Berbagai teori pertahanan tanaman memberikan panduan teoritis penting untuk menjelaskan pola metabolisme khusus tanaman, tetapi prediksi utamanya masih perlu diuji. Di sini, kami menggunakan analisis spektrometri massa tandem (MS/MS) yang tidak bias untuk secara sistematis mengeksplorasi metabolom strain tembakau yang dilemahkan dari tanaman individu hingga populasi dan spesies yang berkerabat dekat, dan memproses sejumlah besar teori fitur spektrometri massa berdasarkan spektrum senyawa dalam kerangka informasi untuk menguji prediksi utama teori pertahanan optimal (OD) dan target bergerak (MT). Komponen informasi metabolomik tanaman konsisten dengan teori OD, tetapi bertentangan dengan prediksi utama teori MT tentang dinamika metabolomik yang disebabkan oleh herbivora. Dari skala evolusi mikro hingga makro, sinyal jasmonat diidentifikasi sebagai penentu utama OD, sementara sinyal etilen memberikan penyesuaian halus pada respons spesifik herbivora yang dianotasi oleh jaringan molekuler MS/MS.
Metabolit khusus dengan struktur yang beragam merupakan partisipan utama dalam adaptasi tanaman terhadap lingkungan, terutama dalam pertahanan terhadap musuh (1). Keragaman metabolisme khusus yang luar biasa yang ditemukan pada tanaman telah mendorong penelitian mendalam selama beberapa dekade tentang berbagai aspek fungsi ekologisnya, dan telah membentuk daftar panjang teori pertahanan tanaman, yang merupakan perkembangan evolusioner dan ekologis interaksi tanaman-serangga. Penelitian empiris memberikan panduan penting (2). Namun, teori pertahanan tanaman ini tidak mengikuti jalur normatif penalaran deduktif hipotetis, di mana prediksi kunci berada pada tingkat analisis yang sama (3) dan diuji secara eksperimental untuk memajukan siklus pengembangan teori selanjutnya (4). Keterbatasan teknis membatasi pengumpulan data pada kategori metabolik tertentu dan mengecualikan analisis komprehensif metabolit khusus, sehingga mencegah perbandingan antar kategori yang penting untuk pengembangan teori (5). Kurangnya data metabolomik yang komprehensif dan mata uang umum untuk membandingkan alur kerja pemrosesan ruang metabolik antara kelompok tanaman yang berbeda menghambat kematangan ilmiah bidang ini.
Perkembangan terbaru di bidang metabolomik spektrometri massa tandem (MS/MS) dapat secara komprehensif mengkarakterisasi perubahan metabolisme di dalam dan antar spesies dari suatu klad sistem tertentu, dan dapat dikombinasikan dengan metode komputasi untuk menghitung kesamaan struktural antara campuran kompleks ini. Pengetahuan sebelumnya tentang kimia (5). Kombinasi teknologi canggih dalam analisis dan komputasi menyediakan kerangka kerja yang diperlukan untuk pengujian jangka panjang dari banyak prediksi yang dibuat oleh teori ekologi dan evolusi tentang keanekaragaman metabolisme. Shannon (6) memperkenalkan teori informasi untuk pertama kalinya dalam artikel pentingnya pada tahun 1948, meletakkan dasar untuk analisis matematis informasi, yang telah digunakan di banyak bidang selain aplikasi aslinya. Dalam genomika, teori informasi telah berhasil diterapkan untuk mengukur informasi konservatif urutan (7). Dalam penelitian transkriptomik, teori informasi menganalisis perubahan keseluruhan dalam transkriptom (8). Dalam penelitian sebelumnya, kami menerapkan kerangka statistik teori informasi pada metabolomik untuk menggambarkan keahlian metabolisme tingkat jaringan pada tumbuhan (9). Di sini, kami menggabungkan alur kerja berbasis MS/MS dengan kerangka statistik teori informasi, yang dicirikan oleh keragaman metabolisme dalam mata uang umum, untuk membandingkan prediksi utama teori pertahanan tanaman terhadap metabolom yang diinduksi oleh herbivora.
Kerangka teoritis pertahanan tanaman biasanya saling inklusif dan dapat dibagi menjadi dua kategori: yang mencoba menjelaskan distribusi metabolit spesifik tanaman berdasarkan fungsi pertahanan, seperti pertahanan optimal (OD) (10), target bergerak (MT) (11), dan teori kemunculan (12), sementara yang lain mencari penjelasan mekanis tentang bagaimana perubahan ketersediaan sumber daya memengaruhi pertumbuhan tanaman dan akumulasi metabolit khusus, seperti hipotesis keseimbangan karbon:nutrisi (13), hipotesis laju pertumbuhan (14), dan hipotesis keseimbangan pertumbuhan dan diferensiasi (15). Kedua kelompok teori tersebut berada pada tingkat analisis yang berbeda (4). Namun, dua teori yang melibatkan fungsi pertahanan pada tingkat fungsional mendominasi percakapan tentang pertahanan konstitutif dan induktif tanaman: teori OD, yang mengasumsikan bahwa tanaman berinvestasi dalam pertahanan kimiawinya yang mahal hanya ketika dibutuhkan, misalnya, ketika dimakan oleh hewan pemakan rumput yang menyerang, oleh karena itu, sesuai dengan kemungkinan serangan di masa depan, senyawa dengan fungsi pertahanan diberikan (10); Hipotesis MT mengusulkan bahwa tidak ada sumbu perubahan metabolit searah, tetapi metabolit berubah secara acak, sehingga menciptakan kemungkinan menghalangi “target gerakan” metabolisme herbivora penyerang. Dengan kata lain, kedua teori ini membuat prediksi yang berlawanan tentang perubahan metabolisme yang terjadi setelah serangan herbivora: hubungan antara akumulasi metabolit searah dengan fungsi pertahanan (OD) dan perubahan metabolisme tidak terarah (MT) (11).
Hipotesis OD dan MT tidak hanya melibatkan perubahan yang diinduksi dalam metabolom, tetapi juga konsekuensi ekologis dan evolusioner dari akumulasi metabolit ini, seperti biaya dan manfaat adaptif dari perubahan metabolisme ini dalam lingkungan ekologis tertentu (16). Meskipun kedua hipotesis tersebut mengakui fungsi pertahanan metabolit khusus, yang mungkin mahal atau tidak, prediksi kunci yang membedakan hipotesis OD dan MT terletak pada arah perubahan metabolisme yang diinduksi. Prediksi teori OD telah menerima perhatian eksperimental paling banyak sejauh ini. Pengujian ini mencakup studi tentang fungsi pertahanan langsung atau tidak langsung dari berbagai jaringan senyawa spesifik di rumah kaca dan kondisi alami, serta perubahan pada tahap perkembangan tanaman (17-19). Namun, sejauh ini, karena kurangnya alur kerja dan kerangka statistik untuk analisis komprehensif global tentang keragaman metabolisme organisme apa pun, prediksi perbedaan utama antara kedua teori tersebut (yaitu, arah perubahan metabolisme) masih perlu diuji. Di sini, kami menyediakan analisis tersebut.
Salah satu karakteristik paling signifikan dari metabolit spesifik tumbuhan adalah keragaman strukturnya yang ekstrem di semua tingkatan, mulai dari tumbuhan tunggal, populasi hingga spesies yang serupa (20). Banyak perubahan kuantitatif dalam metabolit khusus dapat diamati pada skala populasi, sementara perbedaan kualitatif yang kuat biasanya dipertahankan pada tingkat spesies (20). Oleh karena itu, keragaman metabolisme tumbuhan merupakan aspek utama dari keragaman fungsional, yang mencerminkan kemampuan beradaptasi terhadap berbagai ceruk, terutama ceruk-ceruk dengan kemungkinan invasi yang berbeda oleh serangga khusus dan herbivora umum (21). Sejak artikel terobosan Fraenkel (22) tentang alasan keberadaan metabolit spesifik tumbuhan, interaksi dengan berbagai serangga telah dianggap sebagai tekanan seleksi yang penting, dan interaksi ini diyakini telah membentuk tumbuhan selama evolusi. Jalur metabolisme (23). Perbedaan antar spesies dalam keragaman metabolit khusus juga dapat mencerminkan keseimbangan fisiologis yang terkait dengan pertahanan tumbuhan konstitutif dan induktif terhadap strategi herbivora, karena kedua spesies tersebut seringkali berkorelasi negatif satu sama lain (24). Meskipun mungkin bermanfaat untuk mempertahankan pertahanan yang baik setiap saat, perubahan metabolisme tepat waktu yang terkait dengan pertahanan memberikan manfaat yang jelas dalam memungkinkan tanaman untuk mengalokasikan sumber daya berharga untuk investasi fisiologis lainnya (19, 24), dan menghindari kebutuhan akan simbiosis. Kerusakan tambahan (25). Selain itu, reorganisasi metabolit khusus yang disebabkan oleh herbivora serangga dapat menyebabkan distribusi destruktif dalam populasi (26), dan dapat mencerminkan pembacaan langsung dari perubahan alami yang substansial dalam sinyal asam jasmonat (JA), yang dapat dipertahankan dalam populasi. Sinyal JA tinggi dan rendah merupakan pertukaran antara pertahanan terhadap herbivora dan persaingan dengan spesies tertentu (27). Selain itu, jalur biosintesis metabolit khusus akan mengalami kehilangan dan transformasi yang cepat selama evolusi, menghasilkan distribusi metabolisme yang tidak merata di antara spesies yang berkerabat dekat (28). Polimorfisme ini dapat dengan cepat terbentuk sebagai respons terhadap perubahan pola herbivora (29), yang berarti bahwa fluktuasi komunitas herbivora merupakan faktor kunci yang mendorong heterogenitas metabolisme.
Di sini, kami secara khusus memecahkan masalah-masalah berikut. (I) Bagaimana serangga herbivora mengkonfigurasi ulang metabolom tumbuhan? (II) Apa saja komponen informasi utama dari plastisitas metabolik yang dapat dikuantifikasi untuk menguji prediksi teori pertahanan jangka panjang? (III) Apakah perlu memprogram ulang metabolom tumbuhan dengan cara yang unik bagi penyerang, jika demikian, peran apa yang dimainkan hormon tumbuhan dalam menyesuaikan respons metabolik spesifik, dan metabolit mana yang berkontribusi pada spesifisitas spesies pertahanan? (IV) Karena prediksi yang dibuat oleh banyak teori pertahanan dapat diperluas ke semua tingkat jaringan biologis, kami bertanya seberapa konsisten respons metabolik yang ditimbulkan dari perbandingan internal hingga perbandingan antar spesies? Untuk tujuan ini, kami telah secara sistematis mempelajari metabolom daun tembakau nikotin, yang merupakan tanaman model ekologis dengan metabolisme khusus yang kaya, dan efektif melawan larva dua herbivora asli, Lepidoptera Datura (Ms) (Sangat agresif, terutama memakan) Solanaceae dan Spodoptera littoralis (Sl), ulat daun kapas yang merupakan semacam "genus", dengan tanaman inang Solanaceae dan inang lain dari genus dan famili lain. Kami menguraikan spektrum metabolomik MS/MS dan mengekstrak deskriptor statistik teori informasi untuk membandingkan teori OD dan MT. Membuat peta spesifisitas untuk mengungkap identitas metabolit kunci. Analisis diperluas ke populasi asli N. nasi dan spesies tembakau yang terkait erat untuk menganalisis lebih lanjut kovariansi antara pensinyalan hormon tumbuhan dan induksi OD.
