrum MS/MS dengan standar murni. Intensitas sinyal IPA (luas puncak) dipertimbangkan dalam semua analisis selanjutnya [20].
Pengurutan RNA seluruh hati dilakukan menggunakan Illumina HiSeq 2500 dan data diproses terlebih dahulu seperti yang dijelaskan sebelumnya [19, 21, 22]. Kami melakukan analisis ekspresi diferensial target transkrip yang mempengaruhi fungsi/biogenesis mitokondria menggunakan 1957 gen yang dipilih dari basis data MitoMiner 4.0 [ 23 ]. Analisis metilasi DNA hati dilakukan menggunakan Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA, USA) menggunakan metodologi yang sama seperti yang dijelaskan sebelumnya [24, 25].
Sel stellata hepatik manusia (LX-2) disediakan oleh Prof. Stefano Romeo dan dikultur serta dipelihara dalam medium DMEM/F12 (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106). Untuk memilih dosis kerja IPA, sel LX-2 diberi perlakuan dengan berbagai konsentrasi IPA (10 μM, 100 μM dan 1 mM; Sigma, 220027) dalam medium DMEM/F12 selama 24 jam. Selanjutnya, untuk menyelidiki kemampuan IPA dalam menonaktifkan HSC, sel LX-2 diberi perlakuan bersamaan dengan 5 ng/ml TGF-β1 (R&D systems, 240-B-002/CF) dan 1 mM IPA dalam medium bebas serum selama 24 jam. Untuk kontrol kendaraan yang sesuai, 4 nM HCL yang mengandung 0,1% BSA digunakan untuk perlakuan TGF-β1 dan 0,05% DMSO digunakan untuk perlakuan IPA, dan keduanya digunakan bersama-sama untuk perlakuan kombinasi.
Apoptosis dinilai menggunakan Kit Deteksi Apoptosis FITC Annexin V dengan 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA, USA, Cat# 640922) sesuai dengan petunjuk pabrik. Secara singkat, sel LX-2 (1 × 10⁵ sel/sumur) dikultur semalaman dalam pelat 12 sumur dan kemudian diberi perlakuan dengan beberapa dosis IPA atau IPA dan TGF-β1. Keesokan harinya, sel yang mengambang dan menempel dikumpulkan, di-tripsinasi, dicuci dengan PBS, disuspensikan kembali dalam buffer pengikat Annexin V, dan diinkubasi dengan FITC-Annexin V dan 7-AAD selama 15 menit.
Mitokondria dalam sel hidup diwarnai untuk aktivitas oksidatif menggunakan Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA). Untuk pengujian MTR, sel LX-2 diinkubasi pada kepadatan yang sama dengan IPA dan TGF-β1. Setelah 24 jam, sel hidup di-tripsinasi, dicuci dengan PBS, dan kemudian diinkubasi dengan 100 μM MTR dalam medium bebas serum pada suhu 37 °C selama 20 menit seperti yang dijelaskan sebelumnya [ 26 ]. Untuk analisis morfologi sel hidup, ukuran sel dan kompleksitas sitoplasma dianalisis menggunakan parameter hamburan maju (FSC) dan hamburan samping (SSC), masing-masing.
Seluruh data (30.000 kejadian) diperoleh menggunakan NovoCyte Quanteon (Agilent) dan dianalisis menggunakan perangkat lunak NovoExpress® 1.4.1 atau FlowJo V.10.
Laju konsumsi oksigen (OCR) dan laju pengasaman ekstraseluler (ECAR) diukur secara real-time menggunakan Seahorse Extracellular Flux Analyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) yang dilengkapi dengan Seahorse XF Cell Mito Stress sesuai dengan instruksi pabrikan. Secara singkat, 2 × 104 sel LX-2/sumur ditanam pada pelat kultur sel XF96. Setelah inkubasi semalaman, sel-sel diberi perlakuan dengan isopropanol (IPA) dan TGF-β1 (Metode Tambahan 1). Analisis data dilakukan menggunakan perangkat lunak Seahorse XF Wave, yang mencakup Seahorse XF Cell Energy Phenotype Test Report Generator. Dari sini, Indeks Kesehatan Bioenergetik (BHI) dihitung [27].
Total RNA ditranskripsikan menjadi cDNA. Untuk metode spesifik, lihat referensi [15]. Tingkat mRNA protein asam ribosom 60S manusia P0 (RPLP0) dan siklofilin A1 (PPIA) digunakan sebagai kontrol gen konstitutif. Sistem PCR Real-Time QuantStudio 6 pro (Thermo Fisher, Landsmeer, Belanda) digunakan dengan Kit TaqMan™ Fast Advanced Master Mix (Applied Biosystems) atau Kit Sensifast SYBR Lo-ROX (Bioline, BIO 94050), dan lipatan ekspresi gen relatif dihitung menggunakan parameter siklus nilai Ct komparatif (ΔΔCt) dan metode ∆∆Ct. Detail primer disediakan dalam Tabel Tambahan S2 dan S3.
DNA nuklear (ncDNA) dan DNA mitokondria (mtDNA) diekstraksi menggunakan kit DNeasy blood and tissue (Qiagen) seperti yang dijelaskan sebelumnya [28]. Jumlah relatif mtDNA dihitung dengan menghitung rasio setiap wilayah mtDNA target terhadap rata-rata geometris dari tiga wilayah DNA nuklear (mtDNA/ncDNA), seperti yang dijelaskan secara rinci dalam Metode Tambahan 2. Rincian primer untuk mtDNA dan ncDNA disediakan dalam Tabel Tambahan S4.
