Terima kasih telah mengunjungi Nature.com. Versi peramban yang Anda gunakan memiliki dukungan CSS yang terbatas. Untuk hasil terbaik, kami sarankan Anda menggunakan versi peramban yang lebih baru (atau menonaktifkan Mode Kompatibilitas di Internet Explorer). Sementara itu, untuk memastikan dukungan berkelanjutan, kami menampilkan situs tanpa gaya atau JavaScript.
Asam propionat (PPA) digunakan untuk mempelajari peran disfungsi mitokondria dalam gangguan perkembangan saraf seperti gangguan spektrum autisme. PPA diketahui mengganggu biogenesis, metabolisme, dan pergantian mitokondria. Namun, efek PPA pada dinamika, pembelahan, dan fusi mitokondria masih menjadi masalah karena sifat temporal yang kompleks dari mekanisme ini. Di sini, kami menggunakan teknik pencitraan kuantitatif komplementer untuk menyelidiki bagaimana PPA memengaruhi ultrastruktur, morfologi, dan dinamika mitokondria pada sel SH-SY5Y yang menyerupai neuron. PPA (5 mM) menyebabkan penurunan signifikan pada luas mitokondria (p < 0,01), diameter dan keliling Feret (p < 0,05), dan luas 2 (p < 0,01). Analisis lokator peristiwa mitokondria menunjukkan peningkatan signifikan (p < 0,05) pada peristiwa pembelahan dan fusi, sehingga mempertahankan integritas jaringan mitokondria dalam kondisi stres. Selain itu, ekspresi mRNA cMYC (p < 0,0001), NRF1 (p < 0,01), TFAM (p < 0,05), STOML2 (p < 0,0001) dan OPA1 (p < 0,05) secara signifikan berkurang. 01). Hal ini menggambarkan penataan ulang morfologi, biogenesis, dan dinamika mitokondria untuk mempertahankan fungsi dalam kondisi stres. Data kami memberikan wawasan baru tentang efek PPA pada dinamika mitokondria dan menyoroti kegunaan teknik pencitraan untuk mempelajari mekanisme pengaturan kompleks yang terlibat dalam respons stres mitokondria.
Mitokondria merupakan partisipan integral dalam berbagai fungsi seluler di luar peran tipikalnya dalam produksi dan biosintesis energi. Metabolisme mitokondria adalah pengatur utama pensinyalan kalsium, homeostasis metabolik dan redoks, pensinyalan inflamasi, modifikasi epigenetik, proliferasi sel, diferensiasi, dan kematian sel terprogram1. Secara khusus, metabolisme mitokondria sangat penting untuk perkembangan, kelangsungan hidup, dan fungsi neuron serta banyak terlibat dalam berbagai manifestasi neuropatologi2,3,4.
Selama dekade terakhir, status metabolisme telah muncul sebagai pengatur utama neurogenesis, diferensiasi, pematangan, dan plastisitas5,6. Baru-baru ini, morfologi dan dinamika mitokondria telah menjadi komponen yang sangat penting dari mitosis, suatu proses dinamis yang mempertahankan kumpulan mitokondria sehat di dalam sel. Dinamika mitokondria diatur oleh jalur kompleks yang saling bergantung, mulai dari biogenesis dan bioenergetika mitokondria hingga pembelahan, fusi, transportasi, dan pembersihan mitokondria7,8. Gangguan pada salah satu mekanisme integratif ini mengganggu pemeliharaan jaringan mitokondria yang sehat dan memiliki konsekuensi fungsional yang mendalam bagi perkembangan saraf9,10. Memang, disregulasi dinamika mitokondria diamati pada banyak gangguan kejiwaan, neurodegeneratif, dan perkembangan saraf, termasuk gangguan spektrum autisme (ASD)11,12.