Untuk mendapatkan gambaran keseluruhan tentang plastisitas dan struktur metabolom daun tembakau herbivora, kami menggunakan alur kerja analisis dan perhitungan yang telah dikembangkan sebelumnya untuk mengumpulkan dan mendekonvolusi spektrum MS/MS independen data resolusi tinggi dari ekstrak tanaman secara komprehensif (9). Metode yang tidak terdiferensiasi ini (disebut MS/MS) dapat membangun spektrum senyawa non-redundan, yang kemudian dapat digunakan untuk semua analisis tingkat senyawa yang dijelaskan di sini. Metabolit tanaman yang didekonvolusi ini terdiri dari berbagai jenis, yang berjumlah ratusan hingga ribuan metabolit (sekitar 500-1000-s/MS/MS di sini). Di sini, kami mempertimbangkan plastisitas metabolik dalam kerangka teori informasi, dan mengukur keragaman dan profesionalisme metabolom berdasarkan entropi Shannon dari distribusi frekuensi metabolik. Dengan menggunakan rumus yang telah diimplementasikan sebelumnya (8), kami menghitung serangkaian indikator yang dapat digunakan untuk mengukur keragaman metabolom (indikator Hj), spesialisasi profil metabolik (indikator δj), dan spesifisitas metabolik dari metabolit tunggal (indikator Si). Selain itu, kami menerapkan Indeks Plastisitas Jarak Relatif (RDPI) untuk mengukur induksi metabolom herbivora (Gambar 1A) (30). Dalam kerangka statistik ini, kami memperlakukan spektrum MS/MS sebagai unit informasi dasar, dan memproses kelimpahan relatif MS/MS menjadi peta distribusi frekuensi, dan kemudian menggunakan entropi Shannon untuk memperkirakan keragaman metabolom darinya. Spesialisasi metabolom diukur dengan spesifisitas rata-rata dari satu spektrum MS/MS. Oleh karena itu, peningkatan kelimpahan beberapa kelas MS/MS setelah induksi herbivora diubah menjadi induksi spektral, RDPI dan spesialisasi, yaitu, peningkatan indeks δj, karena lebih banyak metabolit khusus diproduksi dan indeks Si yang tinggi dihasilkan. Penurunan indeks keragaman Hj mencerminkan bahwa jumlah MS/MS yang dihasilkan berkurang, atau distribusi frekuensi profil berubah ke arah yang kurang seragam, sementara mengurangi ketidakpastian keseluruhannya. Melalui perhitungan indeks Si, dimungkinkan untuk menyoroti MS/MS mana yang diinduksi oleh herbivora tertentu, dan sebaliknya, MS/MS mana yang tidak merespons induksi tersebut, yang merupakan indikator kunci untuk membedakan prediksi MT dan OD.
(A) Deskriptor statistik yang digunakan untuk data MS/MS herbivora (H1 hingga Hx) - induksibilitas (RDPI), keragaman (indeks Hj), spesialisasi (indeks δj), dan spesifisitas metabolit (indeks Si). Peningkatan derajat spesialisasi (δj) menunjukkan bahwa, rata-rata, lebih banyak metabolit spesifik herbivora akan diproduksi, sedangkan penurunan keragaman (Hj) menunjukkan penurunan produksi metabolit atau distribusi metabolit yang tidak merata dalam peta distribusi. Nilai Si menilai apakah metabolit tersebut spesifik untuk kondisi tertentu (di sini, herbivora) atau sebaliknya dipertahankan pada tingkat yang sama. (B) Diagram konseptual prediksi teori pertahanan menggunakan sumbu teori informasi. Teori OD memprediksi bahwa serangan herbivora akan meningkatkan metabolit pertahanan, sehingga meningkatkan δj. Pada saat yang sama, Hj menurun karena profil diatur ulang menuju pengurangan ketidakpastian informasi metabolik. Teori MT memprediksi bahwa serangan herbivora akan menyebabkan perubahan non-arah pada metabolom, sehingga meningkatkan Hj sebagai indikator peningkatan ketidakpastian informasi metabolik dan menyebabkan distribusi Si yang acak. Kami juga mengusulkan model campuran, MT terbaik, di mana beberapa metabolit dengan nilai pertahanan yang lebih tinggi akan meningkat secara signifikan (nilai Si tinggi), sementara yang lain menunjukkan respons acak (nilai Si rendah).
Dengan menggunakan deskriptor teori informasi, kami menginterpretasikan teori OD untuk memprediksi bahwa perubahan metabolit khusus yang diinduksi herbivora dalam keadaan konstitutif yang tidak diinduksi akan menyebabkan (i) peningkatan spesifisitas metabolik (indeks Si) yang mendorong spesifisitas metabonomik (indeks δj) peningkatan kelompok metabolit khusus tertentu dengan nilai pertahanan yang lebih tinggi, dan (ii) penurunan keragaman metabolom (indeks Hj) karena perubahan distribusi frekuensi metabolik menjadi distribusi badan leptin yang lebih banyak. Pada tingkat metabolit tunggal, diharapkan distribusi Si yang teratur, di mana metabolit akan meningkatkan nilai Si sesuai dengan nilai pertahanannya (Gambar 1B). Sejalan dengan hal ini, kami menjelaskan teori MT untuk memprediksi bahwa eksitasi akan menyebabkan (i) perubahan metabolit yang tidak terarah yang mengakibatkan penurunan indeks δj, dan (ii) peningkatan indeks Hj karena peningkatan ketidakpastian metabolik. Atau keacakan, yang dapat dikuantifikasi oleh entropi Shannon dalam bentuk keragaman umum. Adapun komposisi metabolik, teori MT akan memprediksi distribusi Si yang acak. Dengan mempertimbangkan bahwa metabolit tertentu berada dalam kondisi spesifik, dan metabolit lain tidak berada dalam kondisi spesifik, serta nilai pertahanannya bergantung pada lingkungan, kami juga mengusulkan model pertahanan campuran, di mana δj dan Hj didistribusikan dalam dua arah sepanjang peningkatan Si ke segala arah, hanya kelompok metabolit tertentu yang memiliki nilai pertahanan lebih tinggi yang akan secara khusus meningkatkan Si, sementara yang lain akan memiliki distribusi acak (Gambar 1B).
Untuk menguji prediksi teori pertahanan yang didefinisikan ulang pada sumbu deskriptor teori informasi, kami membiakkan larva herbivora ahli (Ms) atau generalis (Sl) pada daun Nepenthes pallens (Gambar 2A). Dengan menggunakan analisis MS/MS, kami memperoleh 599 spektrum MS/MS non-redundan (berkas data S1) dari ekstrak metanol jaringan daun yang dikumpulkan setelah ulat memakan daun. Penggunaan indeks RDPI, Hj, dan δj untuk memvisualisasikan konfigurasi ulang konten informasi dalam berkas konfigurasi MS/MS mengungkapkan pola yang menarik (Gambar 2B). Tren keseluruhannya adalah, seperti yang dijelaskan oleh deskriptor informasi, seiring ulat terus memakan daun, tingkat reorganisasi metabolisme secara keseluruhan meningkat seiring waktu: 72 jam setelah herbivora memakan daun, RDPI meningkat secara signifikan. Dibandingkan dengan kontrol yang tidak rusak, Hj berkurang secara signifikan, yang disebabkan oleh peningkatan tingkat spesialisasi profil metabolisme, yang dikuantifikasi oleh indeks δj. Tren yang tampak ini konsisten dengan prediksi teori OD, tetapi tidak konsisten dengan prediksi utama teori MT, yang meyakini bahwa perubahan acak (non-arah) pada tingkat metabolit digunakan sebagai kamuflase pertahanan (Gambar 1B). Meskipun kandungan elisitor sekresi oral (OS) dan perilaku makan kedua herbivora ini berbeda, pemberian makan langsung mereka menghasilkan perubahan serupa pada arah Hj dan δj selama periode panen 24 jam dan 72 jam. Satu-satunya perbedaan terjadi pada 72 jam RDPI. Dibandingkan dengan yang disebabkan oleh pemberian makan Ms, metabolisme keseluruhan yang diinduksi oleh pemberian makan Sl lebih tinggi.
(A) Desain eksperimental: babi biasa (S1) atau herbivora ahli (Ms) diberi makan daun tanaman kantong semar yang telah dihilangkan garamnya, sedangkan untuk simulasi herbivori, OS dari Ms (W + OSMs) digunakan untuk menangani tusukan luka pada posisi daun yang distandarisasi. Larva S1 (W + OSSl) atau air (W + W). Kontrol (C) adalah daun yang tidak rusak. (B) Induksibilitas (RDPI dibandingkan dengan grafik kontrol), keragaman (indeks Hj) dan spesialisasi (indeks δj) dihitung untuk peta metabolit khusus (599 MS/MS; berkas data S1). Tanda bintang menunjukkan perbedaan signifikan antara pemberian makan herbivora langsung dan kelompok kontrol (uji t Student dengan uji t berpasangan, *P<0,05 dan ***P<0,001). ns, tidak signifikan. (C) Indeks resolusi waktu dari spektrum metabolit utama (kotak biru, asam amino, asam organik, dan gula; berkas data S2) dan spektrum metabolit khusus (kotak merah 443 MS/MS; berkas data S1) setelah perlakuan simulasi herbivori. Pita warna mengacu pada interval kepercayaan 95%. Tanda bintang menunjukkan perbedaan signifikan antara perlakuan dan kontrol [analisis varians kuadratik (ANOVA), diikuti oleh perbedaan signifikan jujur ​​Tukey (HSD) untuk perbandingan berganda post hoc, *P<0,05, **P<0,01 dan *** P <0,001]. (D) Spesialisasi plot sebaran dan profil metabolit khusus (sampel berulang dengan perlakuan berbeda).
Untuk mengeksplorasi apakah perubahan yang diinduksi herbivora pada tingkat metabolom tercermin dalam perubahan tingkat metabolit individu, kami pertama-tama berfokus pada metabolit yang sebelumnya dipelajari pada daun Nepenthes pallens dengan ketahanan herbivora yang telah terbukti. Amida fenolik adalah konjugat hidroksisinamida-poliamina yang terakumulasi selama proses herbivora serangga dan diketahui mengurangi kinerja serangga (32). Kami mencari prekursor MS/MS yang sesuai dan memplot kurva kinetik kumulatifnya (Gambar S1). Tidak mengherankan, turunan fenol yang tidak secara langsung terlibat dalam pertahanan terhadap herbivora, seperti asam klorogenik (CGA) dan rutin, mengalami penurunan regulasi setelah herbivora. Sebaliknya, herbivora dapat membuat fenol amida menjadi sangat ampuh. Pemberian makan terus menerus oleh kedua herbivora menghasilkan spektrum eksitasi fenolamida yang hampir sama, dan pola ini sangat jelas untuk sintesis de novo fenolamida. Fenomena yang sama akan diamati ketika mengeksplorasi jalur glikosida diterpen nonanediol 17-hidroksigeranil (17-HGL-DTG), yang menghasilkan sejumlah besar diterpen asiklik dengan fungsi anti-herbivora yang efektif (33), yang mana pemberian Ms dengan Sl memicu profil ekspresi yang serupa (Gambar S1)).