Sel hidup diwarnai dengan Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) untuk memvisualisasikan jaringan mitokondria antar sel dan intra sel. Sel LX-2 (1 × 104 sel/sumur) dikultur pada slide kaca dalam pelat kultur berdasar kaca yang sesuai (Ibidi GmbH, Martinsried, Jerman). Setelah 24 jam, sel LX-2 hidup diinkubasi dengan 100 μM MTR selama 20 menit pada suhu 37 °C dan inti sel diwarnai dengan DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) seperti yang dijelaskan sebelumnya [29]. Jaringan mitokondria divisualisasikan menggunakan mikroskop terbalik Zeiss Axio Observer (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Jerman) yang dilengkapi dengan modul konfokal Zeiss LSM 800 pada suhu 37 °C dalam atmosfer lembap dengan 5% CO2 menggunakan lensa objektif 63×NA 1.3. Kami memperoleh sepuluh gambar seri Z untuk setiap jenis sampel. Setiap seri Z berisi 30 bagian, masing-masing dengan ketebalan 9,86 μm. Untuk setiap sampel, gambar dari sepuluh bidang pandang yang berbeda diperoleh menggunakan perangkat lunak ZEN 2009 (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Jerman), dan analisis morfologi mitokondria dilakukan menggunakan perangkat lunak ImageJ (v1.54d) [30, 31] sesuai dengan parameter yang dirinci dalam Metode Tambahan 3.
Sel-sel difiksasi dengan 2% glutaraldehida dalam buffer fosfat 0,1 M, diikuti dengan fiksasi menggunakan larutan osmium tetroksida 1% (Sigma Aldrich, MO, USA), secara bertahap didehidrasi dengan aseton (Merck, Darmstadt, Jerman), dan akhirnya dienkapsulasi dalam resin epoksi. Sayatan ultra tipis disiapkan dan diwarnai dengan 1% uranil asetat (Merck, Darmstadt, Jerman) dan 1% timbal sitrat (Merck, Darmstadt, Jerman). Gambar ultrastruktural diperoleh menggunakan mikroskop elektron transmisi JEM 2100F EXII (JEOL Ltd, Tokyo, Jepang) pada tegangan percepatan 80 kV.
Morfologi sel LX-2 yang diberi perlakuan IPA selama 24 jam dianalisis dengan mikroskop fase kontras pada perbesaran 50x menggunakan mikroskop cahaya terbalik Zeiss (Zeiss Axio Vert.A1 dan AxioCam MRm, Jena, Jerman).
Data klinis dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi atau median (rentang interkuartil: IQR). Analisis varians satu arah (variabel kontinu) atau uji χ² (variabel kategorikal) digunakan untuk membandingkan perbedaan antara ketiga kelompok studi. Tingkat positif palsu (FDR) digunakan untuk mengoreksi pengujian berganda, dan gen dengan FDR < 0,05 dianggap signifikan secara statistik. Analisis korelasi Spearman digunakan untuk mengkorelasikan metilasi DNA CpG dengan intensitas sinyal IPA, dengan nilai p nominal (p < 0,05) dilaporkan.
Analisis jalur dilakukan menggunakan alat analisis set gen berbasis web (WebGestalt) untuk 268 transkrip (p nominal < 0,01), 119 transkrip terkait mitokondria (p nominal < 0,05), dan 4350 CpG dari 3093 transkrip hati yang terkait dengan kadar IPA serum yang beredar. Alat Venny DB (versi 2.1.0) yang tersedia secara gratis digunakan untuk menemukan gen yang tumpang tindih, dan StringDB (versi 11.5) digunakan untuk memvisualisasikan interaksi protein-protein.
Untuk percobaan LX-2, sampel diuji normalitasnya menggunakan uji D'Agostino-Pearson. Data diperoleh dari setidaknya tiga replikasi biologis dan dianalisis menggunakan ANOVA satu arah dengan uji post hoc Bonferroni. Nilai p kurang dari 0,05 dianggap signifikan secara statistik. Data disajikan sebagai mean ± SD, dan jumlah percobaan ditunjukkan pada setiap gambar. Semua analisis dan grafik dilakukan menggunakan perangkat lunak statistik GraphPad Prism 8 untuk Windows (GraphPad Software Inc., versi 8.4.3, San Diego, AS).
Pertama, kami menyelidiki hubungan antara kadar IPA serum dengan transkrip hati, seluruh tubuh, dan mitokondria. Pada profil transkrip total, gen yang paling kuat terkait dengan kadar IPA serum adalah MAPKAPK3 (FDR = 0,0077; mitogen-activated protein kinase-activated protein kinase 3); pada profil transkrip yang terkait dengan mitokondria, gen yang paling kuat terkait adalah AKT1 (FDR = 0,7621; AKT serine/threonine kinase 1) (Lampiran 1 dan Lampiran 2).
Kemudian kami menganalisis transkrip global (n = 268; p < 0,01) dan transkrip yang terkait dengan mitokondria (n = 119; p < 0,05), dan akhirnya mengidentifikasi apoptosis sebagai jalur kanonik yang paling signifikan (p = 0,0089). Untuk transkrip mitokondria yang terkait dengan kadar IPA serum, kami fokus pada apoptosis (FDR = 0,00001), mitofagi (FDR = 0,00029), dan jalur pensinyalan TNF (FDR = 0,000006) (Gambar 1A, Tabel 2, dan Gambar Tambahan 1A-B).