ASD adalah gangguan perkembangan saraf heterogen dengan arsitektur genetik dan epigenetik yang kompleks. Sifat keturunan ASD tidak diragukan lagi, tetapi etiologi molekuler yang mendasarinya masih kurang dipahami. Data yang terkumpul dari model praklinis, studi klinis, dan kumpulan data molekuler multi-omik memberikan bukti yang semakin kuat tentang disfungsi mitokondria pada ASD13,14. Sebelumnya, kami melakukan skrining metilasi DNA di seluruh genom pada kohort pasien dengan ASD dan mengidentifikasi gen yang mengalami metilasi berbeda yang berkelompok di sepanjang jalur metabolisme mitokondria15. Selanjutnya, kami melaporkan metilasi diferensial dari regulator sentral biogenesis dan dinamika mitokondria, yang dikaitkan dengan peningkatan jumlah salinan mtDNA dan perubahan profil metabolisme urin pada ASD16. Data kami memberikan bukti yang semakin kuat bahwa dinamika dan homeostasis mitokondria memainkan peran sentral dalam patofisiologi ASD. Oleh karena itu, meningkatkan pemahaman mekanistik tentang hubungan antara dinamika, morfologi, dan fungsi mitokondria merupakan tujuan utama dari penelitian yang sedang berlangsung mengenai penyakit neurologis yang ditandai dengan disfungsi mitokondria sekunder.
Teknik molekuler sering digunakan untuk mempelajari peran gen spesifik dalam respons stres mitokondria. Namun, pendekatan ini mungkin terbatas oleh sifat multifaset dan temporal dari mekanisme kontrol mitosis. Selain itu, ekspresi diferensial gen mitokondria merupakan indikator tidak langsung dari perubahan fungsional, terutama karena hanya sejumlah gen terbatas yang biasanya dianalisis. Oleh karena itu, metode yang lebih langsung untuk mempelajari fungsi dan bioenergetika mitokondria telah diusulkan17. Morfologi mitokondria berkaitan erat dengan dinamika mitokondria. Bentuk, konektivitas, dan struktur mitokondria sangat penting untuk produksi energi dan kelangsungan hidup mitokondria dan sel5,18. Selain itu, berbagai komponen mitosis berfokus pada perubahan morfologi mitokondria, yang dapat berfungsi sebagai titik akhir yang berguna dari disfungsi mitokondria dan memberikan dasar untuk studi mekanistik selanjutnya.
Morfologi mitokondria dapat diamati secara langsung menggunakan mikroskop elektron transmisi (TEM), memungkinkan studi rinci tentang ultrastruktur seluler. TEM secara langsung memvisualisasikan morfologi, bentuk, dan struktur krista mitokondria pada resolusi mitokondria individual, daripada hanya bergantung pada transkripsi gen, ekspresi protein, atau parameter fungsional mitokondria dalam populasi sel17,19,20. Selain itu, TEM memfasilitasi studi interaksi antara mitokondria dan organel lain, seperti retikulum endoplasma dan autofagosom, yang memainkan peran kunci dalam fungsi dan homeostasis mitokondria21,22. Dengan demikian, hal ini menjadikan TEM sebagai titik awal yang baik untuk mempelajari disfungsi mitokondria sebelum berfokus pada jalur atau gen tertentu. Karena fungsi mitokondria menjadi semakin relevan dengan neuropatologi, ada kebutuhan yang jelas untuk dapat mempelajari morfologi dan dinamika mitokondria secara langsung dan kuantitatif dalam model neuron in vitro.
Dalam artikel ini, kami meneliti dinamika mitokondria dalam model neuron disfungsi mitokondria pada gangguan spektrum autisme. Sebelumnya kami melaporkan metilasi diferensial propionil-CoA karboksilase beta (PCCB) pada ASD15, subunit dari enzim propionil-CoA karboksilase mitokondria PCC. Disregulasi PCC diketahui menyebabkan akumulasi toksik turunan propionil, termasuk asam propionat (PPA)23,24,25. PPA telah terbukti mengganggu metabolisme neuron dan mengubah perilaku in vivo dan merupakan model hewan yang mapan untuk mempelajari mekanisme perkembangan saraf yang terlibat dalam ASD26,27,28. Selain itu, PPA telah dilaporkan mengganggu potensial membran mitokondria, biogenesis, dan respirasi in vitro dan telah banyak digunakan untuk memodelkan disfungsi mitokondria pada neuron29,30. Namun, dampak disfungsi mitokondria yang diinduksi PPA pada morfologi dan dinamika mitokondria masih kurang dipahami.
