Terima kasih telah mengunjungi Nature.com. Versi peramban yang Anda gunakan memiliki dukungan terbatas untuk CSS. Untuk pengalaman terbaik, kami sarankan Anda menggunakan peramban yang diperbarui (atau matikan mode kompatibilitas di Internet Explorer). Sementara itu, untuk memastikan dukungan berkelanjutan, kami akan menampilkan situs tanpa gaya dan JavaScript.
Nanopartikel insulin (NP) dengan kandungan muatan tinggi telah banyak digunakan dalam berbagai bentuk sediaan. Penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi pengaruh proses pengeringan beku dan pengeringan semprot terhadap struktur nanopartikel kitosan bermuatan insulin, dengan atau tanpa manitol sebagai krioprotektan. Kami juga menilai kualitas nanopartikel ini dengan melarutkannya kembali. Sebelum dehidrasi, ukuran partikel nanopartikel kitosan/natrium tripolifosfat/insulin yang terikat silang dioptimalkan menjadi 318 nm, PDI 0,18, efisiensi enkapsulasi 99,4%, dan muatan 25,01%. Setelah rekonstitusi, semua nanopartikel, kecuali yang diproduksi dengan metode pengeringan beku tanpa menggunakan manitol, mempertahankan struktur partikel bulatnya. Dibandingkan dengan nanopartikel yang mengandung manitol yang didehidrasi dengan metode semprot, nanopartikel kering semprot tanpa manitol juga menunjukkan ukuran partikel rata-rata terkecil. (376 nm) dan kandungan muatan tertinggi (25,02%) dengan tingkat enkapsulasi serupa (98,7%) dan PDI (0,20) dengan teknik pengeringan atau pengeringan beku. Nanopartikel kering dengan pengeringan semprot tanpa manitol juga menghasilkan pelepasan insulin tercepat dan efisiensi penyerapan seluler tertinggi. Penelitian ini menunjukkan bahwa pengeringan semprot dapat mendehidrasi nanopartikel insulin tanpa memerlukan krioprotektan dibandingkan dengan metode pengeringan beku konvensional, menciptakan kapasitas muatan yang lebih besar, kebutuhan aditif yang lebih rendah, dan biaya operasional yang jauh lebih rendah.
Sejak penemuannya pada tahun 19221,2,3, insulin dan sediaan farmasinya telah menyelamatkan nyawa pasien dengan diabetes tipe 1 (T1DM) dan diabetes tipe 2 (T2DM). Namun, karena sifatnya sebagai protein dengan berat molekul tinggi, insulin mudah mengalami agregasi, dipecah oleh enzim proteolitik, dan dieliminasi oleh efek lintas pertama. Orang yang didiagnosis menderita diabetes tipe 1 membutuhkan suntikan insulin seumur hidup. Banyak pasien yang awalnya didiagnosis menderita diabetes tipe 2 juga membutuhkan suntikan insulin jangka panjang. Suntikan insulin harian merupakan sumber rasa sakit dan ketidaknyamanan yang serius bagi individu-individu ini, dengan efek negatif pada kesehatan mental. Akibatnya, bentuk pemberian insulin lain yang menyebabkan ketidaknyamanan lebih sedikit, seperti pemberian insulin oral, sedang dipelajari secara ekstensif5 karena berpotensi untuk memulihkan kualitas hidup sekitar 5 miliar orang dengan diabetes di seluruh dunia.
Teknologi nanopartikel telah memberikan kemajuan signifikan dalam upaya untuk mengonsumsi insulin oral4,6,7. Salah satu teknologi yang efektif adalah nanopartikel yang mampu membungkus dan melindungi insulin dari degradasi untuk pengiriman yang ditargetkan ke lokasi tubuh tertentu. Namun, penggunaan formulasi nanopartikel memiliki beberapa keterbatasan, terutama karena masalah stabilitas suspensi partikel. Beberapa agregasi dapat terjadi selama penyimpanan, yang mengurangi bioavailabilitas nanopartikel yang mengandung insulin8. Selain itu, stabilitas kimia matriks polimer nanopartikel dan insulin juga harus dipertimbangkan untuk memastikan stabilitas nanopartikel insulin (NP). Saat ini, teknologi pengeringan beku adalah standar emas untuk menciptakan NP yang stabil sekaligus mencegah perubahan yang tidak diinginkan selama penyimpanan9.
Namun, pengeringan beku memerlukan penambahan krioprotektan untuk mencegah struktur bulat nanopartikel terpengaruh oleh tekanan mekanis kristal es. Hal ini secara signifikan mengurangi jumlah nanopartikel insulin setelah liofilisasi, karena krioprotektan menempati sebagian besar rasio berat. Oleh karena itu, nanopartikel insulin yang dihasilkan seringkali tidak cocok untuk pembuatan formulasi bubuk kering, seperti tablet oral dan film oral, karena dibutuhkan sejumlah besar nanopartikel kering untuk mencapai rentang terapeutik insulin.
Pengeringan semprot adalah proses skala industri yang terkenal dan murah untuk menghasilkan bubuk kering dari fase cair dalam industri farmasi10,11. Kontrol atas proses pembentukan partikel memungkinkan enkapsulasi yang tepat dari beberapa senyawa bioaktif 12, 13. Selain itu, teknik ini telah menjadi teknik yang efektif untuk pembuatan protein terenkapsulasi untuk pemberian oral. Selama pengeringan semprot, air menguap dengan sangat cepat, yang membantu menjaga suhu inti partikel tetap rendah11,14, sehingga memungkinkan penerapannya untuk mengenkapsulasi komponen yang sensitif terhadap panas. Sebelum pengeringan semprot, bahan pelapis harus dihomogenkan secara menyeluruh dengan larutan yang mengandung bahan-bahan yang dienkapsulasi11,14. Tidak seperti pengeringan beku, homogenisasi sebelum enkapsulasi dalam pengeringan semprot meningkatkan efisiensi enkapsulasi selama dehidrasi. Karena proses enkapsulasi pengeringan semprot tidak memerlukan krioprotektan, pengeringan semprot dapat digunakan untuk menghasilkan NP kering dengan kandungan muatan yang tinggi.