Analisis tumpang tindih transkrip global, transkrip terkait mitokondria, dan metilasi DNA di hati manusia yang berhubungan dengan kadar IPA serum. A mewakili 268 transkrip global, 119 transkrip terkait mitokondria, dan transkrip metilasi DNA yang dipetakan ke 3092 situs CpG yang terkait dengan kadar IPA serum (nilai p < 0,01 untuk transkrip global dan metilasi DNA, dan nilai p < 0,05 untuk transkrip mitokondria). Transkrip tumpang tindih utama ditunjukkan di tengah (AKT1 dan YKT6). B Peta interaksi dari 13 gen dengan skor interaksi tertinggi (0,900) dengan gen lain dibangun dari 56 gen tumpang tindih (wilayah garis hitam) yang secara signifikan terkait dengan kadar IPA serum menggunakan alat daring StringDB. Hijau: Gen yang dipetakan ke komponen seluler Gene Ontology (GO): mitokondria (GO:0005739). AKT1 adalah protein dengan skor tertinggi (0,900) untuk interaksi dengan protein lain berdasarkan data (berdasarkan penambangan teks, eksperimen, basis data, dan ko-ekspresi). Node jaringan mewakili protein, dan edge mewakili koneksi antar protein.
Karena metabolit mikrobiota usus dapat mengatur komposisi epigenetik melalui metilasi DNA [32], kami menyelidiki apakah kadar IPA serum berhubungan dengan metilasi DNA hati. Kami menemukan bahwa dua situs metilasi utama yang berhubungan dengan kadar IPA serum berada di dekat daerah kaya prolin-serin 3 (C19orf55) dan anggota keluarga protein kejut panas B (kecil) 6 (HSPB6) (Lampiran 3). Metilasi DNA dari 4350 CpG (p < 0,01) berkorelasi dengan kadar IPA serum dan diperkaya dalam jalur pengaturan umur panjang (p = 0,006) (Gambar 1A, Tabel 2, dan Gambar Tambahan 1C).
Untuk memahami mekanisme biologis yang mendasari hubungan antara kadar IPA serum, transkrip global, transkrip terkait mitokondria, dan metilasi DNA di hati manusia, kami melakukan analisis tumpang tindih gen yang diidentifikasi dalam analisis jalur sebelumnya (Gambar 1A). Hasil analisis pengayaan jalur dari 56 gen yang tumpang tindih (di dalam garis hitam pada Gambar 1A) menunjukkan bahwa jalur apoptosis (p = 0,00029) menyoroti dua gen yang umum untuk ketiga analisis: AKT1 dan YKT6 (homolog v-SNARE YKT6), seperti yang ditunjukkan dalam diagram Venn (Gambar Tambahan 2 dan Gambar 1A). Menariknya, kami menemukan bahwa AKT1 (cg19831386) dan YKT6 (cg24161647) berkorelasi positif dengan kadar IPA serum (Berkas Tambahan 3). Untuk mengidentifikasi potensi interaksi protein antar produk gen, kami memilih 13 gen dengan skor wilayah umum tertinggi (0,900) di antara 56 gen yang tumpang tindih sebagai masukan dan membuat peta interaksi. Berdasarkan tingkat kepercayaan (kepercayaan marginal), gen AKT1 dengan skor tertinggi (0,900) berada di urutan teratas (Gambar 1B).
Berdasarkan analisis jalur, kami menemukan bahwa apoptosis adalah jalur utama, sehingga kami menyelidiki apakah pengobatan IPA akan memengaruhi apoptosis HSC secara in vitro. Sebelumnya kami telah menunjukkan bahwa dosis IPA yang berbeda (10 μM, 100 μM, dan 1 mM) tidak beracun bagi sel LX-2 [15]. Studi ini menunjukkan bahwa pengobatan IPA pada 10 μM dan 100 μM meningkatkan jumlah sel yang hidup dan nekrotik. Namun, dibandingkan dengan kelompok kontrol, viabilitas sel menurun pada konsentrasi IPA 1 mM, sementara tingkat nekrosis sel tetap tidak berubah (Gambar 2A, B). Selanjutnya, untuk menemukan konsentrasi optimal untuk menginduksi apoptosis pada sel LX-2, kami menguji IPA 10 μM, 100 μM, dan 1 mM selama 24 jam (Gambar 2A-E dan Gambar Tambahan 3A-B). Menariknya, IPA 10 μM dan 100 μM menurunkan tingkat apoptosis (%), namun IPA 1 mM meningkatkan apoptosis tahap lanjut dan tingkat apoptosis (%) dibandingkan dengan kontrol dan oleh karena itu dipilih untuk eksperimen lebih lanjut (Gambar 2A–D).
IPA menginduksi apoptosis sel LX-2. Metode pewarnaan ganda Annexin V dan 7-AAD digunakan untuk mengukur laju apoptosis dan morfologi sel dengan sitometri aliran. Sel BA diinkubasi dengan 10 μM, 100 μM, dan 1 mM IPA selama 24 jam atau dengan F–H TGF-β1 (5 ng/ml) dan 1 mM IPA dalam medium bebas serum selama 24 jam. A: sel hidup (Annexin V -/ 7AAD-); B: sel nekrotik (Annexin V -/ 7AAD+); C, F: awal (Annexin V +/ 7AAD-); D, G: akhir (Annexin V+/7AAD+); E, H: persentase total sel apoptosis awal dan akhir dalam laju apoptosis (%). Data dinyatakan sebagai mean ± SD, n = 3 percobaan independen. Perbandingan statistik dilakukan menggunakan ANOVA satu arah dengan uji post hoc Bonferroni. *p < 0,05; ****p < 0,0001
Seperti yang telah kami tunjukkan sebelumnya, 5 ng/ml TGF-β1 dapat menginduksi aktivasi HSC dengan meningkatkan ekspresi gen penanda klasik [15]. Sel LX-2 diobati dengan kombinasi 5 ng/ml TGF-β1 dan 1 mM IPA (Gambar 2E–H). Perlakuan TGF-β1 tidak mengubah tingkat apoptosis, namun, perlakuan bersama IPA meningkatkan apoptosis tahap lanjut dan tingkat apoptosis (%) dibandingkan dengan perlakuan TGF-β1 (Gambar 2E–H). Hasil ini menunjukkan bahwa 1 mM IPA dapat meningkatkan apoptosis pada sel LX-2 secara independen dari induksi TGF-β1.