Studi ini menggunakan teknik pencitraan komplementer untuk mengukur efek PPA pada morfologi, dinamika, dan fungsi mitokondria dalam sel SH-SY5Y. Pertama, kami mengembangkan metode TEM untuk memvisualisasikan perubahan morfologi dan ultrastruktur mitokondria17,31,32. Mengingat sifat dinamis mitokondria33, kami juga menggunakan analisis pelokalisasi peristiwa mitokondria (MEL) untuk mengukur perubahan keseimbangan antara peristiwa fisi dan fusi, jumlah dan volume mitokondria di bawah tekanan PPA. Terakhir, kami memeriksa apakah morfologi dan dinamika mitokondria terkait dengan perubahan ekspresi gen yang terlibat dalam biogenesis, fisi, dan fusi. Secara keseluruhan, data kami menggambarkan tantangan dalam menjelaskan kompleksitas mekanisme yang mengatur dinamika mitokondria. Kami menyoroti kegunaan TEM dalam mempelajari morfologi mitokondria sebagai titik akhir konvergen yang terukur dari mitosis dalam sel SH-SY5Y. Selain itu, kami menekankan bahwa data TEM memberikan informasi paling kaya ketika dikombinasikan dengan teknik pencitraan yang juga menangkap peristiwa dinamis sebagai respons terhadap stres metabolik. Karakterisasi lebih lanjut dari mekanisme pengaturan molekuler yang mendukung mitosis sel neuron dapat memberikan wawasan penting tentang komponen mitokondria dari sistem saraf dan penyakit neurodegeneratif.
Untuk menginduksi stres mitokondria, sel SH-SY5Y diberi perlakuan PPA menggunakan natrium propionat (NaP) 3 mM dan 5 mM. Sebelum TEM, sampel diproses dengan preparasi sampel kriogenik menggunakan pembekuan dan pendinginan bertekanan tinggi (Gambar 1a). Kami mengembangkan alur kerja analisis citra mitokondria otomatis untuk mengukur delapan parameter morfologi populasi mitokondria di tiga replikasi biologis. Kami menemukan bahwa perlakuan PPA secara signifikan mengubah empat parameter: luas 2, luas, keliling, dan diameter Feret (Gambar 1b–e). Luas 2 menurun secara signifikan dengan perlakuan PPA 3 mM dan 5 mM (p = 0,0183 dan p = 0,002, masing-masing) (Gambar 1b), sedangkan luas (p = 0,003), keliling (p = 0,0106) dan diameter Feret semuanya menurun secara signifikan. Terjadi penurunan signifikan (p = 0,0172) pada kelompok perlakuan 5 mM dibandingkan dengan kelompok kontrol (Gambar 1c–e). Penurunan signifikan pada luas dan keliling menunjukkan bahwa sel yang diberi perlakuan 5 mM PPA memiliki mitokondria yang lebih kecil dan lebih bulat, dan mitokondria ini kurang memanjang dibandingkan dengan mitokondria pada sel kontrol. Hal ini juga konsisten dengan penurunan signifikan pada diameter Feret, parameter independen yang menunjukkan penurunan jarak terbesar antara tepi partikel. Perubahan ultrastruktur krista diamati: krista menjadi kurang menonjol di bawah pengaruh stres PPA (Gambar 1a, panel B). Namun, tidak semua gambar secara jelas mencerminkan ultrastruktur krista, sehingga analisis kuantitatif dari perubahan ini tidak dilakukan. Data TEM ini mungkin mencerminkan tiga skenario yang mungkin: (1) PPA meningkatkan pembelahan atau menghambat fusi, menyebabkan mitokondria yang ada menyusut ukurannya; (2) peningkatan biogenesis menciptakan mitokondria baru yang lebih kecil atau (3) menginduksi kedua mekanisme tersebut secara bersamaan. Meskipun kondisi ini tidak dapat dibedakan dengan TEM, perubahan morfologis yang signifikan menunjukkan perubahan dalam homeostasis dan dinamika mitokondria di bawah tekanan PPA. Selanjutnya, kami mengeksplorasi parameter tambahan untuk mengkarakterisasi lebih lanjut dinamika ini dan mekanisme potensial yang mendasarinya.