Studi ini melaporkan produksi nanopartikel bermuatan insulin melalui pengikatan silang kitosan dan natrium tripolifosfat menggunakan metode gel ion. Gelasi ion adalah metode preparasi yang memungkinkan produksi nanopartikel melalui interaksi elektrostatik antara dua atau lebih spesies ionik dalam kondisi tertentu. Baik teknik pengeringan beku maupun pengeringan semprot digunakan untuk mendehidrasi nanopartikel terikat silang kitosan/natrium tripolifosfat/insulin yang telah dioptimalkan. Setelah dehidrasi, morfologinya dianalisis dengan SEM. Kemampuan rekombinasinya dievaluasi dengan mengukur distribusi ukuran, muatan permukaan, PDI, efisiensi enkapsulasi, dan kandungan muatan. Kualitas nanopartikel yang dilarutkan kembali yang dihasilkan oleh metode dehidrasi yang berbeda juga dievaluasi dengan membandingkan perlindungan insulin, perilaku pelepasan, dan efikasi penyerapan seluler.
pH larutan campuran dan rasio kitosan dan insulin adalah dua faktor kunci yang memengaruhi ukuran partikel dan efisiensi enkapsulasi (EE) dari NP akhir, karena keduanya secara langsung memengaruhi proses gelasi ionotropik. pH larutan campuran terbukti sangat berkorelasi dengan ukuran partikel dan efisiensi enkapsulasi (Gambar 1a). Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1a, ketika pH meningkat dari 4,0 menjadi 6,0, ukuran partikel rata-rata (nm) menurun dan EE meningkat secara signifikan, sedangkan ketika pH meningkat menjadi 6,5, ukuran partikel rata-rata mulai meningkat dan EE tetap tidak berubah. Seiring dengan peningkatan rasio kitosan terhadap insulin, ukuran partikel rata-rata juga meningkat. Lebih lanjut, tidak ada perubahan EE yang diamati ketika nanopartikel disiapkan pada rasio massa kitosan/insulin lebih tinggi dari 2,5:1 (w/w) (Gambar 1b). Oleh karena itu, kondisi persiapan optimal dalam penelitian ini (pH 6,0, rasio massa kitosan/insulin sebesar...) 2,5:1) digunakan untuk menyiapkan nanopartikel bermuatan insulin untuk penelitian lebih lanjut. Di bawah kondisi persiapan ini, ukuran partikel rata-rata nanopartikel insulin dioptimalkan menjadi 318 nm (Gambar 1c), PDI adalah 0,18, efisiensi penyematan adalah 99,4%, potensial zeta adalah 9,8 mV, dan pemuatan insulin adalah 25,01% (m/m). Berdasarkan hasil mikroskop elektron transmisi (TEM), nanopartikel yang dioptimalkan berbentuk hampir bulat dan terpisah dengan ukuran yang relatif seragam (Gambar 1d).
Optimasi parameter nanopartikel insulin: (a) pengaruh pH terhadap diameter rata-rata dan efisiensi enkapsulasi (EE) nanopartikel insulin (disiapkan pada rasio massa kitosan dan insulin 5:1); (b) pengaruh rasio massa kitosan dan insulin terhadap diameter rata-rata dan efisiensi enkapsulasi (EE) nanopartikel insulin (disiapkan pada pH 6); (c) distribusi ukuran partikel nanopartikel insulin yang dioptimalkan; (d) mikrograf TEM nanopartikel insulin yang dioptimalkan.
Sudah diketahui bahwa kitosan adalah polielektrolit lemah dengan pKa 6,5. Kitosan bermuatan positif dalam media asam karena gugus amino utamanya terprotonasi oleh ion hidrogen15. Oleh karena itu, kitosan sering digunakan sebagai pembawa untuk mengenkapsulasi makromolekul bermuatan negatif. Dalam penelitian ini, kitosan digunakan untuk mengenkapsulasi insulin dengan titik isoelektrik 5,3. Karena kitosan digunakan sebagai bahan pelapis, dengan peningkatan proporsinya, ketebalan lapisan luar nanopartikel meningkat secara proporsional, sehingga menghasilkan ukuran partikel rata-rata yang lebih besar. Selain itu, kadar kitosan yang lebih tinggi dapat mengenkapsulasi lebih banyak insulin. Dalam kasus kami, EE tertinggi terjadi ketika rasio kitosan dan insulin mencapai 2,5:1, dan tidak ada perubahan signifikan pada EE ketika rasio terus meningkat.
Selain rasio kitosan dan insulin, pH juga memainkan peran penting dalam pembuatan NP. Gan dkk. 17 mempelajari pengaruh pH terhadap ukuran partikel nanopartikel kitosan. Mereka menemukan penurunan ukuran partikel secara terus menerus hingga pH mencapai 6,0, dan peningkatan ukuran partikel yang signifikan diamati pada pH > 6,0, yang konsisten dengan pengamatan kami. Fenomena ini disebabkan oleh fakta bahwa dengan meningkatnya pH, molekul insulin memperoleh muatan permukaan negatif, sehingga mendukung interaksi elektrostatik dengan kompleks kitosan/natrium tripolifosfat (TPP), menghasilkan ukuran partikel yang kecil dan EE yang tinggi. Namun, ketika pH disesuaikan menjadi 6,5, gugus amino pada kitosan mengalami deprotonasi, sehingga menyebabkan pelipatan kitosan. Dengan demikian, pH tinggi menghasilkan paparan ion amino yang lebih sedikit terhadap TPP dan insulin, sehingga menghasilkan ikatan silang yang lebih rendah, ukuran partikel rata-rata akhir yang lebih besar, dan EE yang lebih rendah.