Kami selanjutnya menyelidiki efek IPA pada respirasi mitokondria pada sel LX-2. Hasilnya menunjukkan bahwa IPA 1 mM menurunkan parameter laju konsumsi oksigen (OCR): respirasi non-mitokondria, respirasi basal dan maksimal, kebocoran proton, dan produksi ATP dibandingkan dengan kelompok kontrol (Gambar 3A, B), sedangkan indeks kesehatan bioenergetik (BHI) tidak berubah.
IPA mengurangi respirasi mitokondria pada sel LX-2. Kurva respirasi mitokondria (OCR) disajikan sebagai parameter respirasi mitokondria (respirasi non-mitokondria, respirasi basal, respirasi maksimal, kebocoran proton, produksi ATP, SRC, dan BHI). Sel A dan B diinkubasi dengan IPA 10 μM, 100 μM, dan 1 mM selama 24 jam, berturut-turut. Sel C dan D diinkubasi dengan TGF-β1 (5 ng/ml) dan IPA 1 mM dalam medium bebas serum selama 24 jam, berturut-turut. Semua pengukuran dinormalisasi terhadap kandungan DNA menggunakan kit CyQuant. BHI: indeks kesehatan bioenergetik; SRC: kapasitas cadangan respirasi; OCR: laju konsumsi oksigen. Data disajikan sebagai mean ± standar deviasi (SD), n = 5 percobaan independen. Perbandingan statistik dilakukan menggunakan ANOVA satu arah dan uji post hoc Bonferroni. *p < 0,05; **p < 0,01; dan ***p < 0,001
Untuk memperoleh pemahaman yang lebih komprehensif tentang efek IPA pada profil bioenergetik sel LX-2 yang diaktifkan oleh TGF-β1, kami menganalisis fosforilasi oksidatif mitokondria dengan OCR (Gambar 3C,D). Hasilnya menunjukkan bahwa perlakuan TGF-β1 dapat mengurangi respirasi maksimum, kapasitas cadangan respirasi (SRC), dan BHI dibandingkan dengan kelompok kontrol (Gambar 3C,D). Selain itu, perlakuan kombinasi menurunkan respirasi basal, kebocoran proton, dan produksi ATP, tetapi SRC dan BHI secara signifikan lebih tinggi daripada yang diberi perlakuan TGF-β1 (Gambar 3C,D).
Kami juga melakukan “Tes Fenotipe Energi Seluler” yang disediakan oleh perangkat lunak Seahorse (Gambar Tambahan 4A–D). Seperti yang ditunjukkan pada Gambar Tambahan 3B, potensi metabolisme OCR dan ECAR menurun setelah pengobatan TGF-β1, namun, tidak ada perbedaan yang diamati pada kelompok pengobatan kombinasi dan IPA dibandingkan dengan kelompok kontrol. Lebih lanjut, baik tingkat basal maupun stres OCR menurun setelah pengobatan kombinasi dan IPA dibandingkan dengan kelompok kontrol (Gambar Tambahan 4C). Menariknya, pola serupa diamati dengan terapi kombinasi, di mana tidak ada perubahan pada tingkat basal dan stres ECAR yang diamati dibandingkan dengan pengobatan TGF-β1 (Gambar Tambahan 4C). Pada HSC, pengurangan fosforilasi oksidatif mitokondria dan kemampuan pengobatan kombinasi untuk memulihkan SCR dan BHI setelah paparan pengobatan TGF-β1 tidak mengubah potensi metabolisme (OCR dan ECAR). Secara keseluruhan, hasil ini menunjukkan bahwa IPA dapat mengurangi bioenergetika pada HSC, yang mengindikasikan bahwa IPA dapat menginduksi profil energi yang lebih rendah yang menggeser fenotipe HSC ke arah inaktivasi (Gambar Tambahan 4D).
Pengaruh IPA terhadap dinamika mitokondria diselidiki menggunakan kuantifikasi tiga dimensi morfologi mitokondria dan koneksi jaringan serta pewarnaan MTR (Gambar 4 dan Gambar Tambahan 5). Gambar 4 menunjukkan bahwa, dibandingkan dengan kelompok kontrol, perlakuan TGF-β1 menurunkan luas permukaan rata-rata, jumlah cabang, panjang cabang total, dan jumlah persimpangan cabang (Gambar 4A dan B) dan mengubah proporsi mitokondria dari morfologi bulat menjadi morfologi intermediat (Gambar 4C). Hanya perlakuan IPA yang menurunkan volume mitokondria rata-rata dan mengubah proporsi mitokondria dari morfologi bulat menjadi morfologi intermediat dibandingkan dengan kelompok kontrol (Gambar 4A). Sebaliknya, bentuk bulat, panjang cabang rata-rata, dan aktivitas mitokondria yang dinilai dengan MTR yang bergantung pada potensial membran mitokondria (Gambar 4A dan E) tetap tidak berubah dan parameter ini tidak berbeda antar kelompok. Secara keseluruhan, hasil ini menunjukkan bahwa pengobatan dengan TGF-β1 dan IPA tampaknya memodulasi bentuk dan ukuran mitokondria serta kompleksitas jaringan pada sel LX-2 hidup.