Kelemahan potensial dari percobaan pemberian makan herbivora secara langsung adalah perbedaan laju konsumsi daun dan waktu makan herbivora, yang menyulitkan untuk menghilangkan efek spesifik herbivora yang disebabkan oleh luka dan herbivora. Untuk mengatasi spesifisitas spesies herbivora dari respons metabolisme daun yang diinduksi dengan lebih baik, kami mensimulasikan pemberian makan larva Ms dan Sl dengan segera mengaplikasikan OS (OSM dan OSS1) yang baru dikumpulkan ke tusukan standar W pada posisi daun yang konsisten. Prosedur ini disebut perlakuan W + OS, dan menstandarisasi induksi dengan mengatur waktu secara tepat dimulainya respons yang ditimbulkan oleh herbivora tanpa menyebabkan efek membingungkan dari perbedaan laju atau kuantitas kehilangan jaringan (Gambar 2A) (34). Dengan menggunakan alur kerja analisis dan perhitungan MS/MS, kami memperoleh 443 spektrum MS/MS (berkas data S1), yang tumpang tindih dengan spektrum yang sebelumnya dikumpulkan dari percobaan pemberian makan langsung. Analisis teori informasi dari kumpulan data MS/MS ini menunjukkan bahwa pemrograman ulang metabolom khusus daun dengan mensimulasikan herbivora menunjukkan induksi spesifik OS (Gambar 2C). Secara khusus, dibandingkan dengan perlakuan OSS1, OSM menyebabkan peningkatan spesialisasi metabolom pada 4 jam. Perlu dicatat bahwa dibandingkan dengan kumpulan data eksperimen pemberian makan herbivora langsung, kinetika metabolik yang divisualisasikan dalam ruang dua dimensi menggunakan Hj dan δj sebagai koordinat dan arah spesialisasi metabolom sebagai respons terhadap perlakuan simulasi herbivora dari waktu ke waktu meningkat secara konsisten (Gambar 2D). Pada saat yang sama, kami mengukur kandungan asam amino, asam organik, dan gula (berkas data S2) untuk menyelidiki apakah peningkatan keahlian metabolom yang ditargetkan ini disebabkan oleh konfigurasi ulang metabolisme karbon sentral sebagai respons terhadap simulasi herbivora (Gambar S2). Untuk menjelaskan pola ini dengan lebih baik, kami selanjutnya memantau kinetika akumulasi metabolik dari jalur fenolamida dan 17-HGL-DTG yang telah dibahas sebelumnya. Induksi OS spesifik pada herbivora diubah menjadi pola penataan ulang diferensial dalam metabolisme fenolamida (Gambar S3). Amida fenolik yang mengandung gugus kumarin dan kafeoil lebih disukai diinduksi oleh OSS1, sementara OSM memicu induksi spesifik konjugat ferulil. Untuk jalur 17-HGL-DTG, induksi OS diferensial oleh produk malonilasi dan dimalonilasi hilir terdeteksi (Gambar S3).
Selanjutnya, kami mempelajari plastisitas transkriptom yang diinduksi OS menggunakan kumpulan data microarray time-course, yang mensimulasikan penggunaan OSM untuk mengobati daun tanaman roset pada herbivora. Kinetika pengambilan sampel pada dasarnya tumpang tindih dengan kinetika yang digunakan dalam studi metabolomik ini (35). Dibandingkan dengan konfigurasi ulang metabolom di mana plastisitas metabolik secara khusus meningkat seiring waktu, kami mengamati ledakan transkripsi sementara pada daun yang diinduksi oleh Ms, di mana induksibilitas transkriptom (RDPI) dan spesialisasi (δj) berada pada 1 jam, dan keragaman (Hj) pada titik waktu ini, ekspresi BMP1 berkurang secara signifikan, diikuti oleh relaksasi spesialisasi transkriptom (Gambar S4). Keluarga gen metabolik (seperti P450, glikosiltransferase, dan asiltransferase BAHD) berpartisipasi dalam proses perakitan metabolit khusus dari unit struktural yang berasal dari metabolisme primer, mengikuti model spesialisasi tinggi awal yang disebutkan di atas. Sebagai studi kasus, jalur fenilalanin dianalisis. Analisis tersebut mengkonfirmasi bahwa gen inti dalam metabolisme fenolamida sangat terinduksi OS pada herbivora dibandingkan dengan tanaman yang tidak tertarik, dan selaras dalam pola ekspresinya. Faktor transkripsi MYB8 dan gen struktural PAL1, PAL2, C4H dan 4CL di hulu jalur ini menunjukkan inisiasi transkripsi awal. Asiltransferase yang berperan dalam perakitan akhir fenolamida, seperti AT1, DH29, dan CV86, menunjukkan pola peningkatan regulasi yang berkepanjangan (Gambar S4). Pengamatan di atas menunjukkan bahwa inisiasi awal spesialisasi transkriptom dan peningkatan spesialisasi metabolomik selanjutnya merupakan mode yang saling terkait, yang mungkin disebabkan oleh sistem pengaturan sinkron yang memulai respons pertahanan yang kuat.
Konfigurasi ulang dalam pensinyalan hormon tumbuhan bertindak sebagai lapisan pengaturan yang mengintegrasikan informasi herbivora untuk memprogram ulang fisiologi tumbuhan. Setelah simulasi herbivora, kami mengukur dinamika kumulatif kategori hormon tumbuhan utama dan memvisualisasikan ko-ekspresi temporal di antara mereka [koefisien korelasi Pearson (PCC) > 0,4] (Gambar 3A). Seperti yang diharapkan, hormon tumbuhan yang terkait dengan biosintesis terhubung dalam jaringan ko-ekspresi hormon tumbuhan. Selain itu, spesifisitas metabolik (indeks Si) dipetakan ke jaringan ini untuk menyoroti hormon tumbuhan yang diinduksi oleh perlakuan yang berbeda. Dua area utama respons spesifik herbivora digambarkan: satu berada di kluster JA, di mana JA (bentuk aktif biologisnya JA-Ile) dan turunan JA lainnya menunjukkan skor Si tertinggi; yang lainnya adalah etilen (ET). Gibberellin hanya menunjukkan peningkatan moderat dalam spesifisitas herbivora, sementara hormon tumbuhan lainnya, seperti sitokinin, auksin, dan asam absisat, memiliki spesifisitas induksi yang rendah untuk herbivora. Dibandingkan dengan penggunaan W + W saja, amplifikasi nilai puncak turunan JA melalui aplikasi OS (W + OS) pada dasarnya dapat diubah menjadi indikator spesifik yang kuat untuk JA. Secara tak terduga, OSM dan OSS1 dengan kandungan elisitor yang berbeda diketahui menyebabkan akumulasi JA dan JA-Ile yang serupa. Berbeda dengan OSS1, OSM secara spesifik dan kuat diinduksi oleh OSM, sedangkan OSS1 tidak memperkuat respons luka basal (Gambar 3B).
(A) Analisis jaringan ko-ekspresi berdasarkan perhitungan PCC dari simulasi kinetika akumulasi hormon tumbuhan yang diinduksi herbivora. Node mewakili satu hormon tumbuhan, dan ukuran node mewakili indeks Si spesifik untuk hormon tumbuhan antar perlakuan. (B) Akumulasi JA, JA-Ile, dan ET pada daun yang disebabkan oleh perlakuan berbeda yang ditunjukkan oleh warna berbeda: aprikot, W + OSM; biru, W + OSSM; hitam, W + W; abu-abu, C (kontrol). Tanda bintang menunjukkan perbedaan signifikan antara perlakuan dan kontrol (ANOVA dua arah diikuti oleh perbandingan berganda post hoc Tukey HSD, *** P <0,001). Analisis teori informasi dari (C)697 MS/MS (berkas data S1) dalam biosintesis JA dan spektrum persepsi yang terganggu (irAOC dan irCOI1) dan (D)585 MS/MS (berkas data S1) dalam ETR1 dengan sinyal ET yang terganggu. Dua simulasi perlakuan herbivora memicu garis tanaman dan tanaman kontrol kendaraan kosong (EV). Tanda bintang menunjukkan perbedaan signifikan antara perlakuan W+OS dan kontrol yang tidak rusak (ANOVA dua arah diikuti oleh perbandingan berganda post hoc Tukey HSD, *P<0,05, **P<0,01 dan ***P<0,001). (E) Grafik sebaran oposisi terhadap spesialisasi. Warna mewakili strain hasil rekayasa genetika yang berbeda; simbol mewakili metode perlakuan yang berbeda: segitiga, W + OSS1; persegi panjang, W + OSM; lingkaran C
Selanjutnya, kami menggunakan strain Nepenthes yang dimodifikasi secara genetik dan dilemahkan (irCOI1 dan sETR1) pada langkah-langkah kunci biosintesis JA dan ET (irAOC dan irACO) dan persepsi (irCOI1 dan sETR1) untuk menganalisis metabolisme kedua hormon tumbuhan ini pada herbivora dan kontribusi relatif dari pemrograman ulang. Konsisten dengan percobaan sebelumnya, kami mengkonfirmasi induksi OS herbivora pada tanaman pembawa kosong (EV) (Gambar 3, C hingga D) dan penurunan keseluruhan indeks Hj yang disebabkan oleh OSM, sementara indeks δj meningkat. Respons ini lebih jelas daripada respons yang dipicu oleh OSS1. Grafik dua garis menggunakan Hj dan δj sebagai koordinat menunjukkan deregulasi spesifik (Gambar 3E). Tren yang paling jelas adalah bahwa pada strain yang kekurangan sinyal JA, keragaman metabolom dan perubahan spesialisasi yang disebabkan oleh herbivora hampir sepenuhnya dihilangkan (Gambar 3C). Sebaliknya, persepsi ET yang diam pada tanaman sETR1, meskipun efek keseluruhan pada perubahan metabolisme herbivora jauh lebih rendah daripada sinyal JA, melemahkan perbedaan indeks Hj dan δj antara eksitasi OSM dan OSS1 (Gambar 3D dan Gambar S5). Hal ini menunjukkan bahwa selain fungsi inti transduksi sinyal JA, transduksi sinyal ET juga berfungsi sebagai penyesuaian halus respons metabolisme spesifik spesies herbivora. Konsisten dengan fungsi penyesuaian halus ini, tidak ada perubahan dalam induksi metabolom secara keseluruhan pada tanaman sETR1. Di sisi lain, dibandingkan dengan tanaman sETR1, tanaman irACO menginduksi amplitudo perubahan metabolisme keseluruhan yang serupa yang disebabkan oleh herbivora, tetapi menunjukkan skor Hj dan δj yang berbeda secara signifikan antara tantangan OSM dan OSS1 (Gambar S5).