Asam propionat (PPA) mengubah morfologi mitokondria. (a) Gambar mikroskop elektron transmisi (TEM) representatif menunjukkan bahwa ukuran mitokondria berkurang dan mitokondria menjadi lebih kecil dan lebih bulat dengan peningkatan perlakuan PPA; 0 mM (tidak diobati), 3 mM dan 5 mM, masing-masing. Panah merah menunjukkan mitokondria. (b–e) Sel SH-SY5Y yang diobati dengan PPA selama 24 jam disiapkan untuk TEM dan hasilnya dianalisis menggunakan Fiji/ImageJ. Empat dari delapan parameter menunjukkan perbedaan signifikan antara sel kontrol (tidak diobati, 0 mM PPA) dan sel yang diobati (3 mM dan 5 mM PPA). (b) Wilayah 2, (c) Luas, (d) Keliling, (e) Diameter Feret. Analisis varians satu arah (kontrol vs. perlakuan) dan uji perbandingan berganda Dunnett digunakan untuk menentukan perbedaan signifikan (p < 0,05). Titik data mewakili nilai mitokondria rata-rata untuk setiap sel individu, dan batang kesalahan mewakili rata-rata ± SEM. Data yang ditampilkan mewakili n = 3, setidaknya 24 sel per replikasi; total 266 gambar dianalisis; * menunjukkan p < 0,05, ** menunjukkan p < 0,01.
Untuk mengkarakterisasi lebih lanjut bagaimana dinamika mitokondria merespons PPA, kami mewarnai mitokondria dengan tetramethylrhodamine ethyl ester (TMRE) dan menggunakan mikroskop time-lapse dan analisis MEL untuk melokalisasi dan mengkuantifikasi mitokondria setelah 24 jam pada konsentrasi PPA 3 dan 5 mM. Perlakuan terhadap peristiwa fisi dan fusi. (Gambar 2a). Setelah analisis MEL, mitokondria dianalisis lebih lanjut untuk mengkuantifikasi jumlah struktur mitokondria dan volume rata-ratanya. Kami mengamati peningkatan kecil namun signifikan dalam jumlah peristiwa fisi yang terjadi pada 3 mM [4,9 ± 0,3 (p < 0,05)] dibandingkan dengan peristiwa fisi [5,6 ± 0,3 (p < 0,05)] dan fusi [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] dan fusi [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] meningkat secara signifikan pada 5 mM dibandingkan dengan kontrol (Gambar 3b). Jumlah mitokondria meningkat secara signifikan baik pada 3 [32,6 ± 2,1 (p < 0,05)] dan 5 mM [34,1 ± 2,2 (p < 0,05)] (Gambar 3c), sementara volume rata-rata setiap struktur mitokondria tetap tidak berubah (Gambar 3c). 3d). Secara keseluruhan, hal ini menunjukkan bahwa penataan ulang dinamika mitokondria berfungsi sebagai respons kompensasi yang berhasil mempertahankan integritas jaringan mitokondria. Peningkatan jumlah peristiwa pembelahan pada 3 mM PPA menunjukkan bahwa peningkatan jumlah mitokondria sebagian disebabkan oleh pembelahan mitokondria, tetapi mengingat volume mitokondria rata-rata pada dasarnya tetap tidak berubah, biogenesis tidak dapat dikesampingkan sebagai respons kompensasi tambahan. Namun, data ini konsisten dengan struktur mitokondria yang lebih kecil dan bulat yang diamati oleh TEM dan juga menunjukkan perubahan signifikan dalam dinamika mitokondria yang diinduksi oleh PPA.