IPA mengubah dinamika mitokondria dan kelimpahan DNA mitokondria pada sel LX-2. A. Gambar konfokal representatif dari sel LX-2 hidup yang diinkubasi dengan TGF-β1 (5 ng/ml) dan 1 mM IPA selama 24 jam dalam medium bebas serum yang menunjukkan jaringan mitokondria yang diwarnai dengan Mitotracker™ Red CMXRos dan inti yang diwarnai biru dengan DAPI. Semua data berisi setidaknya 15 gambar per kelompok. Kami memperoleh 10 gambar tumpukan Z untuk setiap jenis sampel. Setiap urutan sumbu Z berisi 30 irisan, masing-masing dengan ketebalan 9,86 μm. Skala bar: 10 μm. B. Objek representatif (hanya mitokondria) yang diidentifikasi dengan menerapkan ambang batas adaptif pada gambar. Analisis kuantitatif dan perbandingan koneksi jaringan morfologi mitokondria dilakukan untuk semua sel dalam setiap kelompok. C. Frekuensi rasio bentuk mitokondria. Nilai yang mendekati 0 menunjukkan bentuk bulat, dan nilai yang mendekati 1 menunjukkan bentuk filamen. D Kandungan DNA mitokondria (mtDNA) ditentukan seperti yang dijelaskan dalam Metode dan Bahan. E Analisis Mitotracker™ Red CMXRos dilakukan dengan sitometri aliran (30.000 kejadian) seperti yang dijelaskan dalam Metode dan Bahan. Data disajikan sebagai mean ± SD, n = 3 percobaan independen. Perbandingan statistik dilakukan menggunakan ANOVA satu arah dan uji post hoc Bonferroni. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Selanjutnya, kami menganalisis kandungan mtDNA dalam sel LX-2 sebagai indikator jumlah mitokondria. Dibandingkan dengan kelompok kontrol, kandungan mtDNA meningkat pada kelompok yang diberi TGF-β1 (Gambar 4D). Dibandingkan dengan kelompok yang diberi TGF-β1, kandungan mtDNA menurun pada kelompok perlakuan kombinasi (Gambar 4D), menunjukkan bahwa IPA dapat mengurangi kandungan mtDNA dan mungkin juga jumlah mitokondria serta respirasi mitokondria (Gambar 3C). Selain itu, IPA tampaknya mengurangi kandungan mtDNA pada perlakuan kombinasi tetapi tidak memengaruhi aktivitas mitokondria yang dimediasi MTR (Gambar 4A–C).
Kami menyelidiki hubungan IPA dengan tingkat mRNA gen yang terkait dengan fibrosis, apoptosis, kelangsungan hidup, dan dinamika mitokondria pada sel LX-2 (Gambar 5A–D). Dibandingkan dengan kelompok kontrol, kelompok yang diberi perlakuan TGF-β1 menunjukkan peningkatan ekspresi gen seperti rantai kolagen tipe I α2 (COL1A2), aktin otot polos α (αSMA), matriks metaloproteinase 2 (MMP2), penghambat jaringan metaloproteinase 1 (TIMP1), dan gen seperti dinamina 1 (DRP1), yang menunjukkan peningkatan fibrosis dan aktivasi. Selanjutnya, dibandingkan dengan kelompok kontrol, pengobatan TGF-β1 mengurangi kadar mRNA reseptor pregnane X nuklir (PXR), caspase 8 (CASP8), MAPKAPK3, inhibitor B-cell α, enhancer of nuclear factor κ gene light peptide (NFκB1A), dan inhibitor subunit β kinase faktor nuklir κB (IKBKB) (Gambar 5A–D). Dibandingkan dengan pengobatan TGF-β1, pengobatan kombinasi dengan TGF-β1 dan IPA mengurangi ekspresi COL1A2 dan MMP2, tetapi meningkatkan kadar mRNA PXR, TIMP1, B-cell lymphoma-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β, dan IKBKB. Perlakuan IPA secara signifikan menurunkan ekspresi MMP2, protein terkait Bcl-2 X (BAX), AKT1, protein atrofi optik 1 (OPA1), dan protein fusi mitokondria 2 (MFN2), sedangkan ekspresi CASP8, NFκB1A, NFκB1B, dan IKBKB meningkat dibandingkan dengan kelompok kontrol. Namun, tidak ditemukan perbedaan pada ekspresi caspase-3 (CASP3), faktor pengaktif peptidase apoptosis 1 (APAF1), protein fusi mitokondria 1 (MFN1), dan protein fisi 1 (FIS1). Secara kolektif, hasil ini menunjukkan bahwa perlakuan IPA memodulasi ekspresi gen yang terkait dengan fibrosis, apoptosis, kelangsungan hidup, dan dinamika mitokondria. Data kami menunjukkan bahwa perlakuan IPA mengurangi fibrosis pada sel LX-2; pada saat yang sama, ia merangsang kelangsungan hidup dengan menggeser fenotipe ke arah inaktivasi.