Analisis sifat morfologi nanopartikel (NP) yang dikeringkan beku dan dikeringkan semprot dapat memandu pemilihan teknik dehidrasi dan pembentukan bubuk yang lebih baik. Metode yang dipilih harus memberikan stabilitas obat, bentuk partikel yang seragam, muatan obat yang tinggi, dan kelarutan yang baik dalam larutan aslinya. Dalam studi ini, untuk membandingkan kedua teknik tersebut dengan lebih baik, NP insulin dengan atau tanpa 1% manitol digunakan selama dehidrasi. Manitol digunakan sebagai agen pengisi atau krioprotektan dalam berbagai formulasi bubuk kering untuk pengeringan beku dan pengeringan semprot. Untuk nanopartikel insulin yang diliofilisasi tanpa manitol, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2a, struktur bubuk yang sangat berpori dengan permukaan yang besar, tidak beraturan, dan kasar diamati di bawah mikroskop elektron pemindaian (SEM). Beberapa partikel diskrit terdeteksi dalam bubuk setelah dehidrasi (Gambar 2e). Hasil ini menunjukkan bahwa sebagian besar NP terurai selama pengeringan beku tanpa krioprotektan apa pun. Untuk nanopartikel insulin yang dikeringkan beku dan dikeringkan semprot yang mengandung 1% manitol, nanopartikel bulat dengan permukaan halus diamati (Gambar 2a). 2b,d,f,h). Nanopartikel insulin yang dikeringkan dengan semprotan tanpa manitol tetap berbentuk bulat tetapi berkerut di permukaannya (Gambar 2c). Permukaan bulat dan berkerut akan dibahas lebih lanjut dalam perilaku pelepasan dan uji penyerapan seluler di bawah ini. Berdasarkan penampilan visual NP yang dikeringkan, baik NP yang dikeringkan dengan semprotan tanpa manitol maupun NP yang dikeringkan beku dan dikeringkan dengan semprotan dengan manitol menghasilkan bubuk NP halus (Gambar 2f,g,h). Semakin besar luas permukaan antara permukaan partikel, semakin tinggi kelarutannya dan oleh karena itu semakin tinggi laju pelepasannya.
Morfologi berbagai nanopartikel insulin yang telah didehidrasi: (a) Gambar SEM nanopartikel insulin yang diliofilisasi tanpa manitol; (b) Gambar SEM nanopartikel insulin yang diliofilisasi dengan manitol; (c) Gambar SEM nanopartikel insulin yang dikeringkan dengan semprotan tanpa manitol; (d) Gambar SEM nanopartikel insulin yang dikeringkan dengan semprotan dengan manitol; (e) Gambar serbuk nanopartikel insulin yang diliofilisasi tanpa manitol; (f) Gambar nanopartikel insulin yang diliofilisasi dengan manitol; (g) Gambar serbuk nanopartikel insulin yang dikeringkan dengan semprotan tanpa manitol; (h) Gambar serbuk nanopartikel insulin yang dikeringkan dengan semprotan dengan manitol.
Selama pengeringan beku, manitol bertindak sebagai krioprotektan, menjaga NP dalam bentuk amorf dan mencegah kerusakan oleh kristal es19. Sebaliknya, tidak ada langkah pembekuan selama pengeringan semprot. Oleh karena itu, manitol tidak diperlukan dalam metode ini. Bahkan, NP yang dikeringkan semprot tanpa manitol menghasilkan NP yang lebih halus seperti yang dijelaskan sebelumnya. Namun, manitol masih dapat bertindak sebagai pengisi dalam proses pengeringan semprot untuk memberikan NP struktur yang lebih bulat20 (Gambar 2d), yang membantu mendapatkan perilaku pelepasan yang seragam dari NP yang dienkapsulasi tersebut. Selain itu, jelas bahwa beberapa partikel besar dapat terdeteksi baik pada NP insulin yang dikeringkan beku maupun yang dikeringkan semprot yang mengandung manitol (Gambar 2b,d), yang mungkin disebabkan oleh akumulasi manitol di inti partikel bersama dengan insulin yang dienkapsulasi. Lapisan kitosan. Perlu dicatat bahwa dalam penelitian ini, untuk memastikan struktur bulat tetap utuh setelah dehidrasi, rasio manitol dan kitosan dijaga pada 5:1, sehingga sejumlah besar pengisi juga dapat memperbesar ukuran partikel NP kering.
Spektroskopi Fourier transform infrared attenuated total reflection (FTIR-ATR) mengkarakterisasi campuran fisik insulin bebas, kitosan, kitosan, TPP, dan insulin. Semua NP yang telah didehidrasi dikarakterisasi menggunakan spektroskopi FTIR-ATR. Perlu dicatat, intensitas pita 1641, 1543, dan 1412 cm-1 diamati pada NP yang dienkapsulasi dan dikeringkan beku dengan manitol, serta pada NP yang dikeringkan semprot dengan dan tanpa manitol (Gambar 3). Seperti yang dilaporkan sebelumnya, peningkatan kekuatan ini dikaitkan dengan ikatan silang antara kitosan, TPP, dan insulin. Investigasi interaksi antara kitosan dan insulin menunjukkan bahwa dalam spektrum FTIR nanopartikel kitosan yang mengandung insulin, pita kitosan tumpang tindih dengan pita insulin, meningkatkan intensitas karbonil (1641 cm-1) dan pita amina (1543 cm-1). Gugus tripolifosfat TPP dihubungkan dengan gugus amonium dalam kitosan, membentuk pita pada 1412 cm-1.