Asam propionat (PPA) menginduksi penataan ulang mitokondria dinamis untuk mempertahankan integritas jaringan. Sel SH-SY5Y dikultur, diberi perlakuan dengan PPA 3 dan 5 mM selama 24 jam dan diwarnai dengan TMRE dan Hoechst 33342 diikuti dengan analisis MEL. (a) Gambar mikroskop time-lapse representatif yang menggambarkan proyeksi intensitas maksimum berwarna dan biner pada waktu 2 (t2) untuk setiap kondisi. Wilayah terpilih yang ditunjukkan dalam setiap gambar biner ditingkatkan dan ditampilkan dalam 3D pada tiga kerangka waktu berbeda (t1-t3) untuk menggambarkan dinamika dari waktu ke waktu; peristiwa fusi disorot dengan warna hijau; peristiwa fisi disorot dengan warna hijau. Ditampilkan dengan warna merah. (b) Rata-rata jumlah peristiwa dinamis per kondisi. (c) Rata-rata jumlah struktur mitokondria per sel. (d) Rata-rata volume (µm3) setiap struktur mitokondria per sel. Data yang ditampilkan mewakili n = 15 sel per kelompok perlakuan. Batang kesalahan yang ditampilkan mewakili rata-rata ± SEM, skala bar = 10 μm, * p < 0,05.
Asam propionat (PPA) menyebabkan penekanan transkripsi gen yang terkait dengan dinamika mitokondria. Sel SH-SY5Y diberi perlakuan dengan PPA 3 dan 5 mM selama 24 jam. Kuantifikasi gen relatif dilakukan menggunakan RT-qPCR dan dinormalisasi terhadap B2M. Gen biogenesis mitokondria (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 dan (d) NFE2L2. Gen fusi dan fisi mitokondria (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 dan (i) DRP1. Perbedaan signifikan (p < 0,05) diuji menggunakan ANOVA satu arah (kontrol vs. perlakuan) dan uji perbandingan berganda Dunnett: * menunjukkan p < 0,05, ** menunjukkan p < 0,01, dan **** menunjukkan p < 0,0001. Batang menunjukkan ekspresi rata-rata ± SEM. Data yang ditampilkan mewakili n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2), dan n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) replikasi biologis.
Data dari analisis TEM dan MEL secara bersama-sama menunjukkan bahwa PPA mengubah morfologi dan dinamika mitokondria. Namun, teknik pencitraan ini tidak memberikan wawasan tentang mekanisme mendasar yang mendorong proses-proses ini. Oleh karena itu, kami memeriksa ekspresi mRNA dari sembilan regulator kunci dinamika, biogenesis, dan mitosis mitokondria sebagai respons terhadap pengobatan PPA. Kami mengukur ekspresi gen onkogen mieloma sel (cMYC), faktor pernapasan nuklir (NRF1), faktor transkripsi mitokondria 1 (TFAM), faktor transkripsi mirip NFE2 BZIP (NFE2L2), protein mirip gastrin 2 (STOML2), atrofi saraf optik 1 (OPA1), Mitofusin 1 (MFN1), Mitofusin 2 (MFN2), dan protein terkait dinamina 1 (DRP1) setelah 24 jam pengobatan dengan PPA 3 mM dan 5 mM. Kami mengamati perlakuan PPA 3 mM (p = 0,0053, p = 0,0415 dan p < 0,0001, masing-masing) dan 5 mM (p = 0,0031, p = 0,0233, p < 0,0001). (Gambar 3a–c). