Artikel ini merupakan bagian dari topik penelitian “Meningkatkan ketahanan tanaman polong terhadap patogen dan hama”, lihat semua 5 artikel
Agen penyebab penyakit nekrosis tanaman akibat jamur, Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, menggunakan strategi bertingkat untuk menginfeksi berbagai tanaman inang. Studi ini mengusulkan penggunaan diamina L-ornitin, asam amino non-protein yang merangsang sintesis asam amino esensial lainnya, sebagai strategi pengelolaan alternatif untuk meningkatkan respons molekuler, fisiologis, dan biokimia Phaseolus vulgaris L. terhadap penyakit jamur putih yang disebabkan oleh Pseudomonas sclerotiorum. Percobaan in vitro menunjukkan bahwa L-ornitin secara signifikan menghambat pertumbuhan miselium S. pyrenoidosa secara bergantung pada dosis. Selain itu, L-ornitin dapat secara signifikan mengurangi keparahan penyakit jamur putih dalam kondisi rumah kaca. Lebih lanjut, L-ornitin merangsang pertumbuhan tanaman yang diberi perlakuan, menunjukkan bahwa konsentrasi L-ornitin yang diuji tidak bersifat fitotoksik terhadap tanaman yang diberi perlakuan. Selain itu, L-ornitin meningkatkan ekspresi antioksidan non-enzimatik (total fenolik dan flavonoid larut) dan antioksidan enzimatik (katalase (CAT), peroksidase (POX), dan polifenol oksidase (PPO)), serta meningkatkan ekspresi tiga gen terkait antioksidan (PvCAT1, PvSOD, dan PvGR). Lebih lanjut, analisis in silico mengungkapkan keberadaan protein oksaloasetat asetilhidrolase (SsOAH) dalam genom S. sclerotiorum, yang sangat mirip dengan protein oksaloasetat asetilhidrolase (SsOAH) dari Aspergillus fijiensis (AfOAH) dan Penicillium sp. (PlOAH) dalam hal analisis fungsional, domain yang terkonservasi, dan topologi. Menariknya, penambahan L-ornitin ke media potato dextrose broth (PDB) secara signifikan menurunkan ekspresi gen SsOAH pada miselia S. sclerotiorum. Demikian pula, aplikasi eksogen L-ornitin secara signifikan menurunkan ekspresi gen SsOAH pada miselia jamur yang dikumpulkan dari tanaman yang diberi perlakuan. Terakhir, aplikasi L-ornitin secara signifikan menurunkan sekresi asam oksalat baik pada media PDB maupun daun yang terinfeksi. Kesimpulannya, L-ornitin memainkan peran kunci dalam menjaga status redoks serta meningkatkan respons pertahanan tanaman yang terinfeksi. Hasil penelitian ini dapat membantu dalam mengembangkan metode inovatif dan ramah lingkungan untuk mengendalikan penyakit jamur putih dan mengurangi dampaknya pada produksi kacang dan tanaman lainnya.
Jamur putih, yang disebabkan oleh jamur nekrotrofik Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, adalah penyakit yang merusak dan mengurangi hasil panen, serta menimbulkan ancaman serius bagi produksi kacang (Phaseolus vulgaris L.) global (Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum adalah salah satu patogen jamur tanaman yang paling sulit dikendalikan di dalam tanah, dengan kisaran inang yang luas lebih dari 600 spesies tanaman dan kemampuan untuk dengan cepat menghancurkan jaringan inang secara non-spesifik (Liang dan Rollins, 2018). Dalam kondisi yang tidak menguntungkan, ia mengalami fase kritis dalam siklus hidupnya, tetap dorman untuk waktu yang lama sebagai struktur hitam, keras, seperti biji yang disebut 'sklerotia' di dalam tanah atau sebagai pertumbuhan putih berbulu di miselium atau empulur batang tanaman yang terinfeksi (Schwartz et al., 2005). S. sclerotiorum mampu membentuk sklerotia, yang memungkinkannya bertahan hidup di lahan yang terinfeksi dalam jangka waktu lama dan tetap ada selama penyakit berlangsung (Schwartz et al., 2005). Sklerotia kaya akan nutrisi, dapat bertahan di tanah dalam jangka waktu lama, dan berfungsi sebagai inokulum utama untuk infeksi selanjutnya (Schwartz et al., 2005). Dalam kondisi yang menguntungkan, sklerotia berkecambah dan menghasilkan spora yang terbawa udara yang dapat menginfeksi semua bagian tanaman di atas tanah, termasuk tetapi tidak terbatas pada bunga, batang, atau polong (Schwartz et al., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum menggunakan strategi berlapis untuk menginfeksi tanaman inangnya, yang melibatkan serangkaian peristiwa terkoordinasi mulai dari perkecambahan sklerotia hingga perkembangan gejala. Awalnya, S. sclerotiorum menghasilkan spora tersuspensi (disebut askospora) dari struktur seperti jamur yang disebut apotesia, yang menjadi terbawa udara dan berkembang menjadi sklerotia yang tidak bergerak pada sisa-sisa tanaman yang terinfeksi (Bolton et al., 2006). Jamur kemudian mengeluarkan asam oksalat, faktor virulensi, untuk mengontrol pH dinding sel tanaman, mendorong degradasi enzimatik dan invasi jaringan (Hegedus dan Rimmer, 2005), dan menekan ledakan oksidatif tanaman inang. Proses pengasaman ini melemahkan dinding sel tanaman, menyediakan lingkungan yang menguntungkan bagi operasi normal dan efisien enzim pendegradasi dinding sel jamur (CWDE), memungkinkan patogen untuk mengatasi penghalang fisik dan menembus jaringan inang (Marciano et al., 1983). Setelah menembus jaringan, S. sclerotiorum mengeluarkan sejumlah enzim CWDE, seperti poligalakturonase dan selulase, yang memfasilitasi penyebarannya di jaringan yang terinfeksi dan menyebabkan nekrosis jaringan. Perkembangan lesi dan pembentukan hifa menyebabkan gejala khas penyakit jamur putih (Hegedus dan Rimmer, 2005). Sementara itu, tanaman inang mengenali pola molekuler terkait patogen (PAMP) melalui reseptor pengenalan pola (PRR), memicu serangkaian peristiwa pensinyalan yang pada akhirnya mengaktifkan respons pertahanan.
Meskipun upaya pengendalian penyakit telah dilakukan selama beberapa dekade, kekurangan plasma nutfah resisten yang memadai masih terjadi pada kacang-kacangan, seperti pada tanaman komersial lainnya, karena resistensi, kelangsungan hidup, dan kemampuan adaptasi patogen. Oleh karena itu, pengelolaan penyakit sangat menantang dan membutuhkan strategi terpadu dan multifaset yang mencakup kombinasi praktik budidaya, pengendalian hayati, dan fungisida kimia (O'Sullivan et al., 2021). Pengendalian kimiawi terhadap penyakit jamur putih adalah yang paling efektif karena fungisida, jika diaplikasikan dengan benar dan pada waktu yang tepat, dapat secara efektif mengendalikan penyebaran penyakit, mengurangi keparahan infeksi, dan meminimalkan kehilangan hasil panen. Namun, penggunaan berlebihan dan ketergantungan yang berlebihan pada fungisida dapat menyebabkan munculnya strain S. sclerotiorum yang resisten dan berdampak negatif pada organisme non-target, kesehatan tanah, dan kualitas air (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Oleh karena itu, menemukan alternatif yang ramah lingkungan telah menjadi prioritas utama.