Spektrum FTIR-ATR dari insulin bebas, kitosan, campuran fisik kitosan/TPP/insulin dan NP yang didehidrasi dengan metode berbeda.
Lebih lanjut, hasil ini konsisten dengan hasil yang ditunjukkan pada SEM, yang menunjukkan bahwa NP yang terenkapsulasi tetap utuh baik saat disemprot maupun dikeringkan beku dengan manitol, tetapi tanpa manitol, hanya pengeringan semprot yang menghasilkan partikel terenkapsulasi. Sebaliknya, hasil spektrum FTIR-ATR dari NP yang dikeringkan beku tanpa manitol sangat mirip dengan campuran fisik kitosan, TPP, dan insulin. Hasil ini menunjukkan bahwa ikatan silang antara kitosan, TPP, dan insulin tidak lagi ada pada NP yang dikeringkan beku tanpa manitol. Struktur NP hancur selama pengeringan beku tanpa krioprotektan, yang dapat dilihat pada hasil SEM (Gambar 2a). Berdasarkan morfologi dan hasil FTIR dari NP insulin yang didehidrasi, hanya NP yang diliofilisasi, dikeringkan semprot, dan bebas manitol yang digunakan untuk percobaan rekonstitusi dan NP bebas manitol karena dekomposisi Nanopartikel bebas manitol selama dehidrasi. Diskusikan.
Dehidrasi digunakan untuk penyimpanan jangka panjang dan pemrosesan ulang menjadi formulasi lain. Kemampuan nanopartikel kering untuk direkonstitusi setelah penyimpanan sangat penting untuk penggunaannya dalam berbagai formulasi seperti tablet dan film. Kami memperhatikan bahwa ukuran partikel rata-rata nanopartikel insulin yang dikeringkan dengan semprotan tanpa manitol hanya sedikit meningkat setelah rekonstitusi. Di sisi lain, ukuran partikel nanopartikel insulin yang dikeringkan dengan semprotan dan beku dengan manitol meningkat secara signifikan (Tabel 1). PDI dan EE tidak berubah secara signifikan (p > 0,05) setelah rekombinasi semua nanopartikel dalam penelitian ini (Tabel 1). Hasil ini menunjukkan bahwa sebagian besar partikel tetap utuh setelah dilarutkan kembali. Namun, penambahan manitol mengakibatkan penurunan yang sangat besar pada pemuatan insulin nanopartikel manitol yang diliofilisasi dan dikeringkan dengan semprotan (Tabel 1). Sebaliknya, kandungan pemuatan insulin nanopartikel yang dikeringkan dengan semprotan tanpa manitol tetap sama seperti sebelumnya (Tabel 1).
Sudah diketahui bahwa pemuatan nanopartikel sangat penting ketika digunakan untuk tujuan pengiriman obat. Untuk NP dengan pemuatan rendah, dibutuhkan sejumlah besar material untuk mencapai ambang terapeutik. Namun, viskositas tinggi dari konsentrasi NP yang tinggi tersebut menyebabkan ketidaknyamanan dan kesulitan dalam pemberian oral dan formulasi injeksi, masing-masing 22. Selain itu, NP insulin juga dapat digunakan untuk membuat tablet dan biofilm kental23, 24, yang membutuhkan penggunaan sejumlah besar NP pada tingkat pemuatan rendah, menghasilkan tablet besar dan biofilm tebal yang tidak cocok untuk aplikasi oral. Oleh karena itu, NP dehidrasi dengan muatan insulin tinggi sangat diinginkan. Hasil kami menunjukkan bahwa muatan insulin tinggi dari NP yang dikeringkan dengan semprotan bebas manitol dapat menawarkan banyak keuntungan menarik untuk metode pengiriman alternatif ini.
Semua NP yang telah didehidrasi disimpan di lemari es selama tiga bulan. Hasil SEM menunjukkan bahwa morfologi semua NP yang telah didehidrasi tidak berubah secara signifikan selama penyimpanan tiga bulan (Gambar 4). Setelah direkonstitusi dalam air, semua NP menunjukkan sedikit penurunan EE dan melepaskan sekitar sejumlah kecil (~5%) insulin selama periode penyimpanan tiga bulan (Tabel 2). Namun, ukuran partikel rata-rata semua nanopartikel meningkat. Ukuran partikel NP yang dikeringkan dengan semprotan tanpa manitol meningkat menjadi 525 nm, sedangkan ukuran partikel NP yang dikeringkan dengan semprotan dan dikeringkan beku dengan manitol masing-masing meningkat menjadi 872 dan 921 nm (Tabel 2).
Morfologi berbagai nanopartikel insulin dehidrasi yang disimpan selama tiga bulan: (a) Gambar SEM nanopartikel insulin liofilisasi dengan manitol; (b) Gambar SEM nanopartikel insulin yang dikeringkan dengan semprotan tanpa manitol; (c) Gambar SEM nanopartikel insulin yang dikeringkan dengan semprotan tanpa manitol.
Selain itu, endapan terlihat pada nanopartikel insulin yang direkonstitusi dan dikeringkan dengan semprotan menggunakan manitol serta dikeringkan beku (Gambar S2). Hal ini mungkin disebabkan oleh partikel besar yang tidak tersuspensi dengan baik dalam air. Semua hasil di atas menunjukkan bahwa teknik pengeringan semprot dapat melindungi nanopartikel insulin dari dehidrasi dan bahwa muatan nanopartikel insulin yang tinggi dapat diperoleh tanpa bahan pengisi atau krioprotektan.