IPA memodulasi ekspresi gen fibroblas, apoptosis, viabilitas, dan dinamika mitokondria pada sel LX-2. Histogram menampilkan ekspresi mRNA relatif terhadap kontrol endogen (RPLP0 atau PPIA) setelah sel LX-2 diinduksi dengan TGF-β1 dan IPA dalam medium bebas serum selama 24 jam. A menunjukkan fibroblas, B menunjukkan sel apoptosis, C menunjukkan sel yang bertahan hidup, dan D menunjukkan ekspresi gen dinamika mitokondria. Data disajikan sebagai mean ± standar deviasi (SD), n = 3 percobaan independen. Perbandingan statistik dilakukan menggunakan ANOVA satu arah dan uji post hoc Bonferroni. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Kemudian, perubahan ukuran sel (FSC-H) dan kompleksitas sitoplasma (SSC-H) dinilai dengan sitometri aliran (Gambar 6A,B), dan perubahan morfologi sel setelah pengobatan IPA dinilai dengan mikroskop elektron transmisi (TEM) dan mikroskop kontras fase (Gambar Tambahan 6A-B). Seperti yang diharapkan, sel-sel dalam kelompok yang diberi perlakuan TGF-β1 meningkat ukurannya dibandingkan dengan kelompok kontrol (Gambar 6A,B), menunjukkan perluasan klasik retikulum endoplasma kasar (ER*) dan fagolisosom (P), yang mengindikasikan aktivasi sel punca hematopoietik (HSC) (Gambar Tambahan 6A). Namun, dibandingkan dengan kelompok yang diberi perlakuan TGF-β1, ukuran sel, kompleksitas sitoplasma (Gambar 6A,B), dan kandungan ER* menurun pada kelompok perlakuan kombinasi TGF-β1 dan IPA (Gambar Tambahan 6A). Selanjutnya, perlakuan IPA menurunkan ukuran sel, kompleksitas sitoplasma (Gambar 6A,B), kandungan P dan ER* (Gambar Tambahan 6A) dibandingkan dengan kelompok kontrol. Selain itu, kandungan sel apoptotik meningkat setelah 24 jam perlakuan IPA dibandingkan dengan kelompok kontrol (panah putih, Gambar Tambahan 6B). Secara keseluruhan, hasil ini menunjukkan bahwa 1 mM IPA dapat merangsang apoptosis HSC dan membalikkan perubahan parameter morfologi sel yang diinduksi oleh TGF-β1, sehingga mengatur ukuran dan kompleksitas sel, yang mungkin terkait dengan inaktivasi HSC.
IPA mengubah ukuran sel dan kompleksitas sitoplasma pada sel LX-2. Gambar representatif dari analisis sitometri aliran. Analisis menggunakan strategi gating khusus untuk sel LX-2: SSC-A/FSC-A untuk mendefinisikan populasi sel, FSC-H/FSC-A untuk mengidentifikasi sel ganda, dan SSC-H/FSC-H untuk analisis ukuran sel dan kompleksitas. Sel diinkubasi dengan TGF-β1 (5 ng/ml) dan 1 mM IPA dalam medium bebas serum selama 24 jam. Sel LX-2 didistribusikan ke kuadran kiri bawah (SSC-H-/FSC-H-), kuadran kiri atas (SSC-H+/FSC-H-), kuadran kanan bawah (SSC-H-/FSC-H+), dan kuadran kanan atas (SSC-H+/FSC-H+) untuk analisis ukuran sel dan kompleksitas sitoplasma. B. Morfologi sel dianalisis dengan sitometri aliran menggunakan FSC-H (hamburan ke depan, ukuran sel) dan SSC-H (hamburan ke samping, kompleksitas sitoplasma) (30.000 kejadian). Data disajikan sebagai mean ± SD, n = 3 percobaan independen. Perbandingan statistik dilakukan menggunakan ANOVA satu arah dan uji post hoc Bonferroni. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 dan ****p < 0,0001
Metabolit usus seperti IPA telah menjadi topik penelitian yang hangat, menunjukkan bahwa target baru dapat ditemukan dalam mikrobiota usus. Oleh karena itu, menarik bahwa IPA, metabolit yang telah kami kaitkan dengan fibrosis hati pada manusia [15], telah terbukti sebagai senyawa anti-fibrotik potensial pada model hewan [13, 14]. Di sini, kami menunjukkan untuk pertama kalinya hubungan antara IPA serum dan transkriptomik hati global serta metilasi DNA pada individu obesitas tanpa diabetes tipe 2 (T2D), menyoroti apoptosis, mitofagi, dan umur panjang, serta kemungkinan gen kandidat AKT1 yang mengatur homeostasis hati. Kebaruan lain dari penelitian kami adalah kami menunjukkan interaksi pengobatan IPA dengan apoptosis, morfologi sel, bioenergetika dan dinamika mitokondria pada sel LX-2, menunjukkan spektrum energi yang lebih rendah yang menggeser fenotipe HSC ke arah inaktivasi, menjadikan IPA sebagai kandidat potensial untuk memperbaiki fibrosis hati.
Kami menemukan bahwa apoptosis, mitofagi, dan umur panjang merupakan jalur kanonik terpenting yang diperkaya dalam gen hati yang terkait dengan IPA serum yang beredar. Gangguan sistem kontrol kualitas mitokondria (MQC) dapat menyebabkan disfungsi mitokondria, mitofagi, dan apoptosis, sehingga mendorong terjadinya MASLD[33, 34]. Oleh karena itu, kita dapat berspekulasi bahwa IPA mungkin terlibat dalam menjaga dinamika sel dan integritas mitokondria melalui apoptosis, mitofagi, dan umur panjang di hati. Data kami menunjukkan bahwa dua gen umum di ketiga pengujian: YKT6 dan AKT1. Perlu dicatat bahwa YKT6 adalah protein SNARE yang terlibat dalam proses fusi membran sel. Ia berperan dalam autofagi dan mitofagi dengan membentuk kompleks inisiasi dengan STX17 dan SNAP29 pada autofagosom, sehingga mendorong fusi autofagosom dan lisosom[35]. Selain itu, hilangnya fungsi YKT6 mengakibatkan gangguan mitofagi[36], sedangkan peningkatan YKT6 dikaitkan dengan perkembangan karsinoma hepatoseluler (HCC), menunjukkan peningkatan kelangsungan hidup sel[37]. Di sisi lain, AKT1 adalah gen interaksi terpenting dan memainkan peran penting dalam penyakit hati, termasuk jalur pensinyalan PI3K/AKT, siklus sel, migrasi sel, proliferasi, adhesi fokal, fungsi mitokondria, dan sekresi kolagen[38–40]. Aktivasi jalur pensinyalan PI3K/AKT dapat mengaktifkan sel punca hematopoietik (HSC), yang merupakan sel yang bertanggung jawab untuk produksi matriks ekstraseluler (ECM), dan disregulasinya dapat berkontribusi pada terjadinya dan perkembangan fibrosis hati[40]. Selain itu, AKT adalah salah satu faktor kunci kelangsungan hidup sel yang menghambat apoptosis sel yang bergantung pada p53, dan aktivasi AKT mungkin terkait dengan penghambatan apoptosis sel hati[41, 42]. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa IPA mungkin terlibat dalam apoptosis yang terkait dengan mitokondria hati dengan memengaruhi keputusan hepatosit antara memasuki apoptosis atau bertahan hidup. Efek ini mungkin diatur oleh gen kandidat AKT dan/atau YKT6, yang sangat penting untuk homeostasis hati.