Poliamin (PA), seperti putresin, spermidin, spermin, dan kadaverin, dapat berfungsi sebagai alternatif yang menjanjikan terhadap patogen tanaman yang ditularkan melalui tanah, sehingga mengurangi penggunaan fungisida kimia berbahaya secara keseluruhan atau sebagian (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). Pada tumbuhan tingkat tinggi, PA terlibat dalam banyak proses fisiologis termasuk, tetapi tidak terbatas pada, pembelahan sel, diferensiasi, dan respons terhadap stres abiotik dan biotik (Killiny dan Nehela, 2020). Poliamin dapat bertindak sebagai antioksidan, membantu membersihkan spesies oksigen reaktif (ROS), menjaga homeostasis redoks (Nehela dan Killiny, 2023), menginduksi gen terkait pertahanan (Romero dkk., 2018), mengatur berbagai jalur metabolisme (Nehela dan Killiny, 2023), memodulasi fitohormon endogen (Nehela dan Killiny, 2019), membangun resistensi yang diperoleh secara sistemik (SAR), dan mengatur interaksi tanaman-patogen (Nehela dan Killiny, 2020; Asija dkk., 2022; Czerwoniec, 2022). Perlu dicatat bahwa mekanisme dan peran spesifik poliamin dalam pertahanan tanaman bervariasi tergantung pada spesies tanaman, patogen, dan kondisi lingkungan. Poliamin yang paling melimpah pada tanaman disintesis dari poliamin esensial L-ornitin (Killiny dan Nehela, 2020).
L-ornitin memainkan berbagai peran dalam pertumbuhan dan perkembangan tanaman. Misalnya, penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa pada padi (Oryza sativa), ornitin mungkin terkait dengan daur ulang nitrogen (Liu et al., 2018), hasil, kualitas, dan aroma padi (Lu et al., 2020), serta respons terhadap stres air (Yang et al., 2000). Lebih lanjut, aplikasi eksogen L-ornitin secara signifikan meningkatkan toleransi kekeringan pada bit gula (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) dan mengurangi stres garam pada bawang bombai (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu dan Çavuşoǧlu, 2021) dan tanaman jambu mete (Anacardium occidentale) (da Rocha et al., 2012). Potensi peran L-ornitin dalam pertahanan terhadap stres abiotik mungkin disebabkan oleh keterlibatannya dalam akumulasi prolin pada tanaman yang diberi perlakuan. Sebagai contoh, gen yang terkait dengan metabolisme prolin, seperti gen ornitin delta aminotransferase (delta-OAT) dan prolin dehidrogenase (ProDH1 dan ProDH2), sebelumnya telah dilaporkan terlibat dalam pertahanan Nicotiana benthamiana dan Arabidopsis thaliana terhadap strain Pseudomonas syringae non-inang (Senthil-Kumar dan Mysore, 2012). Di sisi lain, ornitin dekarboksilase (ODC) jamur diperlukan untuk pertumbuhan patogen (Singh dkk., 2020). Penargetan ODC dari Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici melalui penekanan gen yang diinduksi inang (HIGS) secara signifikan meningkatkan ketahanan tanaman tomat terhadap layu Fusarium (Singh dkk., 2020). Namun, peran potensial aplikasi ornitin eksogen terhadap stres biotik seperti fitopatogen belum dipelajari dengan baik. Yang lebih penting lagi, efek ornitin terhadap ketahanan terhadap penyakit dan fenomena biokimia serta fisiologis terkait masih belum banyak dieksplorasi.
Memahami kompleksitas infeksi S. sclerotiorum pada tanaman polong-polongan sangat penting untuk pengembangan strategi pengendalian yang efektif. Dalam penelitian ini, kami bertujuan untuk mengidentifikasi peran potensial diamina L-ornitin sebagai faktor kunci dalam meningkatkan mekanisme pertahanan dan ketahanan tanaman polong-polongan terhadap infeksi Sclerotinia sclerotiorum. Kami berhipotesis bahwa, selain meningkatkan respons pertahanan tanaman yang terinfeksi, L-ornitin juga memainkan peran kunci dalam menjaga status redoks. Kami mengusulkan bahwa efek potensial L-ornitin berkaitan dengan pengaturan mekanisme pertahanan antioksidan enzimatik dan non-enzimatik serta interferensi dengan faktor patogenisitas/virulensi jamur dan protein terkait. Fungsi ganda L-ornitin ini menjadikannya kandidat yang menjanjikan untuk strategi berkelanjutan guna mengurangi dampak penyakit jamur putih dan meningkatkan ketahanan tanaman polong-polongan terhadap patogen jamur yang kuat ini. Hasil penelitian ini dapat membantu dalam pengembangan metode inovatif dan ramah lingkungan untuk mengendalikan penyakit jamur putih dan mengurangi dampaknya pada produksi tanaman polong-polongan.
Dalam penelitian ini, varietas kacang buncis komersial yang rentan, Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3), digunakan sebagai bahan percobaan. Benih sehat disediakan oleh Departemen Penelitian Legum, Lembaga Penelitian Tanaman Lapangan (FCRI), Pusat Penelitian Pertanian (ARC), Mesir. Lima benih ditanam dalam pot plastik (diameter dalam 35 cm, kedalaman 50 cm) yang diisi dengan tanah yang terinfeksi S. sclerotiorum di bawah kondisi rumah kaca (25 ± 2 °C, kelembaban relatif 75 ± 1%, 8 jam terang/16 jam gelap). Pada 7–10 hari setelah tanam (DPS), bibit ditipiskan hingga hanya menyisakan dua bibit dengan pertumbuhan seragam dan tiga daun yang telah berkembang penuh di setiap pot. Semua tanaman dalam pot disiram setiap dua minggu sekali dan diberi pupuk setiap bulan dengan dosis yang direkomendasikan untuk varietas tersebut.
Untuk menyiapkan larutan stok L-ornithinediamine (juga dikenal sebagai (+)-(S)-2,5-diaminopentanoic acid; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Jerman) dengan konsentrasi 500 mg/L, 50 mg dilarutkan terlebih dahulu dalam 100 mL air suling steril. Larutan stok kemudian diencerkan dan digunakan dalam percobaan selanjutnya. Singkatnya, enam seri konsentrasi L-ornithine (12,5, 25, 50, 75, 100, dan 125 mg/L) diuji secara in vitro. Selain itu, air suling steril digunakan sebagai kontrol negatif (Mock) dan fungisida komersial “Rizolex-T” 50% bubuk yang dapat larut dalam air (toclofos-methyl 20% + thiram 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Gharbia Governorate, Mesir) digunakan sebagai kontrol positif. Fungisida komersial “Rizolex-T” diuji secara in vitro pada lima konsentrasi (2, 4, 6, 8 dan 10 mg/L).
Sampel batang dan polong kacang buncis yang menunjukkan gejala khas penyakit jamur putih (tingkat infestasi: 10–30%) dikumpulkan dari pertanian komersial. Meskipun sebagian besar bahan tanaman yang terinfeksi diidentifikasi berdasarkan spesies/varietas (varietas komersial yang rentan adalah Giza 3), yang lain, terutama yang diperoleh dari pasar lokal, tidak diketahui spesiesnya. Bahan yang terinfeksi yang dikumpulkan pertama-tama didesinfeksi permukaannya dengan larutan natrium hipoklorit 0,5% selama 3 menit, kemudian dibilas beberapa kali dengan air suling steril dan dilap kering dengan kertas saring steril untuk menghilangkan kelebihan air. Organ yang terinfeksi kemudian dipotong kecil-kecil dari jaringan tengah (antara jaringan sehat dan terinfeksi), dikultur pada media agar kentang dekstrosa (PDA) dan diinkubasi pada suhu 25 ± 2 °C dengan siklus terang/gelap 12 jam selama 5 hari untuk merangsang pembentukan sklerotia. Metode ujung miselium juga digunakan untuk memurnikan isolat jamur dari kultur campuran atau terkontaminasi. Isolat jamur yang telah dimurnikan pertama kali diidentifikasi berdasarkan karakteristik morfologi kulturalnya dan kemudian dikonfirmasi sebagai S. sclerotiorum berdasarkan ciri-ciri mikroskopis. Terakhir, semua isolat yang telah dimurnikan diuji patogenisitasnya pada kultivar kacang buncis Giza 3 yang rentan untuk memenuhi postulat Koch.
Selain itu, isolat S. sclerotiorum yang paling invasif (isolat #3) dikonfirmasi lebih lanjut berdasarkan sekuensing internal transcribed spacer (ITS) seperti yang dijelaskan oleh White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017. Secara singkat, isolat dikultur dalam kaldu kentang dekstrosa (PDB) dan diinkubasi pada suhu 25 ± 2 °C selama 5–7 hari. Miselium jamur kemudian dikumpulkan, disaring melalui kain kasa, dicuci dua kali dengan air steril, dan dikeringkan dengan kertas saring steril. DNA genom diisolasi menggunakan Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep Kit (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). Wilayah ITS rDNA kemudian diamplifikasi menggunakan pasangan primer spesifik ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; ukuran yang diharapkan: 540 bp) (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). Produk PCR yang dimurnikan dikirim untuk sekuensing (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). Sekuens ITS rDNA diurutkan secara dua arah menggunakan metode sekuensing Sanger. Sekuens kueri yang dirakit kemudian dibandingkan dengan data terbaru di GenBank dan National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) menggunakan perangkat lunak BLASTn. Urutan kueri dibandingkan dengan 20 strain/isolat S. sclerotiorum lainnya yang diambil dari data terbaru di NCBI GenBank (Tabel Tambahan S1) menggunakan ClustalW dalam Paket Analisis Genetika Evolusi Molekuler (MEGA-11; versi 11) (Kumar dkk., 2024). Analisis evolusi dilakukan menggunakan metode kemungkinan maksimum dan model substitusi nukleotida waktu-reversibel umum (Nei dan Kumar, 2000). Pohon dengan log-likelihood tertinggi ditampilkan. Pohon awal untuk pencarian heuristik dipilih dengan memilih pohon dengan log-likelihood yang lebih tinggi antara pohon neighbor-joining (NJ) (Kumar dkk., 2024) dan pohon parsimoni maksimum (MP). Pohon NJ dibangun menggunakan matriks jarak berpasangan yang dihitung menggunakan model waktu-reversibel umum (Nei dan Kumar, 2000).
Aktivitas antibakteri L-ornitin dan bakterisida “Rizolex-T” ditentukan secara in vitro dengan metode difusi agar. Metode: Ambil sejumlah larutan stok L-ornitin (500 mg/L) yang sesuai dan campurkan secara menyeluruh dengan 10 ml media nutrisi PDA untuk menyiapkan larutan dengan konsentrasi akhir masing-masing 12,5, 25, 50, 75, 100 dan 125 mg/L. Lima konsentrasi fungisida “Rizolex-T” (2, 4, 6, 8 dan 10 mg/L) dan air suling steril digunakan sebagai kontrol. Setelah media mengeras, sumbat miselium kultur Sclerotinia sclerotiorum yang baru disiapkan, berdiameter 4 mm, dipindahkan ke tengah cawan Petri dan dikultur pada suhu 25±2°C hingga miselium menutupi seluruh cawan Petri kontrol, setelah itu pertumbuhan jamur dicatat. Hitung persentase penghambatan pertumbuhan radial S. sclerotiorum menggunakan persamaan 1:
Percobaan diulang dua kali, dengan enam replikasi biologis untuk setiap kelompok kontrol/eksperimen dan lima pot (dua tanaman per pot) untuk setiap replikasi biologis. Setiap replikasi biologis dianalisis dua kali (dua replikasi teknis) untuk memastikan keakuratan, keandalan, dan reproduksibilitas hasil percobaan. Selain itu, analisis regresi probit digunakan untuk menghitung konsentrasi penghambatan setengah maksimal (IC50) dan IC99 (Prentice, 1976).
Untuk mengevaluasi potensi L-ornitin dalam kondisi rumah kaca, dua percobaan pot berturut-turut dilakukan. Singkatnya, pot diisi dengan tanah lempung-pasir steril (3:1) dan diinokulasi dengan kultur S. sclerotiorum yang baru disiapkan. Pertama, isolat S. sclerotiorum yang paling invasif (isolat #3) dikultur dengan memotong satu sklerotium menjadi dua, meletakkannya menghadap ke bawah pada PDA dan diinkubasi pada suhu 25°C dalam kondisi gelap konstan (24 jam) selama 4 hari untuk merangsang pertumbuhan miselium. Empat sumbat agar berdiameter 5 mm kemudian diambil dari tepi depan dan diinokulasi dengan 100 g campuran steril dedak gandum dan beras (1:1, v/v) dan semua labu diinkubasi pada suhu 25 ± 2 °C di bawah siklus terang/gelap 12 jam selama 5 hari untuk merangsang pembentukan sklerotia. Isi semua labu dicampur secara menyeluruh untuk memastikan homogenitas sebelum menambahkan tanah. Kemudian, 100 g campuran dedak kolonisasi ditambahkan ke setiap pot untuk memastikan konsentrasi patogen yang konstan. Pot yang telah diinokulasi disiram untuk mengaktifkan pertumbuhan jamur dan ditempatkan di rumah kaca selama 7 hari.
Lima biji varietas Giza 3 kemudian disemai di setiap pot. Untuk pot yang diberi perlakuan L-ornitin dan fungisida Rizolex-T, biji yang telah disterilkan terlebih dahulu direndam selama dua jam dalam larutan air dari kedua senyawa tersebut dengan konsentrasi IC99 akhir masing-masing sekitar 250 mg/L dan 50 mg/L, kemudian dikeringkan di udara selama satu jam sebelum disemai. Di sisi lain, biji direndam dalam air suling steril sebagai kontrol negatif. Setelah 10 hari, sebelum penyiraman pertama, bibit ditipiskan, hanya menyisakan dua bibit yang rapi di setiap pot. Selain itu, untuk memastikan infeksi dengan S. sclerotiorum, batang tanaman kacang pada tahap perkembangan yang sama (10 hari) dipotong di dua lokasi berbeda menggunakan pisau bedah steril dan sekitar 0,5 g campuran dedak kolonisasi ditempatkan ke setiap luka, diikuti dengan kelembapan tinggi untuk merangsang infeksi dan perkembangan penyakit pada semua tanaman yang diinokulasi. Tanaman kontrol juga dilukai dengan cara yang sama dan sejumlah campuran dedak steril yang tidak terkontaminasi (0,5 g) ditempatkan ke dalam luka dan dijaga dalam kondisi kelembaban tinggi untuk mensimulasikan lingkungan bagi perkembangan penyakit dan memastikan konsistensi antar kelompok perlakuan.
Metode perlakuan: Bibit kacang disiram dengan 500 ml larutan air L-ornitin (250 mg/l) atau fungisida Rizolex-T (50 mg/l) dengan cara mengairi tanah, kemudian perlakuan diulang tiga kali dengan interval 10 hari. Kontrol yang diberi plasebo disiram dengan 500 ml air suling steril. Semua perlakuan dilakukan di bawah kondisi rumah kaca (25 ± 2°C, kelembaban relatif 75 ± 1%, dan fotoperiode 8 jam terang/16 jam gelap). Semua pot disiram setiap dua minggu sekali dan diberi pupuk NPK seimbang (20-20-20, dengan 3,6% sulfur dan unsur mikro TE; Zain Seeds, Mesir) setiap bulan dengan konsentrasi 3–4 g/l melalui penyemprotan daun sesuai dengan rekomendasi untuk varietas tertentu dan petunjuk produsen. Kecuali dinyatakan lain, daun dewasa yang telah berkembang penuh (daun ke-2 dan ke-3 dari atas) dikumpulkan dari setiap replikasi biologis pada 72 jam pasca-perlakuan (hpt), dihomogenkan, dikumpulkan, dan disimpan pada suhu -80 °C untuk analisis lebih lanjut termasuk, tetapi tidak terbatas pada, lokalisasi histokimia in situ dari indikator stres oksidatif, peroksidasi lipid, antioksidan enzimatik dan non-enzimatik, serta ekspresi gen.
Intensitas infeksi jamur putih dinilai setiap minggu 21 hari pasca inokulasi (dpi) menggunakan skala 1–9 (Tabel Tambahan S2) berdasarkan skala Petzoldt dan Dickson (1996) yang dimodifikasi oleh Teran dkk. (2006). Singkatnya, batang dan cabang tanaman kacang diperiksa mulai dari titik inokulasi untuk mengikuti perkembangan lesi di sepanjang ruas dan buku. Jarak lesi dari titik inokulasi ke titik terjauh di sepanjang batang atau cabang kemudian diukur dan skor 1–9 diberikan berdasarkan lokasi lesi, di mana (1) menunjukkan tidak ada infeksi yang terlihat di dekat titik inokulasi dan (2–9) menunjukkan peningkatan bertahap dalam ukuran lesi dan perkembangannya di sepanjang buku/ruas (Tabel Tambahan S2). Intensitas infeksi jamur putih kemudian dikonversi menjadi persentase menggunakan rumus 2:
Selain itu, luas di bawah kurva perkembangan penyakit (AUDPC) dihitung menggunakan rumus (Shaner dan Finney, 1977), yang baru-baru ini diadaptasi untuk penyakit busuk putih pada kacang buncis (Chauhan dkk., 2020) menggunakan persamaan 3:
Di mana Yi = tingkat keparahan penyakit pada waktu ti, Yi+1 = tingkat keparahan penyakit pada waktu ti+1 berikutnya, ti = waktu pengukuran pertama (dalam hari), ti+1 = waktu pengukuran berikutnya (dalam hari), n = jumlah total titik waktu atau titik pengamatan. Parameter pertumbuhan tanaman kacang termasuk tinggi tanaman (cm), jumlah cabang per tanaman, dan jumlah daun per tanaman dicatat setiap minggu selama 21 hari di semua replikasi biologis.
Pada setiap replikasi biologis, sampel daun (daun kedua dan ketiga yang telah berkembang penuh dari atas) dikumpulkan pada hari ke-45 setelah perlakuan (15 hari setelah perlakuan terakhir). Setiap replikasi biologis terdiri dari lima pot (dua tanaman per pot). Sekitar 500 mg jaringan yang dihancurkan digunakan untuk ekstraksi pigmen fotosintetik (klorofil a, klorofil b, dan karotenoid) menggunakan aseton 80% pada suhu 4 °C dalam kondisi gelap. Setelah 24 jam, sampel disentrifugasi dan supernatan dikumpulkan untuk penentuan kandungan klorofil a, klorofil b, dan karotenoid secara kolorimetri menggunakan spektrofotometer UV-160A (Shimadzu Corporation, Jepang) sesuai dengan metode (Lichtenthaler, 1987) dengan mengukur absorbansi pada tiga panjang gelombang yang berbeda (A470, A646, dan A663 nm). Terakhir, kandungan pigmen fotosintetik dihitung menggunakan rumus 4–6 yang dijelaskan oleh Lichtenthaler (1987).
Pada 72 jam pasca-perlakuan (hpt), daun (daun kedua dan ketiga yang telah berkembang penuh dari atas) dikumpulkan dari setiap replikasi biologis untuk lokalisasi histokimia in situ hidrogen peroksida (H2O2) dan anion superoksida (O2•−). Setiap replikasi biologis terdiri dari lima pot (dua tanaman per pot). Setiap replikasi biologis dianalisis secara duplikat (dua replikasi teknis) untuk memastikan keakuratan, keandalan, dan reproduksibilitas metode. H2O2 dan O2•− ditentukan menggunakan 0,1% 3,3′-diaminobenzidine (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Jerman) atau nitroblue tetrazolium (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Jerman), masing-masing, mengikuti metode yang dijelaskan oleh Romero-Puertas et al. (2004) dan Adam et al. (1989) dengan sedikit modifikasi. Untuk lokalisasi histokimia H2O2 in situ, daun katup diinfiltrasi vakum dengan 0,1% DAB dalam buffer Tris 10 mM (pH 7,8) dan kemudian diinkubasi pada suhu kamar di bawah cahaya selama 60 menit. Daun katup diputihkan dalam 0,15% (v/v) TCA dalam etanol:kloroform 4:1 (v/v) (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kairo, Mesir) dan kemudian dipaparkan pada cahaya hingga menjadi gelap. Demikian pula, katup diinfiltrasi vakum dengan buffer kalium fosfat 10 mM (pH 7,8) yang mengandung 0,1% (v/v) HBT untuk lokalisasi histokimia O2•− in situ. Daun katup diinkubasi di bawah cahaya pada suhu kamar selama 20 menit, kemudian diputihkan seperti di atas, dan kemudian disinari hingga muncul bintik-bintik biru tua/ungu. Intensitas warna cokelat (sebagai indikator H2O2) atau biru-ungu (sebagai indikator O2•−) yang dihasilkan dinilai menggunakan versi Fiji dari paket pemrosesan gambar ImageJ (http://fiji.sc; diakses 7 Maret 2024).
Malondialdehida (MDA; sebagai penanda peroksidasi lipid) ditentukan menurut metode Du dan Bramlage (1992) dengan sedikit modifikasi. Daun dari setiap replikasi biologis (daun kedua dan ketiga yang berkembang penuh dari atas) dikumpulkan 72 jam setelah perlakuan (hpt). Setiap replikasi biologis mencakup lima pot (dua tanaman per pot). Setiap replikasi biologis dianalisis secara duplikat (dua replikasi teknis) untuk memastikan keakuratan, keandalan, dan reproduksibilitas metode. Secara singkat, 0,5 g jaringan daun yang digiling digunakan untuk ekstraksi MDA dengan asam trikloroasetat (TCA) 20% (MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) yang mengandung 0,01% butil hidroksitoluena (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Kandungan MDA dalam supernatan kemudian ditentukan secara kolorimetri dengan mengukur absorbansi pada 532 dan 600 nm menggunakan spektrofotometer UV-160A (Shimadzu Corporation, Jepang) dan kemudian dinyatakan sebagai nmol g−1 FW.