Retensi insulin diuji dalam medium pH = 2,5 dengan pepsin, tripsin, dan α-kimotripsin untuk menunjukkan kemampuan perlindungan NP terhadap pencernaan enzimatik setelah dehidrasi. Retensi insulin NP yang telah didehidrasi dibandingkan dengan NP yang baru disiapkan, dan insulin bebas digunakan sebagai kontrol negatif. Dalam penelitian ini, insulin bebas menunjukkan eliminasi insulin yang cepat dalam waktu 4 jam pada ketiga perlakuan enzimatik (Gambar 5a–c). Sebaliknya, pengujian eliminasi insulin NP yang dikeringkan beku dengan manitol dan NP yang dikeringkan semprot dengan atau tanpa manitol menunjukkan perlindungan yang jauh lebih tinggi dari NP ini terhadap pencernaan enzimatik, yang mirip dengan NP insulin yang baru disiapkan (Gambar 1).5a-c). Dengan bantuan nanopartikel dalam pepsin, tripsin, dan α-kimotripsin, lebih dari 50%, 60%, dan 75% insulin dapat dilindungi dalam waktu 4 jam, masing-masing (Gambar 5a-c). 5a–c). Kemampuan perlindungan insulin ini dapat meningkatkan peluang penyerapan insulin yang lebih tinggi ke dalam aliran darah25. Hasil ini menunjukkan bahwa pengeringan semprot dengan atau tanpa manitol dan pengeringan beku dengan manitol dapat mempertahankan kemampuan perlindungan insulin dari NP setelah dehidrasi.
Perilaku perlindungan dan pelepasan nanopartikel insulin terdehidrasi: (a) perlindungan insulin dalam larutan pepsin; (b) perlindungan insulin dalam larutan tripsin; (c) perlindungan insulin oleh larutan α-kimotripsin; (d) perilaku pelepasan nanopartikel terdehidrasi dalam larutan pH = 2,5; (e) perilaku pelepasan nanopartikel terdehidrasi dalam larutan pH = 6,6; (f) perilaku pelepasan nanopartikel terdehidrasi dalam larutan pH = 7,0.
Nanopartikel insulin kering yang baru disiapkan dan direkonstitusi diinkubasi dalam berbagai larutan penyangga (pH = 2,5, 6,6, 7,0) pada suhu 37 °C, mensimulasikan lingkungan pH lambung, duodenum, dan usus halus bagian atas, untuk meneliti efek insulin pada resistensi insulin. Perilaku pelepasan dalam lingkungan yang berbeda. Fragmen saluran pencernaan. Pada pH = 2,5, NP yang mengandung insulin dan NP insulin kering yang dilarutkan kembali menunjukkan pelepasan awal yang cepat dalam satu jam pertama, diikuti oleh pelepasan lambat selama 5 jam berikutnya (Gambar 5d). Pelepasan cepat di awal ini kemungkinan besar merupakan hasil dari desorpsi permukaan molekul protein yang tidak sepenuhnya terimobilisasi dalam struktur internal partikel. Pada pH = 6,5, NP yang mengandung insulin dan NP insulin kering yang direkonstitusi menunjukkan pelepasan yang halus dan lambat selama 6 jam, karena pH larutan uji mirip dengan pH larutan yang digunakan untuk menyiapkan NP (Gambar 5e). Pada pH = 7, NP tidak stabil dan hampir sepenuhnya terurai dalam dua jam pertama (Gambar 5f). Hal ini karena deprotonasi kitosan terjadi pada pH yang lebih tinggi, yang menghasilkan jaringan polimer yang kurang kompak dan pelepasan insulin yang dimuat.
Selain itu, nanopartikel insulin yang dikeringkan dengan semprotan tanpa manitol menunjukkan profil pelepasan yang lebih cepat dibandingkan nanopartikel dehidrasi lainnya (Gambar 5d–f). Seperti yang dijelaskan sebelumnya, nanopartikel insulin yang direkonstitusi dan dikeringkan tanpa manitol menunjukkan ukuran partikel terkecil. Partikel kecil memberikan luas permukaan yang lebih besar, sehingga sebagian besar obat yang relevan akan berada di atau dekat permukaan partikel, sehingga menghasilkan pelepasan obat yang cepat26.
Sitotoksisitas NP diselidiki dengan uji MTT. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar S4, semua NP yang telah didehidrasi ditemukan tidak memiliki efek signifikan pada viabilitas sel pada konsentrasi 50–500 μg/ml, menunjukkan bahwa semua NP yang telah didehidrasi dapat digunakan dengan aman untuk mencapai jendela terapeutik.
Hati adalah organ utama tempat insulin menjalankan fungsi fisiologisnya. Sel HepG2 adalah lini sel hepatoma manusia yang umum digunakan sebagai model penyerapan hepatosit in vitro. Di sini, sel HepG2 digunakan untuk menilai penyerapan seluler NP yang didehidrasi menggunakan metode pengeringan beku dan pengeringan semprot. Penyerapan seluler dengan pemindaian laser konfokal menggunakan sitometri aliran dan visual setelah beberapa jam inkubasi dengan insulin FITC bebas pada konsentrasi 25 μg/mL, NP bermuatan insulin FITC yang baru disiapkan, dan NP bermuatan insulin FITC yang didehidrasi pada konsentrasi insulin yang sama. Pengamatan mikroskop kuantitatif (CLSM) dilakukan. NP liofilisasi tanpa manitol hancur selama dehidrasi dan tidak dievaluasi dalam uji ini. Intensitas fluoresensi intraseluler dari NP bermuatan insulin yang baru disiapkan, NP liofilisasi dengan manitol, dan NP yang dikeringkan dengan semprotan dengan dan tanpa manitol (Gambar 6a) adalah 4,3, 2,6, 2,4, dan 4,1 kali lebih tinggi daripada insulin bebas. Kelompok FITC-insulin, masing-masing (Gambar 6b). Hasil ini menunjukkan bahwa insulin yang dienkapsulasi lebih ampuh dalam penyerapan seluler daripada insulin bebas, terutama karena ukuran nanopartikel bermuatan insulin yang dihasilkan dalam penelitian ini lebih kecil.