Hasil penelitian kami menunjukkan bahwa IPA 1 mM menginduksi apoptosis dan menurunkan respirasi mitokondria pada sel LX-2 secara independen dari pengobatan TGF-β1. Perlu dicatat bahwa apoptosis merupakan jalur utama untuk resolusi fibrosis dan aktivasi sel induk hematopoietik (HSC), dan juga merupakan peristiwa kunci dalam respons fisiologis reversibel fibrosis hati [4, 43]. Selain itu, pemulihan BHI pada sel LX-2 setelah pengobatan kombinasi memberikan wawasan baru tentang potensi peran IPA dalam regulasi bioenergetika mitokondria. Dalam kondisi istirahat dan tidak aktif, sel hematopoietik biasanya menggunakan fosforilasi oksidatif mitokondria untuk menghasilkan ATP dan memiliki aktivitas metabolisme yang rendah. Di sisi lain, aktivasi HSC meningkatkan respirasi dan biosintesis mitokondria untuk mengkompensasi kebutuhan energi memasuki keadaan glikolisis [44]. Fakta bahwa IPA tidak memengaruhi potensi metabolisme dan ECAR menunjukkan bahwa jalur glikolisis kurang diprioritaskan. Demikian pula, penelitian lain menunjukkan bahwa IPA 1 mM mampu memodulasi aktivitas rantai respirasi mitokondria pada kardiomiosit, sel hepatosit manusia (Huh7) dan sel endotel vena umbilikal manusia (HUVEC); Namun, tidak ditemukan efek IPA pada glikolisis di kardiomiosit, yang menunjukkan bahwa IPA mungkin memengaruhi bioenergetika jenis sel lain [45]. Oleh karena itu, kami berspekulasi bahwa IPA 1 mM dapat bertindak sebagai pemutus rantai kimia ringan, karena dapat secara signifikan mengurangi ekspresi gen fibrogenik, morfologi sel dan bioenergetika mitokondria tanpa mengubah jumlah mtDNA [46]. Pemutus rantai mitokondria dapat menghambat fibrosis yang diinduksi kultur dan aktivasi HSC [47] dan mengurangi produksi ATP mitokondria yang diatur atau diinduksi oleh protein tertentu seperti protein pemutus rantai (UCP) atau translocase nukleotida adenin (ANT). Tergantung pada jenis selnya, fenomena ini dapat melindungi sel dari apoptosis dan/atau mendorong apoptosis [46]. Namun, penelitian lebih lanjut diperlukan untuk menjelaskan peran IPA sebagai pemutus hubungan mitokondria dalam inaktivasi sel induk hematopoietik.
Kami kemudian menyelidiki apakah perubahan respirasi mitokondria tercermin dalam morfologi mitokondria pada sel LX-2 hidup. Menariknya, pengobatan TGF-β1 mengubah proporsi mitokondria dari bentuk bulat menjadi bentuk menengah, dengan penurunan percabangan mitokondria dan peningkatan ekspresi DRP1, faktor kunci dalam pembelahan mitokondria [48]. Lebih lanjut, fragmentasi mitokondria dikaitkan dengan kompleksitas jaringan secara keseluruhan, dan transisi dari fusi ke pembelahan sangat penting untuk aktivasi sel induk hematopoietik (HSC), sedangkan penghambatan pembelahan mitokondria menyebabkan apoptosis HSC [49]. Dengan demikian, hasil kami menunjukkan bahwa pengobatan TGF-β1 dapat menyebabkan penurunan kompleksitas jaringan mitokondria dengan penurunan percabangan, yang lebih umum terjadi pada pembelahan mitokondria yang terkait dengan sel induk hematopoietik (HSC) yang teraktivasi. Selain itu, data kami menunjukkan bahwa IPA dapat mengubah proporsi mitokondria dari bentuk bulat menjadi bentuk menengah, sehingga mengurangi ekspresi OPA1 dan MFN2. Penelitian menunjukkan bahwa penurunan regulasi OPA1 dapat menyebabkan penurunan potensial membran mitokondria dan memicu apoptosis sel[50]. MFN2 diketahui memediasi fusi mitokondria dan apoptosis[51]. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa induksi sel LX-2 oleh TGF-β1 dan/atau IPA tampaknya memodulasi bentuk dan ukuran mitokondria, serta keadaan aktivasi dan kompleksitas jaringan.