Untuk penilaian antioksidan non-enzimatik dan enzimatik, daun (daun kedua dan ketiga yang telah berkembang penuh dari atas) dikumpulkan dari setiap replikasi biologis pada 72 jam pasca-perlakuan (hpt). Setiap replikasi biologis terdiri dari lima pot (dua tanaman per pot). Setiap sampel biologis dianalisis secara duplikat (dua sampel teknis). Dua daun digiling dengan nitrogen cair dan digunakan langsung untuk penentuan antioksidan enzimatik dan non-enzimatik, total asam amino, kandungan prolin, ekspresi gen, dan kuantifikasi oksalat.
Total fenolik terlarut ditentukan menggunakan reagen Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) dengan sedikit modifikasi metode yang dijelaskan oleh Kahkonen dkk. (1999). Secara singkat, sekitar 0,1 g jaringan daun yang dihomogenkan diekstraksi dengan 20 ml metanol 80% dalam kondisi gelap selama 24 jam dan supernatan dikumpulkan setelah sentrifugasi. 0,1 ml ekstrak sampel dicampur dengan 0,5 ml reagen Folin-Ciocalteu (10%), dikocok selama 30 detik dan dibiarkan dalam kondisi gelap selama 5 menit. Kemudian 0,5 ml larutan natrium karbonat 20% (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Kairo, Mesir) ditambahkan ke setiap tabung, dicampur secara menyeluruh dan diinkubasi pada suhu kamar dalam kondisi gelap selama 1 jam. Setelah inkubasi, absorbansi campuran reaksi diukur pada 765 nm menggunakan spektrofotometer UV-160A (Shimadzu Corporation, Jepang). Konsentrasi total fenol terlarut dalam ekstrak sampel ditentukan menggunakan kurva kalibrasi asam galat (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) dan dinyatakan sebagai miligram setara asam galat per gram berat segar (mg GAE g-1 berat segar).
Kandungan flavonoid terlarut total ditentukan menurut metode Djeridane dkk. (2006) dengan sedikit modifikasi. Secara singkat, 0,3 ml ekstrak metanol di atas dicampur dengan 0,3 ml larutan aluminium klorida 5% (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, USA), diaduk kuat, kemudian diinkubasi pada suhu kamar selama 5 menit, diikuti dengan penambahan 0,3 ml larutan kalium asetat 10% (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kairo, Mesir), dicampur secara menyeluruh dan diinkubasi pada suhu kamar selama 30 menit dalam gelap. Setelah inkubasi, absorbansi campuran reaksi diukur pada 430 nm menggunakan spektrofotometer UV-160A (Shimadzu Corporation, Jepang). Konsentrasi total flavonoid terlarut dalam ekstrak sampel ditentukan menggunakan kurva kalibrasi rutin (TCI America, Portland, OR, USA) dan kemudian dinyatakan sebagai miligram setara rutin per gram berat segar (mg RE g-1 berat segar).
Kandungan total asam amino bebas pada daun kacang ditentukan menggunakan reagen ninhidrin yang dimodifikasi (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) berdasarkan metode yang diusulkan oleh Yokoyama dan Hiramatsu (2003) dan dimodifikasi oleh Sun dkk. (2006). Secara singkat, 0,1 g jaringan yang digiling diekstraksi dengan buffer pH 5,4, dan 200 μL supernatan direaksikan dengan 200 μL ninhidrin (2%) dan 200 μL piridin (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, USA), diinkubasi dalam penangas air mendidih selama 30 menit, kemudian didinginkan dan diukur pada 580 nm menggunakan spektrofotometer UV-160A (Shimadzu Corporation, Jepang). Di sisi lain, prolin ditentukan dengan metode Bates (Bates dkk., 1973). Prolin diekstraksi dengan asam sulfosalicylic 3% (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) dan setelah sentrifugasi, 0,5 ml supernatan dicampur dengan 1 ml asam asetat glasial (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) dan reagen ninhidrin, diinkubasi pada suhu 90°C selama 45 menit, didinginkan, dan diukur pada 520 nm menggunakan spektrofotometer yang sama seperti di atas. Total asam amino bebas dan prolin dalam ekstrak daun ditentukan menggunakan kurva kalibrasi glisin dan prolin (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), masing-masing, dan dinyatakan dalam mg/g berat segar.
Untuk menentukan aktivitas enzimatik enzim antioksidan, sekitar 500 mg jaringan yang dihomogenkan diekstraksi dengan 3 ml buffer Tris 50 mM (pH 7,8) yang mengandung 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) dan 7,5% polivinilpirolidon (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), disentrifugasi pada 10.000 × g selama 20 menit dalam kondisi dingin (4 °C), dan supernatan (ekstrak enzim kasar) dikumpulkan (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Katalase (CAT) kemudian direaksikan dengan 2 ml larutan buffer natrium fosfat 0,1 M (pH 6,5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) dan 100 μl larutan H2O2 269 mM untuk menentukan aktivitas enzimatiknya menurut metode Aebi (1984) dengan sedikit modifikasi (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Aktivitas enzim peroksidase yang bergantung pada guaiakol (POX) ditentukan menggunakan metode Harrach et al. (2009). (2008) dengan sedikit modifikasi (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) dan aktivitas enzimatik polifenol oksidase (PPO) ditentukan setelah reaksi dengan 2,2 ml larutan penyangga natrium fosfat 100 mM (pH 6,0), 100 μl guaiakol (TCI chemicals, Portland, OR, USA) dan 100 μl H2O2 12 mM. Metode ini sedikit dimodifikasi dari (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Pengujian dilakukan setelah reaksi dengan 3 ml larutan katekol (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) (0,01 M) yang baru disiapkan dalam larutan penyangga fosfat 0,1 M (pH 6,0). Aktivitas CAT diukur dengan memantau dekomposisi H2O2 pada 240 nm (A240), aktivitas POX diukur dengan memantau peningkatan absorbansi pada 436 nm (A436), dan aktivitas PPO diukur dengan merekam fluktuasi absorbansi pada 495 nm (A495) setiap 30 detik selama 3 menit menggunakan spektrofotometer UV-160A (Shimadzu, Jepang).
RT-PCR waktu nyata digunakan untuk mendeteksi tingkat transkrip dari tiga gen terkait antioksidan, termasuk katalase peroksisomal (PvCAT1; Nomor Aksesi GenBank KF033307.1), superoksida dismutase (PvSOD; Nomor Aksesi GenBank XM_068639556.1), dan reduktase glutation (PvGR; Nomor Aksesi GenBank KY195009.1), pada daun kacang (daun kedua dan ketiga yang telah berkembang penuh dari atas) 72 jam setelah perlakuan terakhir. Secara singkat, RNA diisolasi menggunakan Simply P Total RNA Extraction Kit (No. Katalog BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, China) sesuai dengan protokol pabrikan. Kemudian, cDNA disintesis menggunakan TOP script™ cDNA Synthesis Kit sesuai dengan instruksi pabrikan. Urutan primer dari ketiga gen di atas tercantum dalam Tabel Tambahan S3. PvActin-3 (nomor akses GenBank: XM_068616709.1) digunakan sebagai gen pengontrol dan ekspresi gen relatif dihitung menggunakan metode 2-ΔΔCT (Livak dan Schmittgen, 2001). Stabilitas aktin di bawah tekanan biotik (interaksi tidak kompatibel antara legum umum dan jamur antraknosa Colletotrichum lindemuthianum) dan tekanan abiotik (kekeringan, salinitas, suhu rendah) telah ditunjukkan (Borges dkk., 2012).