Penyerapan FITC-insulin oleh sel HepG2 setelah inkubasi 4 jam dengan NP yang baru disiapkan dan NP yang telah didehidrasi: (a) Distribusi penyerapan FITC-insulin oleh sel HepG2. (b) Rata-rata geometris intensitas fluoresensi yang dianalisis dengan sitometri aliran (n = 3), *P < 0,05 dibandingkan dengan insulin bebas.
Demikian pula, gambar CLSM menunjukkan bahwa intensitas fluoresensi FITC dari NP bermuatan FITC-insulin yang baru disiapkan dan NP bermuatan FITC-insulin yang dikeringkan dengan semprotan (tanpa manitol) jauh lebih kuat daripada sampel lainnya (Gambar 6a). Selanjutnya, dengan penambahan manitol, viskositas larutan yang lebih tinggi meningkatkan resistensi terhadap penyerapan seluler, sehingga mengakibatkan penurunan proliferasi insulin. Hasil ini menunjukkan bahwa NP yang dikeringkan dengan semprotan tanpa manitol menunjukkan efisiensi penyerapan seluler tertinggi karena ukuran partikelnya lebih kecil daripada NP yang dikeringkan beku setelah pelarutan ulang.
Kitosan (berat molekul rata-rata 100 KDa, 75–85% deasetilasi) dibeli dari Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Kanada). Natrium tripolifosfat (TPP) dibeli dari VWR (Radnor, Pennsylvania, AS). Insulin manusia rekombinan yang digunakan dalam penelitian ini berasal dari Fisher Scientific (Waltham, MA, AS). Insulin manusia berlabel fluorescein isothiocyanate (FITC) dan 4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) dibeli dari Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Kanada). Garis sel HepG2 diperoleh dari ATCC (Manassas, Virginia, AS). Semua reagen lainnya adalah kelas analitik atau kromatografi.
Siapkan larutan CS 1 mg/ml dengan melarutkannya dalam air suling ganda (air DD) yang mengandung asam asetat 0,1%. Siapkan larutan TPP dan insulin 1 mg/ml dengan melarutkannya masing-masing dalam air DD dan asam asetat 0,1%. Pra-emulsi disiapkan dengan homogenizer kecepatan tinggi polytron PCU-2-110 (Brinkmann Ind. Westbury, NY, USA). Proses persiapannya adalah sebagai berikut: pertama, 2 ml larutan TPP ditambahkan ke 4 ml larutan insulin, dan campuran diaduk selama 30 menit hingga tercampur sempurna. Kemudian, larutan campuran ditambahkan tetes demi tetes ke larutan CS melalui jarum suntik sambil diaduk dengan kecepatan tinggi (10.000 rpm). Campuran tersebut disimpan di bawah pengadukan kecepatan tinggi (15.000 rpm) dalam penangas es selama 30 menit, dan pH-nya disesuaikan untuk mendapatkan nanopartikel insulin yang terikat silang. Untuk lebih lanjut menghomogenkan dan mengurangi ukuran partikel insulin NP kemudian disonikasi selama 30 menit tambahan dalam rendaman es menggunakan sonikator tipe probe (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Teltow, Jerman).
Nanopartikel insulin diuji untuk diameter rata-rata Z, indeks polidispersitas (PDI), dan potensial zeta menggunakan pengukuran hamburan cahaya dinamis (DLS) menggunakan Litesizer 500 (Anton Paar, Graz, Austria) dengan melarutkannya dalam air DD pada suhu 25°C. Morfologi dan distribusi ukuran dikarakterisasi dengan mikroskop elektron transmisi (TEM) Hitachi H7600 (Hitachi, Tokyo, Jepang), dan gambar selanjutnya dianalisis menggunakan perangkat lunak pencitraan Hitachi (Hitachi, Tokyo, Jepang). Untuk menilai efisiensi enkapsulasi (EE) dan kapasitas pemuatan (LC) nanopartikel insulin, nanopartikel dipipet ke dalam tabung ultrafiltrasi dengan batas berat molekul 100 kDa dan disentrifugasi pada 500 xg selama 30 menit. Insulin yang tidak terenkapsulasi dalam filtrat dikuantifikasi menggunakan sistem HPLC Agilent 1100 Series (Agilent, Santa Clara, California, USA) yang terdiri dari pompa kuaterner, autosampler, pemanas kolom, dan detektor DAD. Insulin dianalisis dengan kolom C18 (Zorbax, 3,5 μm, 4,6 mm × 150 mm, Agilent, USA) dan dideteksi pada 214 nm. Fase gerak adalah asetonitril dan air, mengandung 0,1% TFA, rasio gradien dari 10/90 hingga 100/0, dan dijalankan selama 10 menit. Fase gerak dipompa dengan laju aliran 1,0 ml/menit. Suhu kolom diatur pada 20 °C. Hitung persentase EE dan LC menggunakan persamaan (1) dan persamaan (2).