Untuk mengidentifikasi metabolit khusus yang memberikan kontribusi penting terhadap respons spesifik spesies herbivora dan menyempurnakan produksinya melalui sinyal ET, kami menggunakan metode MS/MS struktural yang telah dikembangkan sebelumnya. Metode ini bergantung pada metode bi-clustering untuk menyimpulkan kembali famili metabolik dari fragmen MS/MS [produk titik ternormalisasi (NDP)] dan skor kesamaan berdasarkan kehilangan netral (NL). Kumpulan data MS/MS yang dibangun melalui analisis garis transgenik ET menghasilkan 585 MS/MS (berkas data S1), yang kemudian dipecah dengan mengelompokkannya menjadi tujuh modul MS/MS utama (M) (Gambar 4A). Beberapa modul ini dikemas padat dengan metabolit khusus yang telah dikarakterisasi sebelumnya: misalnya, M1, M2, M3, M4, dan M7 kaya akan berbagai turunan fenol (M1), glikosida flavonoid (M2), gula asil (M3 dan M4), dan 17-HGL-DTG (M7). Selain itu, informasi spesifik metabolik (indeks Si) dari metabolit tunggal di setiap modul dihitung, dan distribusi Si-nya dapat dilihat secara intuitif. Singkatnya, spektrum MS/MS yang menunjukkan herbivori tinggi dan spesifisitas genotipe ditandai dengan nilai Si yang tinggi, dan statistik kurtosis menunjukkan distribusi bulu di sudut kanan ekor. Salah satu distribusi koloid kurus tersebut terdeteksi di M1, di mana fenol amida menunjukkan fraksi Si tertinggi (Gambar 4B). 17-HGL-DTG yang diinduksi herbivori yang disebutkan sebelumnya di M7 menunjukkan skor Si moderat, menunjukkan tingkat regulasi diferensial yang moderat antara dua tipe OS. Sebaliknya, sebagian besar metabolit khusus yang diproduksi secara konstitutif, seperti rutin, CGA, dan gula asil, termasuk di antara skor Si terendah. Untuk lebih mengeksplorasi kompleksitas struktural dan distribusi Si antara metabolit khusus, jaringan molekuler dibangun untuk setiap modul (Gambar 4B). Prediksi penting dari teori OD (dirangkum dalam Gambar 1B) adalah bahwa reorganisasi metabolit khusus setelah herbivori akan menyebabkan perubahan satu arah pada metabolit dengan nilai pertahanan tinggi, terutama dengan meningkatkan spesifisitasnya (berlawanan dengan distribusi acak) Mode) Metabolit pertahanan yang diprediksi oleh teori MT. Sebagian besar turunan fenol yang terakumulasi dalam M1 secara fungsional terkait dengan penurunan kinerja serangga (32). Ketika membandingkan nilai Si dalam metabolit M1 antara daun yang diinduksi dan daun penyusun tanaman kontrol EV pada 24 jam, kami mengamati bahwa spesifisitas metabolik banyak metabolit setelah serangga herbivori memiliki tren peningkatan yang signifikan (Gambar 4C). Peningkatan spesifik nilai Si hanya terdeteksi pada fenolamida pertahanan, tetapi tidak ada peningkatan nilai Si yang terdeteksi pada fenol lain dan metabolit yang tidak diketahui yang ada bersamaan dalam modul ini. Ini adalah model khusus, yang terkait dengan teori OD. Prediksi utama perubahan metabolik yang disebabkan oleh herbivora konsisten. Untuk menguji apakah kekhususan spektrum fenolamida ini disebabkan oleh ET spesifik OS, kami memplot indeks Si metabolit dan menyebabkan nilai ekspresi diferensial antara OSM dan OSS1 pada genotipe EV dan sETR1 (Gambar 4D). Pada sETR1, perbedaan yang disebabkan fenamida antara OSM dan OSS1 sangat berkurang. Metode pengelompokan ganda juga diterapkan pada data MS/MS yang dikumpulkan pada strain dengan JA yang tidak mencukupi untuk menyimpulkan modul MS/MS utama yang terkait dengan spesialisasi metabolisme yang diatur oleh JA (Gambar S6).
(A) Hasil pengelompokan 585 MS/MS berdasarkan fragmen bersama (kesamaan NDP) dan kehilangan netral bersama (kesamaan NL) menghasilkan modul (M) yang konsisten dengan famili senyawa yang diketahui, atau dengan komposisi metabolit yang tidak diketahui atau dimetabolisme dengan buruk. Di samping setiap modul, distribusi spesifik metabolit (MS/MS) (Si) ditunjukkan. (B) Jaringan molekuler modular: Node mewakili MS/MS dan edge, skor MS/MS NDP (merah) dan NL (biru) (batas, > 0,6). Indeks spesifisitas metabolit bertingkat (Si) diwarnai berdasarkan modul (kiri) dan dipetakan ke jaringan molekuler (kanan). (C) Modul M1 tanaman EV dalam keadaan konstitutif (kontrol) dan terinduksi (herbivora simulasi) pada 24 jam: diagram jaringan molekuler (nilai Si adalah ukuran node, fenolamida defensif disorot dengan warna biru). (D) Diagram jaringan molekuler M1 dari garis spektrum sETR1 dengan persepsi EV dan ET yang terganggu: senyawa fenolik diwakili oleh simpul lingkaran hijau, dan perbedaan signifikan (nilai P) antara perlakuan W + OSM dan W + OSS1 sebagai ukuran simpul. CP, N-caffeoyl-tyrosine; CS, N-caffeoyl-spermidine; FP, N-ferulic acid ester-uric acid; FS, N-ferulyl-spermidine; CoP, N', N “-Coumarolyl-tyrosine; DCS, N', N”-dicaffeoyl-spermidine; CFS, N', N”-caffeoyl, feruloyl-spermidine; Lycium barbarum dalam wolfberry Son; Nick. O-AS, O-acyl sugar.
Kami memperluas analisis lebih lanjut dari satu genotipe Nepenthes yang dilemahkan ke populasi alami, di mana perubahan intraspesifik yang kuat pada tingkat JA herbivora dan tingkat metabolit spesifik telah dijelaskan sebelumnya pada populasi alami (26). Gunakan kumpulan data ini untuk mencakup 43 plasma nutfah. Plasma nutfah ini terdiri dari 123 spesies tanaman dari N. pallens. Tanaman ini diambil dari biji yang dikumpulkan di berbagai habitat asli di Utah, Nevada, Arizona, dan California (Gambar S7), kami menghitung keragaman metabolom (di sini disebut tingkat populasi) keragaman β) dan spesialisasi yang disebabkan oleh OSM. Konsisten dengan penelitian sebelumnya, kami mengamati berbagai perubahan metabolisme di sepanjang sumbu Hj dan δj, menunjukkan bahwa plasma nutfah memiliki perbedaan signifikan dalam plastisitas respons metabolismenya terhadap herbivora (Gambar S7). Organisasi ini mengingatkan pada pengamatan sebelumnya tentang rentang dinamis perubahan JA yang disebabkan oleh herbivora, dan telah mempertahankan nilai yang sangat tinggi dalam satu populasi (26, 36). Dengan menggunakan JA dan JA-Ile untuk menguji korelasi tingkat keseluruhan antara Hj dan δj, kami menemukan bahwa terdapat korelasi positif yang signifikan antara JA dan indeks keragaman dan spesialisasi metabolom β (Gambar S7). Hal ini menunjukkan bahwa heterogenitas yang diinduksi oleh herbivora dalam induksi JA yang terdeteksi pada tingkat populasi mungkin disebabkan oleh polimorfisme metabolik utama yang disebabkan oleh seleksi dari herbivora serangga.
Penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa jenis tembakau sangat berbeda dalam tipe dan ketergantungan relatif pada pertahanan metabolik yang diinduksi dan konstitutif. Dipercaya bahwa perubahan dalam transduksi sinyal anti-herbivora dan kemampuan pertahanan ini diatur oleh tekanan populasi serangga, siklus hidup tanaman, dan biaya produksi pertahanan di ceruk tempat spesies tertentu tumbuh. Kami mempelajari konsistensi perombakan metabolom daun yang diinduksi oleh herbivora dari enam spesies Nicotiana asli Amerika Utara dan Amerika Selatan. Spesies-spesies ini berkerabat dekat dengan Nepenthes Amerika Utara, yaitu Nicolas Bociflo. La, N. nicotinis, Nicotiana n. attenuated grass, Nicotiana tabacum, tembakau linear, tembakau (Nicotiana spegazzinii) dan tembakau daun (Nicotiana obtusifolia) (Gambar 5A) (37). Enam dari spesies ini, termasuk spesies N. please yang telah dikarakterisasi dengan baik, adalah tanaman tahunan dari klad petunia, dan N. obtusifolia adalah tanaman tahunan dari klad saudara Trigonophyllae (38). Selanjutnya, induksi W + W, W + OSM dan W + OSS1 dilakukan pada tujuh spesies ini untuk mempelajari penataan ulang metabolisme tingkat spesies pada pola makan serangga.
(A) Pohon filogenetik bootstrap berdasarkan kemungkinan maksimum [untuk sintesis glutamin nuklir (38)] dan distribusi geografis tujuh spesies Nicotiana yang berkerabat dekat (warna berbeda) (37). (B) Plot sebaran keragaman khusus untuk profil metabolik tujuh spesies Nicotiana (939 MS/MS; berkas data S1). Pada tingkat spesies, keragaman metabolom berkorelasi negatif dengan tingkat spesialisasi. Analisis korelasi tingkat spesies antara keragaman metabolik dan spesialisasi serta akumulasi JA ditunjukkan pada Gambar 2. S9. Warna, jenis berbeda; segitiga, W + OSS1; persegi panjang, W + OSM; (C) Dinamika JA dan JA-Ile Nicotiana diurutkan menurut amplitudo eksitasi OS (ANOVA dua arah dan perbandingan berganda pasca-Tukey HSD, * P <0,05, ** P <0,01 dan * ** Untuk perbandingan W + OS dan W + W, P <0,001). Diagram kotak (box plot) dari (D) keanekaragaman dan (E) spesialisasi setiap spesies setelah simulasi herbivora dan metil JA (MeJA). Tanda bintang (*) menunjukkan perbedaan signifikan antara W + OS dan W + W atau lanolin ditambah W (Lan + W) atau Lan ditambah MeJA (Lan + MeJa) dan kontrol Lan (analisis varians dua arah, diikuti oleh perbandingan berganda post hoc Tukey's HSD, *P<0,05, **P<0,01 dan ***P<0,001).