Awalnya, kami melakukan analisis in silico genomik terhadap protein oksaloasetat asetilhidrolase (OAH) pada S. sclerotiorum menggunakan alat protein-protein BLAST (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005). Singkatnya, kami menggunakan OAH dari Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taxide: 1191702; nomor akses GenBank XP_040799428.1; 342 asam amino) dan Penicillium lagena (PlOAH; taxide: 94218; nomor akses GenBank XP_056833920.1; 316 asam amino) sebagai sekuens kueri untuk memetakan protein homolog pada S. sclerotiorum (taxide: 5180). BLASTp dilakukan terhadap data genom S. sclerotiorum terbaru yang tersedia di GenBank pada situs web National Center for Biotechnology Information (NCBI), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
Selain itu, gen OAH yang diprediksi dari S. sclerotiorum (SsOAH) dan analisis evolusi serta pohon filogenetik AfOAH dari A. fijiensis CBS 313.89 dan PlOAH dari P. lagena disimpulkan menggunakan metode kemungkinan maksimum dalam MEGA11 (Tamura dkk., 2021) dan model berbasis matriks JTT (Jones dkk., 1992). Pohon filogenetik tersebut dikombinasikan dengan analisis penyelarasan berganda dari sekuens protein semua gen OAH yang diprediksi (SsOAH) dari S. sclerotiorum dan sekuens kueri menggunakan Constraint-Based Alignment Tool (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos dan Agarwala, 2007). Selain itu, urutan asam amino SsOAH yang paling cocok dari S. sclerotiorum diselaraskan dengan urutan kueri (AfOAH dan PlOAH) (Larkin et al., 2007) menggunakan ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), dan daerah yang terlestarikan dalam penyelarasan divisualisasikan menggunakan alat ESPript (versi 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
Selanjutnya, domain representatif fungsional yang diprediksi dan situs konservasi S. sclerotiorum SsOAH diklasifikasikan secara interaktif ke dalam famili yang berbeda menggunakan alat InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). Terakhir, pemodelan struktur tiga dimensi (3D) dari S. sclerotiorum SsOAH yang diprediksi dilakukan menggunakan Protein Homology/Analogy Recognition Engine (server Phyre2 versi 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) dan divalidasi menggunakan server SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). Struktur tiga dimensi yang diprediksi (format PDB) divisualisasikan secara interaktif menggunakan paket UCSF-Chimera (versi 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ ) (Pettersen et al., 2004).
PCR fluoresensi real-time kuantitatif digunakan untuk menentukan tingkat transkripsi oksaloasetat asetilhidrolase (SsOAH; nomor akses GenBank: XM_001590428.1) dalam miselia Sclerotinia sclerotiorum. Secara singkat, S. sclerotiorum diinokulasi ke dalam labu yang berisi PDB dan ditempatkan dalam inkubator pengocok (model: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) pada suhu 25 ± 2 °C selama 24 jam dengan kecepatan 150 rpm dan dalam kondisi gelap konstan (24 jam) untuk merangsang pertumbuhan miselia. Setelah itu, sel-sel tersebut diberi perlakuan dengan L-ornitin dan fungisida Rizolex-T pada konsentrasi IC50 akhir (masing-masing sekitar 40 dan 3,2 mg/L) dan kemudian dikultur selama 24 jam lagi dalam kondisi yang sama. Setelah inkubasi, kultur disentrifugasi pada 2500 rpm selama 5 menit dan supernatan (miselium jamur) dikumpulkan untuk analisis ekspresi gen. Demikian pula, miselium jamur dikumpulkan pada 0, 24, 48, 72, 96, dan 120 jam pasca-infeksi dari tanaman yang terinfeksi yang telah membentuk jamur putih dan miselium seperti kapas pada permukaan jaringan yang terinfeksi. RNA diekstrak dari miselium jamur dan kemudian cDNA disintesis seperti yang dijelaskan di atas. Urutan primer untuk SsOAH tercantum dalam Tabel Tambahan S3. SsActin (nomor akses GenBank: XM_001589919.1) digunakan sebagai gen pengontrol, dan ekspresi gen relatif dihitung menggunakan metode 2-ΔΔCT (Livak dan Schmittgen, 2001).
Asam oksalat ditentukan dalam kaldu kentang dekstrosa (PDB) dan sampel tanaman yang mengandung patogen jamur Sclerotinia sclerotiorum menurut metode Xu dan Zhang (2000) dengan sedikit modifikasi. Secara singkat, isolat S. sclerotiorum diinokulasi ke dalam labu yang berisi PDB dan kemudian dikultur dalam inkubator pengocok (model I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) pada 150 rpm pada suhu 25 ± 2 °C selama 3–5 hari dalam kondisi gelap konstan (24 jam) untuk merangsang pertumbuhan miselium. Setelah inkubasi, kultur jamur pertama-tama disaring melalui kertas saring Whatman #1 dan kemudian disentrifugasi pada 2500 rpm selama 5 menit untuk menghilangkan miselium residual. Supernatan dikumpulkan dan disimpan pada suhu 4°C untuk penentuan kuantitatif oksalat lebih lanjut. Untuk persiapan sampel tanaman, sekitar 0,1 g fragmen jaringan tanaman diekstraksi tiga kali dengan air suling (2 ml setiap kali). Sampel kemudian disentrifugasi pada 2500 rpm selama 5 menit, supernatan disaring kering melalui kertas saring Whatman No. 1 dan dikumpulkan untuk analisis lebih lanjut.
Untuk analisis kuantitatif asam oksalat, campuran reaksi disiapkan dalam tabung kaca bertutup dengan urutan sebagai berikut: 0,2 ml sampel (atau filtrat kultur PDB atau larutan standar asam oksalat), 0,11 ml bromofenol biru (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, USA), 0,198 ml asam sulfat 1 M (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kairo, Mesir) dan 0,176 ml kalium dikromat 100 mM (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, USA), kemudian larutan diencerkan hingga 4,8 ml dengan air suling, dicampur secara kuat dan segera ditempatkan dalam penangas air 60 °C. Setelah 10 menit, reaksi dihentikan dengan menambahkan 0,5 ml larutan natrium hidroksida (NaOH; 0,75 M). Absorbansi (A600) campuran reaksi diukur pada 600 nm menggunakan spektrofotometer UV-160 (Shimadzu Corporation, Jepang). PDB dan air suling digunakan sebagai kontrol untuk kuantifikasi filtrat kultur dan sampel tanaman, masing-masing. Konsentrasi asam oksalat dalam filtrat kultur, dinyatakan sebagai mikrogram asam oksalat per mililiter media PDB (μg.mL−1), dan dalam ekstrak daun, dinyatakan sebagai mikrogram asam oksalat per gram berat segar (μg.g−1 FW), ditentukan menggunakan kurva kalibrasi asam oksalat (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA).
Sepanjang penelitian, semua percobaan dirancang dalam rancangan acak lengkap (CRD) dengan enam replikasi biologis per perlakuan dan lima pot per replikasi biologis (dua tanaman per pot) kecuali dinyatakan lain. Replikasi biologis dianalisis secara duplikat (dua replikasi teknis). Replikasi teknis digunakan untuk memeriksa reproduktivitas percobaan yang sama tetapi tidak digunakan dalam analisis statistik untuk menghindari replikasi palsu. Data dianalisis secara statistik menggunakan analisis varians (ANOVA) diikuti dengan uji perbedaan signifikan jujur ​​Tukey-Kramer (HSD) (p ≤ 0,05). Untuk percobaan in vitro, nilai IC50 dan IC99 dihitung menggunakan model probit dan interval kepercayaan 95% dihitung.