Berbagai rasio CS/insulin mulai dari 2,0 hingga 4,0 diuji untuk mengoptimalkan nanopartikel insulin. Jumlah larutan CS yang berbeda ditambahkan selama persiapan, sementara campuran insulin/TPP dijaga konstan. Nanopartikel insulin disiapkan dalam rentang pH 4,0 hingga 6,5 ​​dengan mengontrol pH campuran secara hati-hati setelah menambahkan semua larutan (insulin, TPP, dan CS). Efisiensi enkapsulasi (EE) dan ukuran partikel nanopartikel insulin dievaluasi pada berbagai nilai pH dan rasio massa CS/insulin untuk mengoptimalkan pembentukan nanopartikel insulin.
Nanopartikel insulin yang telah dioptimalkan ditempatkan pada wadah aluminium dan ditutup dengan tisu yang dikencangkan dengan selotip. Selanjutnya, wadah yang telah ditutup rapat tersebut ditempatkan dalam pengering beku Labconco FreeZone (Labconco, Kansas City, MO, USA) yang dilengkapi dengan pengering baki. Suhu dan tekanan vakum diatur pada -10 °C, 0,350 Torr selama 2 jam pertama, dan 0 °C dan 0,120 Torr selama 22 jam sisanya dari total 24 jam untuk mendapatkan nanopartikel insulin kering.
Pengering semprot mini Buchi B-290 (BÜCHI, Flawil, Swiss) digunakan untuk menghasilkan insulin terenkapsulasi. Parameter pengeringan yang dipilih adalah: suhu 100 °C, laju aliran umpan 3 L/min, dan laju aliran gas 4 L/min.
Nanopartikel insulin sebelum dan sesudah dehidrasi dikarakterisasi menggunakan spektroskopi FTIR-ATR. Nanopartikel yang telah didehidrasi serta insulin dan kitosan bebas dianalisis menggunakan spektrofotometer FTIR Spectrum 100 (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, AS) yang dilengkapi dengan aksesori pengambilan sampel ATR universal (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, AS). Rata-rata sinyal diperoleh dari 16 pemindaian pada resolusi 4 cm2 dalam rentang frekuensi 4000-600 cm2.
Morfologi nanopartikel insulin kering dinilai melalui citra SEM dari nanopartikel insulin yang dikeringkan beku dan dikeringkan semprot yang diambil menggunakan Mikroskop Elektron Pemindaian Berkas Ion Terfokus (FIB-SEM) Helios NanoLab 650 (FEI, Hillsboro, Oregon, AS). Parameter utama yang digunakan adalah tegangan 5 keV dan arus 30 mA.
Semua nanopartikel insulin yang telah didehidrasi dilarutkan kembali dalam air suling. Ukuran partikel, PDI, EE, dan LC diuji kembali menggunakan metode yang sama seperti yang disebutkan sebelumnya untuk menilai kualitasnya setelah dehidrasi. Stabilitas nanopartikel anhidroinsulin juga diukur dengan menguji sifat-sifat nanopartikel setelah penyimpanan yang lama. Dalam penelitian ini, semua nanopartikel setelah dehidrasi disimpan di lemari es selama tiga bulan. Setelah tiga bulan penyimpanan, nanopartikel diuji untuk ukuran partikel morfologis, PDI, EE, dan LC.
Larutkan 5 mL NP yang telah direkonstitusi dalam 45 mL yang berisi cairan lambung simulasi (pH 1,2, mengandung 1% pepsin), cairan usus (pH 6,8, mengandung 1% tripsin) atau larutan kimotripsin (100 g/mL, dalam buffer fosfat, pH 7,8) untuk mengevaluasi kemanjuran insulin dalam melindungi NP setelah dehidrasi. Larutan tersebut diinkubasi pada suhu 37°C dengan kecepatan pengadukan 100 rpm. 500 μL larutan dikumpulkan pada titik waktu yang berbeda dan konsentrasi insulin ditentukan dengan HPLC.
Perilaku pelepasan in vitro dari nanopartikel insulin yang baru disiapkan dan didehidrasi diuji dengan metode kantung dialisis (batas berat molekul 100 kDa, Spectra Por Inc.). Nanopartikel kering yang baru disiapkan dan direkonstitusi didialisis dalam cairan pada pH 2,5, pH 6,6, dan pH 7,0 (larutan garam fosfat 0,1 M, PBS) untuk mensimulasikan lingkungan pH lambung, duodenum, dan usus halus bagian atas. Semua sampel diinkubasi pada suhu 37 °C dengan pengocokan terus menerus pada 200 rpm. Cairan di luar kantung dialisis 5 mL disedot pada waktu berikut: 0,5, 1, 2, 3, 4, dan 6 jam, dan segera diisi kembali volumenya dengan dialisat segar. Kontaminasi insulin dalam cairan dianalisis dengan HPLC, dan laju pelepasan insulin dari nanopartikel dihitung dari rasio insulin bebas yang dilepaskan terhadap total insulin yang terenkapsulasi dalam nanopartikel. nanopartikel (Persamaan 3).
Sel karsinoma hepatoseluler manusia HepG2 ditumbuhkan dalam cawan berdiameter 60 mm menggunakan Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) yang mengandung 10% serum janin sapi, 100 IU/mL penisilin, dan 100 μg/mL streptomisin29. Kultur dipertahankan pada suhu 37°C, kelembaban relatif 95%, dan 5% CO2. Untuk uji penyerapan, sel HepG2 ditanam pada kepadatan 1 × 10⁵ sel/ml ke dalam sistem slide ruang Nunc Lab-Tek 8 sumur (Thermo Fisher, NY, USA). Untuk uji sitotoksisitas, sel ditanam ke dalam pelat 96 sumur (Corning, NY, USA) dengan kepadatan 5 × 10⁴ sel/ml.