Dengan menggunakan metode kluster ganda, kami mengidentifikasi 9 modul dari 939 MS/MS (berkas data S1). Komposisi MS/MS yang dikonfigurasi ulang oleh perlakuan yang berbeda sangat bervariasi di antara modul yang berbeda antar spesies (Gambar S8). Visualisasi Hj (disebut di sini sebagai keanekaragaman γ tingkat spesies) dan δj mengungkapkan bahwa spesies yang berbeda berkumpul menjadi kelompok yang sangat berbeda dalam ruang metabolik, di mana pembagian tingkat spesies biasanya lebih menonjol daripada eksitasi. Dengan pengecualian N. linear dan N. obliquus, mereka menunjukkan rentang dinamis efek induksi yang luas (Gambar 5B). Sebaliknya, spesies seperti N. purpurea dan N. obtusifolia memiliki respons metabolik yang kurang jelas terhadap perlakuan, tetapi metabolomnya lebih beragam. Distribusi spesifik spesies dari respons metabolik yang diinduksi menghasilkan korelasi negatif yang signifikan antara spesialisasi dan keanekaragaman gamma (PCC = -0,46, P = 4,9×10⁻⁸). Perubahan kadar JA yang diinduksi OS berkorelasi positif dengan spesialisasi metabolom, dan berkorelasi negatif dengan keragaman gamma metabolik yang ditunjukkan oleh setiap spesies (Gambar 5B dan Gambar S9). Perlu dicatat bahwa spesies yang secara umum disebut sebagai spesies "respons sinyal" pada Gambar 5C, seperti nematoda Nepenthes, Nepenthes nepenthes, Nepenthes akut, dan Nepenthes yang dilemahkan, menyebabkan tanda-tanda signifikan pada 30 menit. Wabah JA dan JA-Ile spesifik OS baru-baru ini, sementara bakteri lain yang disebut "tidak responsif sinyal", seperti Nepenthes mills, Nepenthes powdery dan N. obtusifolia hanya menunjukkan induksi JA-Ile Edge tanpa spesifisitas OS apa pun (Gambar 5C). Pada tingkat metabolik, seperti yang disebutkan di atas, untuk Nepenthes yang dilemahkan, zat responsif sinyal menunjukkan spesifisitas OS dan secara signifikan meningkatkan δj, sementara mengurangi Hj. Efek priming spesifik OS ini tidak terdeteksi pada spesies yang diklasifikasikan sebagai spesies non-reaktif sinyal (Gambar 5, D dan E). Metabolit spesifik OS lebih sering dimiliki bersama oleh spesies yang responsif terhadap sinyal, dan gugus sinyal ini berkelompok dengan spesies yang memiliki respons sinyal lebih lemah, sementara spesies dengan respons sinyal lebih lemah menunjukkan ketergantungan yang lebih sedikit (Gambar S8). Hasil ini menunjukkan bahwa induksi JA spesifik OS dan konfigurasi ulang metabolom hilir spesifik OS saling terkait pada tingkat spesies.
Selanjutnya, kami menggunakan pasta lanolin yang mengandung metil JA (MeJA) untuk mengobati tanaman guna menyelidiki apakah mode pengikatan ini dibatasi oleh ketersediaan JA yang diberikan oleh JA eksogen, yang akan berada di sitoplasma tanaman. Deesterifikasi cepat terjadi pada JA. Kami menemukan tren yang sama dari perubahan bertahap dari spesies responsif sinyal menjadi spesies non-responsif sinyal yang disebabkan oleh pasokan JA yang berkelanjutan (Gambar 5, D dan E). Singkatnya, perlakuan MeJA sangat memprogram ulang metabolom nematoda linier, N. obliquus, N. aquaticus, N. pallens, dan N. mikimotoi, yang menghasilkan peningkatan signifikan pada δj dan penurunan pada Hj. N. purpurea hanya menunjukkan peningkatan pada δj, tetapi tidak pada Hj. N. obtusifolia, yang sebelumnya telah terbukti mengakumulasi kadar JA yang sangat rendah, juga menunjukkan respons yang buruk terhadap perlakuan MeJA dalam hal konfigurasi ulang metabolom. Hasil ini menunjukkan bahwa produksi JA atau transduksi sinyal secara fisiologis dibatasi pada spesies yang tidak responsif terhadap sinyal. Untuk menguji hipotesis ini, kami mempelajari empat spesies (N. pallens, N. mills, N. pink dan N. microphylla) yang diinduksi oleh transkriptom W + W, W + OSMs dan W + OSS1 (39). Konsisten dengan pola perombakan metabolom, spesies-spesies tersebut terpisah dengan baik dalam ruang transkriptom, di mana N. attenuated menunjukkan RDPI yang diinduksi OS tertinggi, sedangkan N. gracilis memiliki yang terendah (Gambar 6A). Namun, ditemukan bahwa keragaman transkriptom yang diinduksi oleh N. oblonga adalah yang terendah di antara keempat spesies, bertentangan dengan keragaman metabonomik tertinggi N. oblonga yang sebelumnya ditunjukkan pada tujuh spesies. Studi sebelumnya telah menunjukkan bahwa serangkaian gen yang terkait dengan sinyal pertahanan awal, termasuk sinyal JA, menjelaskan spesifisitas respons pertahanan awal yang diinduksi oleh elisitor terkait herbivora pada spesies Nicotiana (39). Perbandingan jalur pensinyalan JA antara keempat spesies ini mengungkapkan pola yang menarik (Gambar 6B). Sebagian besar gen dalam jalur ini, seperti AOC, OPR3, ACX, dan COI1, menunjukkan tingkat induksi yang relatif tinggi pada keempat spesies ini. Namun, gen kunci, JAR4, mengubah JA menjadi bentuk aktif biologisnya, yaitu transkrip JA-Ile yang terakumulasi, dan tingkat transkripsinya sangat rendah, terutama pada N. mills, Nepenthes pieris, dan N. microphylla. Selain itu, hanya transkrip gen lain, AOS, yang tidak terdeteksi pada N. bifidum. Perubahan ekspresi gen ini mungkin bertanggung jawab atas fenotipe ekstrem yang diinduksi oleh produksi JA yang rendah pada spesies anergik sinyal dan induksi N. gracilis.
(A) Analisis teori informasi tentang pemrograman ulang respons transkripsi awal dari empat spesies tembakau yang berkerabat dekat yang diambil sampelnya 30 menit setelah induksi herbivori. RDPI dihitung dengan membandingkan daun yang diinduksi oleh OS herbivora dengan kontrol luka. Warna menunjukkan spesies yang berbeda, dan simbol menunjukkan metode perlakuan yang berbeda. (B) Analisis ekspresi gen dalam jalur pensinyalan JA di antara empat spesies. Jalur JA yang disederhanakan ditunjukkan di sebelah plot kotak. Warna yang berbeda menunjukkan metode pemrosesan yang berbeda. Tanda bintang menunjukkan bahwa ada perbedaan signifikan antara perlakuan W + OS dan kontrol W + W (untuk uji t Student untuk perbedaan berpasangan, *P<0,05, **P<0,01 dan ***P<0,001). OPDA, asam 12-oksofitodienoat; OPC-8: asam 0,3-okso-2(2′(Z)-pentenil)-siklopentana-1-oktanoat.
Pada bagian terakhir, kami mempelajari bagaimana penataan ulang metabolom spesifik spesies serangga pada berbagai spesies tanaman dapat meningkatkan ketahanan terhadap herbivora. Penelitian sebelumnya menekankan genus Nicotiana. Ketahanan mereka terhadap Ms dan larva sangat berbeda (40). Di sini, kami mempelajari hubungan antara model ini dan plastisitas metabolik mereka. Dengan menggunakan empat spesies tembakau di atas, dan menguji korelasi antara keragaman dan spesialisasi metabolom yang disebabkan oleh herbivora dan ketahanan tanaman terhadap Ms dan Sl, kami menemukan bahwa ketahanan, keragaman, dan spesialisasi terhadap Sl generalis semuanya berkorelasi positif, sedangkan korelasi antara ketahanan terhadap betina ahli dan spesialisasi lemah, dan korelasi dengan keragaman tidak signifikan (Gambar S10). Mengenai ketahanan S1, baik N. chinensis dan N. gracilis yang dilemahkan, yang sebelumnya telah ditunjukkan menunjukkan tingkat transduksi sinyal JA dan plastisitas metabolom, memiliki respons yang sangat berbeda terhadap induksi herbivora, dan mereka juga menunjukkan ketahanan tinggi yang serupa. Seks.
Dalam enam puluh tahun terakhir, teori pertahanan tanaman telah menyediakan kerangka teoritis, berdasarkan mana para peneliti telah memprediksi sejumlah besar evolusi dan fungsi metabolit khusus tanaman. Sebagian besar teori ini tidak mengikuti prosedur normal inferensi yang kuat (41). Mereka mengusulkan prediksi kunci (3) pada tingkat analisis yang sama. Ketika pengujian prediksi kunci memungkinkan teori spesifik untuk dianalisis, ini akan membuat bidang ini bergerak maju. Teori-teori tersebut didukung, tetapi teori lain ditolak (42). Sebaliknya, teori baru membuat prediksi pada tingkat analisis yang berbeda dan menambahkan lapisan pertimbangan deskriptif baru (42). Namun, dua teori yang diusulkan pada tingkat fungsional, MT dan OD, dapat dengan mudah dijelaskan sebagai prediksi penting dari perubahan metabolisme khusus yang disebabkan oleh herbivora: teori OD percaya bahwa perubahan dalam "ruang" metabolisme khusus sangat terarah. Teori MT percaya bahwa perubahan ini akan tidak terarah dan terletak secara acak dalam ruang metabolisme, dan cenderung memiliki metabolit bernilai pertahanan tinggi. Pemeriksaan sebelumnya terhadap prediksi OD dan MT telah diuji menggunakan serangkaian senyawa "pertahanan" a priori yang sempit. Tes yang berpusat pada metabolit ini menghalangi kemampuan untuk menganalisis sejauh mana dan lintasan konfigurasi ulang metabolom selama herbivori, dan tidak memungkinkan pengujian dalam kerangka statistik yang konsisten untuk memerlukan prediksi kunci yang dapat dipertimbangkan secara keseluruhan. Kuantifikasi perubahan dalam metabolom tanaman. Di sini, kami menggunakan teknologi inovatif dalam metabolomik berdasarkan MS komputasional dan melakukan analisis MS dekonvolusi dalam mata uang umum deskriptor teori informasi untuk menguji perbedaan antara dua prediksi kunci yang diusulkan pada tingkat metabolomik global. Teori informasi telah diterapkan di banyak bidang, terutama dalam konteks penelitian keanekaragaman hayati dan aliran nutrisi (43). Namun, sejauh yang kami ketahui, ini adalah aplikasi pertama yang digunakan untuk menggambarkan ruang informasi metabolik tanaman dan memecahkan masalah ekologis yang terkait dengan perubahan metabolik sementara sebagai respons terhadap isyarat lingkungan. Secara khusus, kemampuan metode ini terletak pada kemampuannya untuk membandingkan pola di dalam dan di antara spesies tanaman untuk memeriksa bagaimana herbivora telah berevolusi dari spesies yang berbeda ke pola makroevolusi antar spesies pada berbagai tingkat evolusi metabolisme.