Sebanyak empat isolat dikumpulkan dari lahan kedelai yang berbeda di Provinsi El Ghabiya, Mesir. Pada media PDA, semua isolat menghasilkan miselium berwarna putih krem ​​yang dengan cepat berubah menjadi putih seperti kapas (Gambar 1A) dan kemudian krem ​​atau cokelat pada tahap sklerotium. Sklerotia biasanya padat, hitam, berbentuk bulat atau tidak beraturan, panjang 5,2 hingga 7,7 mm dan diameter 3,4 hingga 5,3 mm (Gambar 1B). Meskipun empat isolat mengembangkan pola sklerotia marginal di tepi media kultur setelah 10–12 hari inkubasi pada suhu 25 ± 2 °C (Gambar 1A), jumlah sklerotia per cawan berbeda secara signifikan di antara mereka (P < 0,001), dengan isolat 3 memiliki jumlah sklerotia tertinggi (32,33 ± 1,53 sklerotia per cawan; Gambar 1C). Demikian pula, isolat #3 menghasilkan lebih banyak asam oksalat dalam PDB daripada isolat lainnya (3,33 ± 0,49 μg.mL−1; Gambar 1D). Isolat #3 menunjukkan karakteristik morfologi dan mikroskopis yang khas dari jamur fitopatogenik Sclerotinia sclerotiorum. Misalnya, pada PDA, koloni isolat #3 tumbuh dengan cepat, berwarna putih krem ​​(Gambar 1A), bagian belakang berwarna krem ​​atau kuning kecoklatan muda seperti salmon, dan membutuhkan waktu 6-7 hari pada suhu 25 ± 2°C untuk sepenuhnya menutupi permukaan cawan petri berdiameter 9 cm. Berdasarkan karakteristik morfologi dan mikroskopis di atas, isolat #3 diidentifikasi sebagai Sclerotinia sclerotiorum.
Gambar 1. Karakteristik dan patogenisitas isolat S. sclerotiorum dari tanaman legum umum. (A) Pertumbuhan miselium dari empat isolat S. sclerotiorum pada media PDA, (B) sklerotia dari empat isolat S. sclerotiorum, (C) jumlah sklerotia (per cawan petri), (D) sekresi asam oksalat pada media PDB (μg.mL−1), dan (E) tingkat keparahan penyakit (%) dari empat isolat S. sclerotiorum pada kultivar legum komersial rentan Giza 3 di bawah kondisi rumah kaca. Nilai mewakili rata-rata ± SD dari lima replikasi biologis (n = 5). Huruf yang berbeda menunjukkan perbedaan yang signifikan secara statistik antar perlakuan (p < 0,05). (F–H) Gejala jamur putih khas muncul pada batang di atas tanah dan polong, masing-masing, 10 hari setelah inokulasi dengan isolat #3 (dpi). (I) Analisis evolusi wilayah internal transcribed spacer (ITS) isolat S. sclerotiorum #3 dilakukan menggunakan metode maximum likelihood dan dibandingkan dengan 20 isolat/strain referensi yang diperoleh dari database National Center for Biotechnology Information (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Angka di atas garis pengelompokan menunjukkan cakupan wilayah (%), dan angka di bawah garis pengelompokan menunjukkan panjang cabang.
Selanjutnya, untuk mengkonfirmasi patogenisitasnya, empat isolat S. sclerotiorum yang diperoleh digunakan untuk menginokulasi kultivar kacang komersial Giza 3 yang rentan di bawah kondisi rumah kaca, yang konsisten dengan postulat Koch (Gambar 1E). Meskipun semua isolat jamur yang diperoleh bersifat patogen dan dapat menginfeksi kacang hijau (kultivar Giza 3), menyebabkan gejala penyakit jamur putih yang khas pada semua bagian di atas tanah (Gambar 1F), terutama pada batang (Gambar 1G) dan polong (Gambar 1H) pada 10 hari pasca inokulasi (dpi), isolat 3 adalah isolat yang paling agresif dalam dua percobaan independen. Isolat 3 memiliki tingkat keparahan penyakit tertinggi (%) pada tanaman kacang (24,0 ± 4,0, 58,0 ± 2,0, dan 76,7 ± 3,1 pada 7, 14, dan 21 hari pasca infeksi, masing-masing; Gambar 1F).
Identifikasi isolat S. sclerotiorum #3 yang paling invasif dikonfirmasi lebih lanjut berdasarkan sekuensing internal transcribed spacer (ITS) (Gambar 1I). Analisis filogenetik antara isolat #3 dan 20 isolat/strain referensi menunjukkan kemiripan yang tinggi (>99%) di antara keduanya. Perlu dicatat bahwa isolat S. sclerotiorum #3 (533 bp) memiliki kemiripan yang tinggi dengan isolat S. sclerotiorum Amerika LPM36 yang diisolasi dari biji kacang polong kering (nomor akses GenBank MK896659.1; 540 bp) dan isolat S. sclerotiorum Cina YKY211 (nomor akses GenBank OR206374.1; 548 bp), yang menyebabkan penyakit busuk batang violet (Matthiola incana), yang semuanya dikelompokkan secara terpisah di bagian atas dendrogram (Gambar 1I). Urutan gen baru tersebut telah dimasukkan ke dalam basis data NCBI dan diberi nama “Sclerotinia sclerotiorum – isolat YN-25” (nomor akses GenBank PV202792). Dapat dilihat bahwa isolat 3 merupakan isolat yang paling invasif; oleh karena itu, isolat ini dipilih untuk dipelajari dalam semua percobaan selanjutnya.
Aktivitas antibakteri diamina L-ornitin (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Jerman) pada berbagai konsentrasi (12,5, 25, 50, 75, 100 dan 125 mg/L) terhadap isolat S. sclerotiorum 3 diselidiki secara in vitro. Perlu dicatat bahwa L-ornitin menunjukkan efek antibakteri dan secara bertahap menghambat pertumbuhan radial hifa S. sclerotiorum secara bergantung pada dosis (Gambar 2A, B). Pada konsentrasi tertinggi yang diuji (125 mg/L), L-ornitin menunjukkan tingkat penghambatan pertumbuhan miselium tertinggi (99,62 ± 0,27%; Gambar 2B), yang setara dengan fungisida komersial Rizolex-T (tingkat penghambatan 99,45 ± 0,39%; Gambar 2C) pada konsentrasi tertinggi yang diuji (10 mg/L), menunjukkan kemanjuran yang serupa.
Gambar 2. Aktivitas antibakteri in vitro L-ornitin terhadap Sclerotinia sclerotiorum. (A) Perbandingan aktivitas antibakteri berbagai konsentrasi L-ornitin terhadap S. sclerotiorum dengan fungisida komersial Rizolex-T (10 mg/L). (B, C) Tingkat penghambatan (%) pertumbuhan miselium S. sclerotiorum setelah perlakuan dengan berbagai konsentrasi L-ornitin (12,5, 25, 50, 75, 100 dan 125 mg/L) atau Rizolex-T (2, 4, 6, 8 dan 10 mg/L), masing-masing. Nilai mewakili rata-rata ± SD dari lima replikasi biologis (n = 5). Huruf yang berbeda menunjukkan perbedaan statistik antar perlakuan (p < 0,05). (D, E) Analisis regresi model probit L-ornitin dan fungisida komersial Rizolex-T, masing-masing. Garis regresi model probit ditunjukkan sebagai garis biru solid, dan interval kepercayaan (95%) ditunjukkan sebagai garis merah putus-putus.