Hasil penelitian kami menunjukkan bahwa pengobatan kombinasi TGFβ-1 dan IPA dapat mengurangi mtDNA dan parameter morfologi sel dengan mengatur ekspresi mRNA gen fibrosis, apoptosis, dan kelangsungan hidup pada sel yang menghindari apoptosis. Memang, IPA menurunkan tingkat ekspresi mRNA AKT1 dan gen fibrosis penting seperti COL1A2 dan MMP2, tetapi meningkatkan tingkat ekspresi CASP8, yang terkait dengan apoptosis. Hasil penelitian kami menunjukkan bahwa setelah pengobatan IPA, ekspresi BAX menurun dan ekspresi mRNA subunit keluarga TIMP1, BCL-2, dan NF-κB meningkat, menunjukkan bahwa IPA dapat menstimulasi sinyal kelangsungan hidup pada sel punca hematopoietik (HSC) yang menghindari apoptosis. Molekul-molekul ini dapat bertindak sebagai sinyal pro-kelangsungan hidup pada sel punca hematopoietik yang diaktifkan, yang mungkin terkait dengan peningkatan ekspresi protein anti-apoptosis (seperti Bcl-2), penurunan ekspresi pro-apoptosis BAX, dan interaksi kompleks antara TIMP dan NF-κB [5, 7]. IPA memberikan efeknya melalui PXR, dan kami menemukan bahwa pengobatan kombinasi dengan TGF-β1 dan IPA meningkatkan tingkat ekspresi mRNA PXR, yang menunjukkan penekanan aktivasi HSC. Sinyal PXR yang diaktifkan diketahui menghambat aktivasi HSC baik in vivo maupun in vitro [52, 53]. Hasil kami menunjukkan bahwa IPA mungkin berpartisipasi dalam pembersihan HSC yang diaktifkan dengan mendorong apoptosis, mengurangi fibrosis dan metabolisme mitokondria, dan meningkatkan sinyal kelangsungan hidup, yang merupakan proses khas yang mengubah fenotipe HSC yang diaktifkan menjadi fenotipe yang tidak aktif. Penjelasan lain yang mungkin untuk mekanisme dan peran potensial IPA dalam apoptosis adalah bahwa ia membersihkan mitokondria yang disfungsional terutama melalui mitofagi (jalur intrinsik) dan jalur sinyal TNF ekstrinsik (Tabel 1), yang secara langsung terkait dengan jalur sinyal kelangsungan hidup NF-κB (Gambar Tambahan 7). Menariknya, gen yang diperkaya terkait IPA mampu menginduksi sinyal pro-apoptosis dan pro-survival dalam jalur apoptosis [54], menunjukkan bahwa IPA dapat menginduksi jalur apoptosis atau survival dengan berinteraksi dengan gen-gen ini. Namun, bagaimana IPA menginduksi apoptosis atau survival selama aktivasi HSC dan jalur mekanistiknya masih belum jelas.
IPA adalah metabolit mikroba yang terbentuk dari triptofan makanan melalui mikrobiota usus. Studi menunjukkan bahwa IPA memiliki sifat antiinflamasi, antioksidan, dan pengaturan epigenetik di lingkungan usus.[55] Studi menunjukkan bahwa IPA dapat memodulasi fungsi penghalang usus dan mengurangi stres oksidatif, yang dapat berkontribusi pada efek fisiologis lokalnya.[56] Faktanya, IPA diangkut ke organ target melalui sirkulasi, dan karena IPA memiliki struktur metabolit utama yang mirip dengan triptofan, serotonin, dan turunan indol, IPA memberikan aksi metabolik yang menghasilkan nasib metabolik kompetitif.[52] IPA dapat bersaing dengan metabolit turunan triptofan untuk situs pengikatan pada enzim atau reseptor, berpotensi mengganggu jalur metabolisme normal. Hal ini menyoroti perlunya studi lebih lanjut tentang farmakokinetik dan farmakodinamiknya untuk lebih memahami jendela terapeutiknya.[57] Masih perlu dilihat apakah hal ini juga dapat terjadi pada sel punca hematopoietik (HSC).
Kami mengakui bahwa penelitian kami memiliki beberapa keterbatasan. Untuk secara khusus memeriksa hubungan yang berkaitan dengan IPA, kami mengecualikan pasien dengan diabetes melitus tipe 2 (T2DM). Kami mengakui bahwa hal ini membatasi penerapan temuan kami secara luas pada pasien dengan diabetes melitus tipe 2 dan penyakit hati lanjut. Meskipun konsentrasi fisiologis IPA dalam serum manusia adalah 1–10 μM [11, 20], konsentrasi 1 mM IPA dipilih berdasarkan konsentrasi non-toksik tertinggi [15] dan tingkat apoptosis tertinggi, tanpa perbedaan persentase populasi sel nekrotik. Meskipun kadar IPA suprafisiologis digunakan dalam penelitian ini, saat ini belum ada konsensus mengenai dosis efektif IPA [52]. Meskipun hasil kami signifikan, nasib metabolik IPA yang lebih luas tetap menjadi area penelitian yang aktif. Selain itu, temuan kami tentang hubungan antara kadar IPA serum dan metilasi DNA transkrip hati diperoleh tidak hanya dari sel punca hematopoietik (HSC) tetapi juga dari jaringan hati. Kami memilih untuk menggunakan sel LX-2 manusia berdasarkan temuan kami sebelumnya dari analisis transkriptom bahwa IPA dikaitkan dengan aktivasi sel induk hematopoietik (HSC) [15], dan HSC merupakan sel utama yang terlibat dalam perkembangan fibrosis hati. Hati terdiri dari berbagai jenis sel, sehingga model sel lain seperti sistem ko-kultur hepatosit-HSC-sel imun yang dikombinasikan dengan aktivasi kaspase dan fragmentasi DNA serta mekanisme kerjanya termasuk tingkat protein harus dipertimbangkan untuk mempelajari peran IPA dan interaksinya dengan jenis sel hati lainnya.