Analisis komponen utama (PCA) mengubah kumpulan data multivariat menjadi ruang pengurangan dimensi sehingga tren utama data dapat dijelaskan, sehingga biasanya digunakan sebagai teknik eksplorasi untuk menguraikan kumpulan data, seperti dekonvolusi metabolom. Namun, pengurangan dimensi akan menghilangkan sebagian kandungan informasi dalam kumpulan data, dan PCA tidak dapat memberikan informasi kuantitatif tentang karakteristik yang sangat relevan dengan teori ekologi, seperti: bagaimana herbivora mengkonfigurasi ulang keanekaragaman di bidang khusus (misalnya, kekayaan spesies, distribusi, dan kelimpahan) metabolit? Metabolit mana yang merupakan prediktor keadaan terinduksi dari herbivora tertentu? Dari perspektif spesifisitas, keanekaragaman, dan induksibilitas, kandungan informasi dari profil metabolit spesifik daun diuraikan, dan ditemukan bahwa konsumsi herbivora dapat mengaktifkan metabolisme spesifik. Secara tak terduga, kami mengamati bahwa, seperti yang dijelaskan dalam indikator teori informasi yang diterapkan, situasi metabolisme yang dihasilkan memiliki tumpang tindih yang besar setelah serangan dua herbivora (generalist pemakan malam Sl) dan ahli Solanaceae Ms. Meskipun perilaku makan dan konsentrasinya berbeda secara signifikan. Inisiator konjugat asam lemak-asam amino (FAC) dalam OS (31). Dengan menggunakan OS herbivora untuk mengobati luka tusukan standar, simulasi pengobatan herbivora juga menunjukkan tren yang serupa. Prosedur standar ini untuk mensimulasikan respons tanaman terhadap serangan herbivora menghilangkan faktor-faktor pengganggu yang disebabkan oleh perubahan perilaku makan herbivora, yang menyebabkan berbagai tingkat kerusakan pada waktu yang berbeda (34). FAC, yang diketahui sebagai penyebab utama OSM, mengurangi JAS dan respons hormon tanaman lainnya di OSS1, sementara OSS1 berkurang ratusan kali (31). Namun, OSS1 menyebabkan tingkat akumulasi JA yang serupa dibandingkan dengan OSM. Sebelumnya telah ditunjukkan bahwa respons JA pada Nepenthes yang dilemahkan sangat sensitif terhadap OSM, di mana FAC dapat mempertahankan aktivitasnya bahkan jika diencerkan 1:1000 dengan air (44). Oleh karena itu, dibandingkan dengan OSM, meskipun FAC dalam OSS1 sangat rendah, namun cukup untuk menginduksi munculnya JA yang cukup. Studi sebelumnya telah menunjukkan bahwa protein mirip porin (45) dan oligosakarida (46) dapat digunakan sebagai petunjuk molekuler untuk memicu respons pertahanan tanaman dalam OSS1. Namun, masih belum jelas apakah elisitor ini dalam OSS1 bertanggung jawab atas akumulasi JA yang diamati dalam penelitian ini.
Meskipun hanya sedikit penelitian yang menggambarkan sidik jari metabolik diferensial yang disebabkan oleh aplikasi herbivora yang berbeda atau JA atau SA (asam salisilat) eksogen (47), belum ada yang meneliti gangguan spesifik spesies herbivora pada jaringan tumbuhan rumput dan pengaruhnya terhadap informasi pribadi spesifik. Dampak keseluruhan metabolisme dipelajari secara sistematis. Analisis ini lebih lanjut mengkonfirmasi bahwa koneksi jaringan hormon internal dengan hormon tumbuhan lain selain JA membentuk spesifisitas reorganisasi metabolik yang disebabkan oleh herbivora. Secara khusus, kami mendeteksi bahwa ET yang disebabkan oleh OSM secara signifikan lebih besar daripada yang disebabkan oleh OSS1. Mode ini konsisten dengan kandungan FAC yang lebih tinggi pada OSM, yang merupakan kondisi yang diperlukan dan cukup untuk memicu ledakan ET (48). Dalam konteks interaksi antara tumbuhan dan herbivora, fungsi pensinyalan ET pada dinamika metabolit spesifik tumbuhan masih sporadis dan hanya menargetkan satu kelompok senyawa. Selain itu, sebagian besar penelitian telah menggunakan aplikasi eksogen ET atau prekursornya atau berbagai inhibitor untuk mempelajari regulasi ET, di mana aplikasi kimia eksogen ini akan menghasilkan banyak efek samping non-spesifik. Sepengetahuan kami, penelitian ini merupakan pemeriksaan sistematis skala besar pertama tentang peran ET dalam penggunaan ET untuk menghasilkan dan merasakan tanaman transgenik yang terganggu untuk mengoordinasikan dinamika metabolom tanaman. Induksi ET spesifik herbivora pada akhirnya dapat memodulasi respons metabolom. Yang paling signifikan adalah manipulasi transgenik gen biosintesis ET (ACO) dan persepsi (ETR1) yang mengungkapkan akumulasi de novo fenolamida spesifik herbivora. Sebelumnya telah ditunjukkan bahwa ET dapat menyempurnakan akumulasi nikotin yang diinduksi JA dengan mengatur putrescine N-methyltransferase (49). Namun, dari sudut pandang mekanis, tidak jelas bagaimana ET menyempurnakan induksi fenamida. Selain fungsi transduksi sinyal ET, fluks metabolik juga dapat dialihkan ke S-adenosil-1-metionin untuk mengatur investasi dalam poliaminofenol amida. S-adenosil-1-metionin adalah ET dan perantara umum jalur biosintesis poliamin. Mekanisme bagaimana sinyal ET mengatur kadar fenolamida perlu diteliti lebih lanjut.
Untuk waktu yang lama, karena banyaknya metabolit khusus dengan struktur yang tidak diketahui, perhatian intensif terhadap kategori metabolik spesifik belum mampu menilai secara ketat perubahan temporal keragaman metabolik setelah interaksi biologis. Saat ini, berdasarkan analisis teori informasi, hasil utama akuisisi spektrum MS/MS berdasarkan metabolit yang tidak bias adalah bahwa herbivora yang memakan atau mensimulasikan herbivora terus mengurangi keragaman metabolik keseluruhan metabolom daun sambil meningkatkan tingkat spesialisasinya. Peningkatan sementara spesifisitas metabolom yang disebabkan oleh herbivora ini terkait dengan peningkatan sinergis spesifisitas transkriptom. Fitur yang paling berkontribusi pada spesialisasi metabolom yang lebih besar ini (memiliki nilai Si yang lebih tinggi) adalah metabolit khusus dengan fungsi herbivora yang telah dikarakterisasi sebelumnya. Model ini konsisten dengan prediksi teori OD, tetapi prediksi MT yang terkait dengan keacakan pemrograman ulang metabolom tidak konsisten. Namun, data ini juga konsisten dengan prediksi model campuran (MT terbaik; Gambar 1B), karena metabolit lain yang tidak dikarakterisasi dengan fungsi pertahanan yang tidak diketahui mungkin masih mengikuti distribusi Si acak.
Pola penting yang lebih lanjut ditangkap oleh penelitian ini adalah bahwa dari tingkat mikro-evolusi (tanaman tunggal dan populasi tembakau) hingga skala evolusi yang lebih besar (spesies tembakau yang berkerabat dekat), berbagai tingkat organisasi evolusi berada dalam “pertahanan terbaik” Terdapat perbedaan signifikan dalam kemampuan herbivora. Moore et al. (20) dan Kessler dan Kalske (1) secara independen mengusulkan untuk mengubah tiga tingkat fungsional keanekaragaman hayati yang awalnya dibedakan oleh Whittaker (50) menjadi perubahan temporal konstitutif dan terinduksi dari keanekaragaman kimia; para penulis ini tidak merangkum prosedur untuk pengumpulan data metabolom skala besar dan juga tidak menguraikan bagaimana menghitung keanekaragaman metabolik dari data ini. Dalam penelitian ini, penyesuaian kecil pada klasifikasi fungsional Whittaker akan mempertimbangkan keanekaragaman metabolik α sebagai keanekaragaman spektrum MS/MS pada tanaman tertentu, dan keanekaragaman metabolik β sebagai metabolisme intraspesifik dasar dari sekelompok populasi, dan keanekaragaman metabolik γ akan menjadi perluasan analisis spesies serupa.
Sinyal JA sangat penting untuk berbagai respons metabolisme herbivora. Namun, kurangnya pengujian kuantitatif yang ketat mengenai kontribusi regulasi intraspesifik biosintesis JA terhadap keragaman metabolom, dan apakah sinyal JA merupakan lokasi umum untuk diversifikasi metabolisme yang diinduksi stres pada skala makroevolusi yang lebih tinggi masih belum jelas. Kami mengamati bahwa sifat herbivora Nepenthes menginduksi spesialisasi metabolom dan variasi spesialisasi metabolom dalam populasi spesies Nicotiana dan di antara spesies Nicotiana yang berkerabat dekat secara sistematis berkorelasi positif dengan pensinyalan JA. Selain itu, ketika sinyal JA terganggu, spesifisitas metabolisme yang diinduksi oleh herbivora dengan genotipe tunggal akan hilang (Gambar 3, C dan E). Karena perubahan spektrum metabolisme populasi Nepenthes yang secara alami dilemahkan sebagian besar bersifat kuantitatif, perubahan dalam keragaman dan spesifisitas β metabolisme dalam analisis ini mungkin sebagian besar disebabkan oleh eksitasi kuat kategori senyawa kaya metabolit. Kelas senyawa ini mendominasi sebagian profil metabolom dan menyebabkan korelasi positif dengan sinyal JA.
Karena mekanisme biokimia spesies tembakau yang berkerabat dekat sangat berbeda, metabolit diidentifikasi secara spesifik dalam aspek kualitatif, sehingga lebih analitis. Pemrosesan teori informasi dari profil metabolik yang ditangkap mengungkapkan bahwa induksi herbivora memperburuk pertukaran antara keragaman gamma metabolik dan spesialisasi. Sinyal JA memainkan peran sentral dalam pertukaran ini. Peningkatan spesialisasi metabolom konsisten dengan prediksi OD utama dan berkorelasi positif dengan sinyal JA, sedangkan sinyal JA berkorelasi negatif dengan keragaman gamma metabolik. Model-model ini menunjukkan bahwa kapasitas OD tanaman terutama ditentukan oleh plastisitas JA, baik pada skala mikroevolusi maupun pada skala evolusi yang lebih besar. Eksperimen aplikasi JA eksogen yang mengatasi cacat biosintesis JA lebih lanjut mengungkapkan bahwa spesies tembakau yang berkerabat dekat dapat dibedakan menjadi spesies responsif sinyal dan non-responsif sinyal, seperti halnya mode plastisitas JA dan metabolom yang diinduksi oleh herbivora. Spesies yang tidak responsif terhadap sinyal tidak dapat merespons karena ketidakmampuan mereka untuk menghasilkan JA endogen dan oleh karena itu tunduk pada keterbatasan fisiologis. Hal ini mungkin disebabkan oleh mutasi pada beberapa gen kunci dalam jalur pensinyalan JA (AOS dan JAR4 pada N. crescens). Hasil ini menyoroti bahwa pola makroevolusi antar spesies ini mungkin terutama didorong oleh perubahan dalam persepsi dan responsivitas hormon internal.
Selain interaksi antara tumbuhan dan herbivora, eksplorasi keanekaragaman metabolik berkaitan dengan semua kemajuan teoritis penting dalam penelitian adaptasi biologis terhadap lingkungan dan evolusi sifat fenotipik kompleks. Dengan meningkatnya jumlah data yang diperoleh oleh instrumen MS modern, pengujian hipotesis tentang keanekaragaman metabolik kini dapat melampaui perbedaan metabolit individu/kategori dan melakukan analisis global untuk mengungkap pola yang tidak terduga. Dalam proses analisis skala besar, metafora penting adalah gagasan untuk merancang peta bermakna yang dapat digunakan untuk mengeksplorasi data. Oleh karena itu, hasil penting dari kombinasi metabolomik MS/MS tak bias dan teori informasi saat ini adalah menyediakan metrik sederhana yang dapat digunakan untuk membangun peta guna menelusuri keanekaragaman metabolik pada skala taksonomi yang berbeda. Ini adalah persyaratan dasar dari metode ini. Studi tentang evolusi mikro/makro dan ekologi komunitas.
Pada tingkat makro-evolusi, inti dari teori ko-evolusi tumbuhan-serangga Ehrlich dan Raven (51) adalah memprediksi bahwa variasi keragaman metabolisme antar spesies merupakan penyebab diversifikasi garis keturunan tumbuhan. Namun, dalam lima puluh tahun sejak publikasi karya penting ini, hipotesis ini jarang diuji (52). Hal ini sebagian besar disebabkan oleh karakteristik filogenetik dari karakteristik metabolisme yang sebanding di seluruh garis keturunan tumbuhan jarak jauh. Kelangkaan ini dapat digunakan untuk menargetkan metode analisis. Alur kerja MS/MS saat ini yang diproses oleh teori informasi mengkuantifikasi kesamaan struktural MS/MS dari metabolit yang tidak dikenal (tanpa seleksi metabolit sebelumnya) dan mengubah MS/MS ini menjadi satu set MS/MS, sehingga dalam metabolisme profesional, model makro-evolusi ini dibandingkan dalam skala klasifikasi. Indikator statistik sederhana. Prosesnya mirip dengan analisis filogenetik, yang dapat menggunakan penyelarasan urutan untuk mengkuantifikasi laju diversifikasi atau evolusi karakter tanpa prediksi sebelumnya.
Pada tingkat biokimia, hipotesis penyaringan Firn dan Jones (53) menunjukkan bahwa keragaman metabolisme dipertahankan pada tingkat yang berbeda untuk menyediakan bahan baku untuk menjalankan aktivitas biologis metabolit yang sebelumnya tidak terkait atau tersubstitusi. Metode teori informasi menyediakan kerangka kerja di mana transisi evolusi spesifik metabolit yang terjadi selama spesialisasi metabolit dapat dikuantifikasi sebagai bagian dari proses penyaringan evolusi yang diusulkan: adaptasi aktif secara biologis dari spesifisitas rendah ke spesifisitas tinggi metabolit yang dihambat dari lingkungan tertentu.
Secara keseluruhan, pada masa awal biologi molekuler, teori-teori pertahanan tanaman yang penting telah dikembangkan, dan metode deduktif berbasis hipotesis secara luas dianggap sebagai satu-satunya cara kemajuan ilmiah. Hal ini sebagian besar disebabkan oleh keterbatasan teknis dalam mengukur seluruh metabolom. Meskipun metode berbasis hipotesis sangat berguna dalam memilih mekanisme kausal lainnya, kemampuannya untuk memajukan pemahaman kita tentang jaringan biokimia lebih terbatas daripada metode komputasi yang saat ini tersedia dalam ilmu data intensif kontemporer. Oleh karena itu, teori-teori yang tidak dapat diprediksi jauh di luar cakupan data yang tersedia, sehingga siklus formula/uji hipotetis kemajuan di bidang penelitian tidak dapat dihapuskan (4). Kami memperkirakan bahwa alur kerja komputasi metabolomik yang diperkenalkan di sini dapat menghidupkan kembali minat pada isu-isu terkini (bagaimana) dan akhir (mengapa) dari keragaman metabolik, dan berkontribusi pada era baru ilmu data yang dipandu secara teoritis. Era ini meninjau kembali teori-teori penting yang menginspirasi generasi sebelumnya.
Pemberian makan herbivora secara langsung dilakukan dengan membesarkan larva instar kedua atau larva S1 pada satu daun tanaman kantong berwarna pucat dari satu tanaman mawar yang sedang berbunga, dengan 10 replikasi tanaman per tanaman. Larva serangga dijepit dengan penjepit, dan jaringan daun yang tersisa dikumpulkan 24 dan 72 jam setelah infeksi dan dibekukan dengan cepat, kemudian metabolitnya diekstrak.
Simulasikan perlakuan herbivora secara sinkron. Metodenya adalah menggunakan roda pola kain untuk menusuk tiga baris duri di setiap sisi tulang daun dari tiga daun yang telah sepenuhnya berkembang pada tanaman selama tahap pertumbuhan karangan bunga kain, dan segera aplikasikan Ms. yang diencerkan 1:5. Atau gunakan jari yang bersarung tangan untuk memasukkan S1 OS ke dalam luka tusukan. Panen dan olah daun seperti yang dijelaskan di atas. Gunakan metode yang telah dijelaskan sebelumnya untuk mengekstrak metabolit primer dan hormon tanaman (54).
Untuk aplikasi JA eksogen, tiga daun tangkai dari masing-masing enam tanaman mawar yang sedang berbunga dari setiap spesies diberi perlakuan dengan 20μl pasta lanolin yang mengandung 150μg MeJA (Lan + MeJA), dan 20μl lanolin ditambah perlakuan luka (Lan + W), atau menggunakan 20μl lanolin murni sebagai kontrol. Daun dipanen 72 jam setelah perlakuan, dibekukan cepat dalam nitrogen cair, dan disimpan pada suhu -80°C hingga digunakan.
Empat galur transgenik JA dan ET, yaitu irAOC (36), irCOI1 (55), irACO dan sETR1 (48), telah diidentifikasi dalam kelompok penelitian kami. irAOC menunjukkan penurunan yang kuat pada kadar JA dan JA-Ile, sedangkan irCOI1 tidak sensitif terhadap JA. Dibandingkan dengan EV, akumulasi JA-Ile meningkat. Demikian pula, irACO akan mengurangi produksi ET, dan dibandingkan dengan EV, sETR1, yang tidak sensitif terhadap ET, akan meningkatkan produksi ET.
Spektrometer laser fotoakustik (sensor ET real-time Sensor Sense ETD-300) digunakan untuk melakukan pengukuran ET secara non-invasif. Segera setelah perlakuan, setengah dari daun dipotong dan dipindahkan ke vial kaca tertutup 4 ml, dan ruang udara dibiarkan terisi selama 5 jam. Selama pengukuran, setiap vial dialiri udara murni sebanyak 2 liter/jam selama 8 menit, yang sebelumnya telah melewati katalis yang disediakan oleh Sensor Sense untuk menghilangkan CO2 dan air.
Data microarray awalnya dipublikasikan di (35) dan disimpan di National Center for Biotechnology Information (NCBI) Gene Expression Comprehensive Database (nomor akses GSE30287). Data yang sesuai dengan daun yang disebabkan oleh perlakuan W + OSMs dan kontrol yang tidak rusak diekstrak untuk penelitian ini. Intensitas mentah adalah log2. Sebelum analisis statistik, garis dasar dikonversi dan dinormalisasi ke persentil ke-75 menggunakan paket perangkat lunak R.
Data sekuensing RNA (RNA-seq) asli dari spesies Nicotiana diambil dari Arsip Bacaan Pendek NCBI (SRA), nomor proyeknya adalah PRJNA301787, yang dilaporkan oleh Zhou et al. (39) dan diproses seperti yang dijelaskan dalam (56). Data mentah yang diproses oleh W + W, W + OSM dan W + OSS1 yang sesuai dengan spesies Nicotiana dipilih untuk analisis dalam penelitian ini, dan diproses dengan cara berikut: Pertama, pembacaan RNA-seq mentah dikonversi ke format FASTQ. HISAT2 mengkonversi FASTQ ke SAM, dan SAMtools mengkonversi file SAM menjadi file BAM yang diurutkan. StringTie digunakan untuk menghitung ekspresi gen, dan metode ekspresinya adalah terdapat fragmen per seribu fragmen basa per juta fragmen transkripsi yang diurutkan.
Kolom kromatografi Acclaim (150 mm x 2,1 mm; ukuran partikel 2,2μm) yang digunakan dalam analisis dan kolom pelindung 4 mm x 4 mm terbuat dari bahan yang sama. Gradien biner berikut digunakan dalam sistem Kromatografi Cair Kinerja Ultra Tinggi (UHPLC) Dionex UltiMate 3000: 0 hingga 0,5 menit, isokratik 90% A [air deionisasi, 0,1% (v/v) asetonitril dan 0,05% asam format], 10% B (Asetonitril dan 0,05% asam format); 0,5 hingga 23,5 menit, fase gradien masing-masing adalah 10% A dan 90% B; 23,5 hingga 25 menit, isokratik 10% A dan 90% B. Laju alir adalah 400μl/menit. Untuk semua analisis MS, suntikkan eluen kolom ke dalam penganalisis quadrupole dan time-of-flight (qTOF) yang dilengkapi dengan sumber elektrospray yang beroperasi dalam mode ionisasi positif (tegangan kapiler, 4500 V; keluaran kapiler 130 V; suhu pengeringan 200°C; aliran udara pengeringan 10 liter/menit).
Lakukan analisis fragmen MS/MS (selanjutnya disebut MS/MS) yang tidak relevan atau tidak dapat dibedakan dari data untuk mendapatkan informasi struktural tentang profil metabolik keseluruhan yang terdeteksi. Konsep metode MS/MS yang tidak diskriminatif bergantung pada fakta bahwa kuadrupol memiliki jendela isolasi massa yang sangat besar [oleh karena itu, anggap semua sinyal rasio massa terhadap muatan (m/z) sebagai fragmen]. Karena alasan ini, karena instrumen Impact II tidak mampu membuat kemiringan CE, beberapa analisis independen dilakukan menggunakan nilai energi tumbukan disosiasi terinduksi tumbukan (CE) yang ditingkatkan. Singkatnya, pertama-tama analisis sampel dengan UHPLC-ionisasi elektrospray/qTOF-MS menggunakan mode spektrometri massa tunggal (kondisi fragmentasi rendah yang dihasilkan oleh fragmentasi dalam sumber), pemindaian dari m/z 50 hingga 1500 pada frekuensi pengulangan 5 Hz. Gunakan nitrogen sebagai gas tumbukan untuk analisis MS/MS, dan lakukan pengukuran independen pada empat tegangan disosiasi terinduksi tumbukan yang berbeda berikut: 20, 30, 40, dan 50 eV. Sepanjang proses pengukuran, kuadrupol memiliki jendela isolasi massa terbesar, dari m/z 50 hingga 1500. Ketika m/z badan depan dan lebar isolasi eksperimen diatur ke 200, rentang massa secara otomatis diaktifkan oleh perangkat lunak pengoperasian instrumen dan 0 Da. Pindai fragmen massa seperti pada mode massa tunggal. Gunakan natrium format (50 ml isopropanol, 200 μl asam format dan 1 ml larutan akuatik NaOH 1M) untuk kalibrasi massa. Menggunakan algoritma kalibrasi presisi tinggi Bruker, berkas data dikalibrasi setelah menjalankan spektrum rata-rata dalam periode waktu tertentu. Gunakan fungsi ekspor perangkat lunak Analisis Data v4.0 (Brook Dalton, Bremen, Jerman) untuk mengkonversi berkas data mentah ke format NetCDF. Kumpulan data MS/MS telah disimpan dalam basis data metabolomik terbuka MetaboLights (www.ebi.ac.uk) dengan nomor akses MTBLS1471.
Perakitan MS/MS dapat diwujudkan melalui analisis korelasi antara sinyal MS1 dan sinyal kualitas MS/MS untuk energi tumbukan rendah dan tinggi serta aturan yang baru diimplementasikan. Skrip R digunakan untuk mewujudkan analisis korelasi distribusi prekursor terhadap produk, dan skrip C# (https://github.com/MPI-DL/indiscriminant-MS-MS-assembly-pipeline) digunakan untuk mengimplementasikan aturan tersebut.
Untuk mengurangi kesalahan positif palsu yang disebabkan oleh noise latar belakang dan korelasi palsu yang disebabkan oleh deteksi fitur m/z tertentu hanya pada beberapa sampel, kami menggunakan fungsi "filled peak" dari paket R XCMS (untuk koreksi noise latar belakang) untuk mengganti intensitas "NA" (puncak yang tidak terdeteksi). Ketika fungsi fill peak digunakan, masih banyak nilai intensitas "0" dalam kumpulan data yang akan memengaruhi perhitungan korelasi. Kemudian, kami membandingkan hasil pemrosesan data yang diperoleh ketika fungsi filled peak digunakan dan ketika fungsi filled peak tidak digunakan, dan menghitung nilai noise latar belakang berdasarkan nilai estimasi rata-rata yang telah dikoreksi, lalu mengganti nilai intensitas 0 tersebut dengan nilai latar belakang yang telah dihitung. Kami juga hanya mempertimbangkan fitur yang intensitasnya melebihi tiga kali nilai latar belakang dan menganggapnya sebagai "puncak sebenarnya". Untuk perhitungan PCC, hanya sinyal m/z dari prekursor sampel (MS1) dan kumpulan data fragmen dengan setidaknya delapan puncak sebenarnya yang dipertimbangkan.
Jika intensitas fitur kualitas prekursor dalam keseluruhan sampel berkorelasi signifikan dengan penurunan intensitas fitur kualitas yang sama yang dikenai energi tumbukan rendah atau tinggi, dan fitur tersebut tidak diberi label sebagai puncak isotop oleh CAMERA, maka fitur tersebut dapat didefinisikan lebih lanjut. Kemudian, dengan menghitung semua kemungkinan pasangan prekursor-produk dalam waktu 3 detik (estimasi jendela waktu retensi untuk retensi puncak), analisis korelasi dilakukan. Hanya ketika nilai m/z lebih rendah dari nilai prekursor dan fragmentasi MS/MS terjadi di lokasi sampel yang sama dalam kumpulan data dengan prekursor asalnya, maka itu dianggap sebagai fragmen.
Berdasarkan dua aturan sederhana ini, kami mengecualikan fragmen yang ditentukan dengan nilai m/z lebih besar dari m/z prekursor yang teridentifikasi, dan berdasarkan posisi sampel tempat prekursor muncul dan fragmen yang ditentukan. Dimungkinkan juga untuk memilih fitur kualitas yang dihasilkan oleh banyak fragmen in-source yang dihasilkan dalam mode MS1 sebagai kandidat prekursor, sehingga menghasilkan senyawa MS/MS yang redundan. Untuk mengurangi redundansi data ini, jika kemiripan NDP spektrum melebihi 0,6, dan spektrum tersebut termasuk dalam kromatogram “pcgroup” yang dianotasi oleh CAMERA, kami akan menggabungkannya. Akhirnya, kami menggabungkan keempat hasil CE yang terkait dengan prekursor dan fragmen ke dalam spektrum komposit dekonvolusi akhir dengan memilih puncak intensitas tertinggi di antara semua puncak kandidat dengan nilai m/z yang sama pada energi tumbukan yang berbeda. Langkah-langkah pemrosesan selanjutnya didasarkan pada konsep spektrum komposit dan mempertimbangkan berbagai kondisi CE yang diperlukan untuk memaksimalkan probabilitas fragmentasi, karena beberapa fragmen hanya dapat dideteksi pada energi tumbukan tertentu.
RDPI (30) digunakan untuk menghitung induksi profil metabolik. Keragaman spektrum metabolik (indeks Hj) diperoleh dari kelimpahan prekursor MS/MS menggunakan entropi Shannon dari distribusi frekuensi MS/MS menggunakan persamaan berikut yang dijelaskan oleh Martínez et al. (8). Hj = −∑i = 1mPijlog2(Pij) di mana Pij sesuai dengan frekuensi relatif MS/MS ke-i dalam sampel ke-j (j = 1, 2,…, m) (i = 1, 2, …, m) t).
Spesifisitas metabolik (indeks Si) didefinisikan sebagai identitas ekspresi MS/MS tertentu dalam kaitannya dengan frekuensi antara sampel yang dipertimbangkan. Spesifisitas MS/MS dihitung sebagai Si = 1t (∑j = 1tPijPilog2PijPi)
Gunakan rumus berikut untuk mengukur indeks δj spesifik metabolom dari setiap sampel j, dan rata-rata spesifisitas MS/MS δj = ∑i = 1mPijSi
Spektrum MS/MS disejajarkan berpasangan, dan kemiripan dihitung berdasarkan dua skor. Pertama, menggunakan NDP standar (juga dikenal sebagai metode korelasi kosinus), gunakan persamaan berikut untuk memberi skor kemiripan segmen antara spektrum: NDP = (∑iS1 & S2WS1, iWS2, i) 2∑iWS1, i2∑iWS2, i2 di mana S1 dan S2. Sesuai dengan spektrum 1 dan spektrum 2, serta WS1, i dan WS2, i mewakili bobot berdasarkan intensitas puncak di mana perbedaan puncak umum ke-i antara kedua spektrum kurang dari 0,01 Da. Bobot dihitung sebagai berikut: W = [intensitas puncak] m [kualitas] n, m = 0,5, n = 2, seperti yang disarankan oleh MassBank.
Metode penilaian kedua diimplementasikan, yang melibatkan analisis NL bersama antara MS/MS. Untuk tujuan ini, kami menggunakan 52 daftar NL yang sering ditemui selama proses fragmentasi MS secara bersamaan, dan NL yang lebih spesifik (file data S1) yang sebelumnya telah dianotasi untuk spektrum MS/MS metabolit sekunder dari spesies Nepenthes yang melemah ( 9, 26 ). Buat vektor biner 1 dan 0 untuk setiap MS/MS, yang masing-masing sesuai dengan keberadaan dan tidak adanya beberapa NL. Berdasarkan kesamaan jarak Euclidean, skor kesamaan NL dihitung untuk setiap pasangan vektor biner NL.
Untuk melakukan pengelompokan ganda, kami menggunakan paket R DiffCoEx, yang didasarkan pada perluasan Analisis Ko-ekspresi Gen Berbobot (WGCNA). Dengan menggunakan matriks penilaian NDP dan NL dari spektrum MS/MS, kami menggunakan DiffCoEx untuk menghitung matriks korelasi komparatif. Pengelompokan biner dilakukan dengan mengatur parameter “cutreeDynamic” ke method = “hybrid”, cutHeight = 0.9999, deepSplit = T, dan minClusterSize = 10. Kode sumber R dari DiffCoEx diunduh dari file tambahan 1 oleh Tesson et al. (57); Paket perangkat lunak R WGCNA yang dibutuhkan dapat ditemukan di https://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA.
Untuk melakukan analisis jaringan molekuler MS/MS, kami menghitung konektivitas spektral berpasangan berdasarkan tipe kesamaan NDP dan NL, dan menggunakan perangkat lunak Cytoscape untuk memvisualisasikan topologi jaringan menggunakan tata letak organik dalam aplikasi ekstensi algoritma tata letak CyFilescape yFiles.
Gunakan R versi 3.0.1 untuk melakukan analisis statistik pada data. Signifikansi statistik dinilai menggunakan analisis varians dua arah (ANOVA), diikuti oleh uji post-hoc Tukey's honestly significant difference (HSD). Untuk menganalisis perbedaan antara perlakuan herbivora dan kontrol, distribusi dua arah dari kedua kelompok sampel dengan varians yang sama dianalisis menggunakan uji t Student.
Untuk materi tambahan artikel ini, silakan lihat http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/24/eaaz0381/DC1
Artikel ini merupakan artikel akses terbuka yang didistribusikan di bawah ketentuan Lisensi Creative Commons Attribution-Non-Commercial, yang mengizinkan penggunaan, distribusi, dan reproduksi dalam media apa pun, selama penggunaan akhir bukan untuk keuntungan komersial dan premisnya adalah bahwa karya asli tersebut benar. Referensi.
Catatan: Kami hanya meminta Anda untuk memberikan alamat email Anda agar orang yang Anda rekomendasikan ke halaman ini mengetahui bahwa Anda ingin mereka melihat email tersebut dan bahwa email tersebut bukan spam. Kami tidak akan menyimpan alamat email apa pun.
Pertanyaan ini digunakan untuk menguji apakah Anda adalah pengunjung dan mencegah pengiriman spam otomatis.
Teori informasi menyediakan tolok ukur universal untuk perbandingan metabolom khusus dan prediksi teori pertahanan pengujian.
Teori informasi menyediakan tolok ukur universal untuk perbandingan metabolom khusus dan prediksi teori pertahanan pengujian.
©2021 Asosiasi Amerika untuk Kemajuan Ilmu Pengetahuan. semua hak dilindungi undang-undang. AAAS adalah mitra dari HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef dan COUNTER. ScienceAdvanced ISSN 2375-2548.