Selain itu, analisis regresi probit dilakukan dan plot yang sesuai ditunjukkan pada Tabel 1 dan Gambar 2D,E. Singkatnya, nilai kemiringan yang dapat diterima (y = 2,92x − 4,67) dan statistik signifikan terkait (Cox & Snell R2 = 0,3709, Nagelkerke R2 = 0,4998 dan p < 0,0001; Gambar 2D) dari L-ornitin menunjukkan peningkatan aktivitas antijamur terhadap S. sclerotiorum dibandingkan dengan fungisida komersial Rizolex-T (y = 1,96x − 0,99, Cox & Snell R2 = 0,1242, Nagelkerke R2 = 0,1708 dan p < 0,0001) (Tabel 1).
Tabel 1. Nilai konsentrasi hambat setengah maksimum (IC50) dan IC99 (mg/l) L-ornitin dan fungisida komersial “Rizolex-T” terhadap S. sclerotiorum.
Secara keseluruhan, L-ornitin (250 mg/L) secara signifikan mengurangi perkembangan dan tingkat keparahan penyakit jamur putih pada tanaman kacang buncis yang diberi perlakuan dibandingkan dengan tanaman yang terinfeksi S. sclerotiorum tanpa perlakuan (kontrol; Gambar 3A). Singkatnya, meskipun tingkat keparahan penyakit pada tanaman kontrol yang terinfeksi tanpa perlakuan secara bertahap meningkat (52,67 ± 1,53, 83,21 ± 2,61, dan 92,33 ± 3,06%), L-ornitin secara signifikan mengurangi tingkat keparahan penyakit (%) sepanjang percobaan (8,97 ± 0,15, 18,00 ± 1,00, dan 26,36 ± 3,07) pada 7, 14, dan 21 hari pasca-perlakuan (dpt), masing-masing (Gambar 3A). Demikian pula, ketika tanaman kacang yang terinfeksi S. sclerotiorum diberi perlakuan dengan 250 mg/L L-ornitin, luas area di bawah kurva perkembangan penyakit (AUDPC) menurun dari 1274,33 ± 33,13 pada kontrol tanpa perlakuan menjadi 281,03 ± 7,95, yang sedikit lebih rendah daripada kontrol positif fungisida Rizolex-T 50 mg/L (183,61 ± 7,71; Gambar 3B). Tren yang sama diamati pada percobaan kedua.
Gambar 3. Pengaruh aplikasi eksogen L-ornitin terhadap perkembangan penyakit busuk putih kacang buncis yang disebabkan oleh Sclerotinia sclerotiorum dalam kondisi rumah kaca. (A) Kurva perkembangan penyakit busuk putih kacang buncis setelah perlakuan dengan 250 mg/L L-ornitin. (B) Luas di bawah kurva perkembangan penyakit (AUDPC) busuk putih kacang buncis setelah perlakuan dengan L-ornitin. Nilai mewakili rata-rata ± SD dari lima replikasi biologis (n = 5). Huruf yang berbeda menunjukkan perbedaan yang signifikan secara statistik antar perlakuan (p < 0,05).
Aplikasi eksogen 250 mg/L L-ornitin secara bertahap meningkatkan tinggi tanaman (Gambar 4A), jumlah cabang per tanaman (Gambar 4B), dan jumlah daun per tanaman (Gambar 4C) setelah 42 hari. Sementara fungisida komersial Rizolex-T (50 mg/L) memiliki efek terbesar pada semua parameter nutrisi yang diteliti, aplikasi eksogen 250 mg/L L-ornitin memiliki efek terbesar kedua dibandingkan dengan kontrol tanpa perlakuan (Gambar 4A–C). Di sisi lain, perlakuan L-ornitin tidak memiliki efek signifikan pada kandungan pigmen fotosintetik klorofil a (Gambar 4D) dan klorofil b (Gambar 4E), tetapi sedikit meningkatkan kandungan total karotenoid (0,56 ± 0,03 mg/g berat segar) dibandingkan dengan kontrol negatif (0,44 ± 0,02 mg/g berat segar) dan kontrol positif (0,46 ± 0,02 mg/g berat segar; Gambar 4F). Secara keseluruhan, hasil ini menunjukkan bahwa L-ornitin tidak fitotoksik terhadap tanaman polong yang diberi perlakuan dan bahkan dapat merangsang pertumbuhannya.
Gambar 4. Pengaruh aplikasi L-ornitin eksogen terhadap karakteristik pertumbuhan dan pigmen fotosintetik daun kacang yang terinfeksi Sclerotinia sclerotiorum di bawah kondisi rumah kaca. (A) Tinggi tanaman (cm), (B) Jumlah cabang per tanaman, (C) Jumlah daun per tanaman, (D) Kandungan klorofil a (mg g-1 berat segar), (E) Kandungan klorofil b (mg g-1 berat segar), (F) Kandungan karotenoid total (mg g-1 berat segar). Nilai-nilai tersebut merupakan rata-rata ± SD dari lima replikasi biologis (n = 5). Huruf yang berbeda menunjukkan perbedaan yang signifikan secara statistik antar perlakuan (p < 0,05).
Lokalisasi histokimia in situ dari spesies oksigen reaktif (ROS; dinyatakan sebagai hidrogen peroksida [H2O2]) dan radikal bebas (dinyatakan sebagai anion superoksida [O2•−]) mengungkapkan bahwa aplikasi eksogen L-ornitin (250 mg/L) secara signifikan mengurangi akumulasi H2O2 (96,05 ± 5,33 nmol.g−1 FW; Gambar 5A) dan O2•− (32,69 ± 8,56 nmol.g−1 FW; Gambar 5B) dibandingkan dengan akumulasi pada tanaman terinfeksi yang tidak diobati (173,31 ± 12,06 dan 149,35 ± 7,94 nmol.g−1 FW, masing-masing) dan tanaman yang diobati dengan 50 mg/L fungisida komersial Rizolex-T (170,12 ± 9,50 dan 157,00 ± 7,81 nmol.g−1 berat segar, masing-masing) pada 72 jam. Tingkat H2O2 dan O2•− yang tinggi terakumulasi di bawah hpt (Gambar 5A, B). Demikian pula, uji malondialdehida (MDA) berbasis TCA menunjukkan bahwa tanaman kacang yang terinfeksi S. sclerotiorum mengakumulasi tingkat MDA yang lebih tinggi (113,48 ± 10,02 nmol.g berat segar) di daunnya (Gambar 5C). Namun, aplikasi eksogen L-ornitin secara signifikan mengurangi peroksidasi lipid seperti yang dibuktikan oleh penurunan kandungan MDA pada tanaman yang diberi perlakuan (33,08 ± 4,00 nmol.g berat segar).
Gambar 5. Pengaruh aplikasi L-ornitin eksogen terhadap penanda utama stres oksidatif dan mekanisme pertahanan antioksidan non-enzimatik pada daun kacang yang terinfeksi S. sclerotiorum pada 72 jam pasca-infeksi di bawah kondisi rumah kaca. (A) Hidrogen peroksida (H2O2; nmol g−1 FW) pada 72 hpt, (B) anion superoksida (O2•−; nmol g−1 FW) pada 72 hpt, (C) malondialdehida (MDA; nmol g−1 FW) pada 72 hpt, (D) total fenol terlarut (mg GAE g−1 FW) pada 72 hpt, (E) total flavonoid terlarut (mg RE g−1 FW) pada 72 hpt, (F) total asam amino bebas (mg g−1 FW) pada 72 hpt, dan (G) kandungan prolin (mg g−1 FW) pada 72 hpt. Nilai-nilai tersebut mewakili rata-rata ± standar deviasi (mean ± SD) dari 5 replikasi biologis (n = 5). Huruf yang berbeda menunjukkan perbedaan yang signifikan secara statistik antar perlakuan (p < 0,05).