Uji MTT digunakan untuk mengevaluasi sitotoksisitas nanopartikel insulin yang baru disiapkan dan didehidrasi30. Sel HepG2 ditanam dalam pelat 96 sumur dengan kepadatan 5 × 104 sel/mL dan dikultur selama 7 hari sebelum pengujian. Nanopartikel insulin diencerkan ke berbagai konsentrasi (50 hingga 500 μg/mL) dalam medium kultur dan kemudian diberikan ke sel. Setelah inkubasi selama 24 jam, sel dicuci 3 kali dengan PBS dan diinkubasi dengan medium yang mengandung 0,5 mg/ml MTT selama 4 jam tambahan. Sitotoksisitas dinilai dengan mengukur reduksi enzimatik tetrazolium kuning MTT menjadi formazan ungu pada 570 nm menggunakan pembaca pelat spektrofotometer Tecan infinite M200 pro (Tecan, Männedorf, Swiss).
Efisiensi penyerapan seluler NP diuji dengan mikroskop pemindaian laser konfokal dan analisis sitometri aliran. Setiap sumur sistem slide ruang Nunc Lab-Tek diberi perlakuan dengan FITC-insulin bebas, NP bermuatan FITC-insulin, dan NP FITC-insulin dehidrasi yang dilarutkan kembali dengan konsentrasi yang sama, kemudian diinkubasi selama 4 jam. Sel dicuci 3 kali dengan PBS dan difiksasi dengan paraformaldehida 4%. Inti sel diwarnai dengan 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Lokalisasi insulin diamati menggunakan mikroskop konfokal pemindaian laser/dua-foton Olympus FV1000 (Olympus, Shinjuku City, Tokyo, Jepang). Untuk analisis sitometri aliran, konsentrasi yang sama dari 10 μg/mL FITC-insulin bebas, NP bermuatan FITC-insulin, dan NP dehidrasi yang dilarutkan kembali digunakan. Nanopartikel FITC-insulin ditambahkan ke pelat 96 sumur yang telah ditanami sel HepG2 dan diinkubasi selama 4 jam. Setelah 4 jam inkubasi, sel-sel diangkat dan dicuci 3 kali dengan FBS. 5 × 10⁴ sel per sampel dianalisis menggunakan flow sitometer BD LSR II (BD, Franklin Lakes, New Jersey, Amerika Serikat).
Semua nilai dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi. Perbandingan antar semua kelompok dinilai menggunakan ANOVA satu arah atau uji-t dengan IBM SPSS Statistics 26 untuk Mac (IBM, Endicott, New York, USA) dan p < 0,05 dianggap signifikan secara statistik.
Studi ini menunjukkan fleksibilitas dan kemampuan pengeringan semprot untuk mendehidrasi nanopartikel kitosan/TPP/insulin yang terikat silang dengan rekonstitusi yang lebih baik dibandingkan dengan metode pengeringan beku standar menggunakan agen pengisi atau krioprotektan dan kapasitas muatan yang lebih tinggi. Nanopartikel insulin yang dioptimalkan menghasilkan ukuran partikel rata-rata 318 nm dan efisiensi enkapsulasi 99,4%. Hasil SEM dan FTIR setelah dehidrasi menunjukkan bahwa struktur bulat dipertahankan hanya pada NP yang dikeringkan semprot dengan dan tanpa manitol dan yang diliofilisasi dengan manitol, tetapi NP yang diliofilisasi tanpa manitol terurai selama dehidrasi. Dalam uji kemampuan rekonstitusi, nanopartikel insulin yang dikeringkan semprot tanpa manitol menunjukkan ukuran partikel rata-rata terkecil dan muatan tertinggi setelah rekonstitusi. Perilaku pelepasan semua NP yang telah didehidrasi ini menunjukkan bahwa mereka dilepaskan dengan cepat dalam larutan pH = 2,5 dan pH = 7, dan sangat stabil dalam larutan pH = 6,5. Dibandingkan dengan yang lain Setelah dilarutkan kembali, nanopartikel dehidrasi yang dikeringkan dengan semprotan tanpa manitol menunjukkan pelepasan tercepat. Hasil ini konsisten dengan yang diamati dalam uji penyerapan seluler, karena nanopartikel yang dikeringkan dengan semprotan tanpa manitol hampir sepenuhnya mempertahankan efisiensi penyerapan seluler dari nanopartikel yang baru disiapkan. Hasil ini menunjukkan bahwa nanopartikel insulin kering yang disiapkan dengan pengeringan semprot tanpa manitol paling cocok untuk diproses lebih lanjut menjadi bentuk sediaan anhidrat lainnya, seperti tablet oral atau film bioadhesif.
Karena masalah hak kekayaan intelektual, kumpulan data yang dihasilkan dan/atau dianalisis selama penelitian ini tidak tersedia untuk umum, tetapi dapat diperoleh dari penulis masing-masing atas permintaan yang wajar.
Kagan, A. Diabetes tipe 2: asal-usul sosial dan ilmiah, komplikasi medis, dan implikasinya bagi pasien dan orang lain. (McFarlane, 2009).
Singh, AP, Guo, Y., Singh, A., Xie, W. & Jiang, P. Pengembangan enkapsulasi insulin: apakah pemberian oral sekarang memungkinkan? J. Pharmacy.bio-pharmacy.reservoir.1, 74–92 (2019).
Wong, CY, Al-Salami, H. & Dass, CR Kemajuan terkini dalam sistem pengiriman liposom bermuatan insulin oral untuk pengobatan diabetes. Interpretasi. J. Farmasi. 549, 201–217 (2018).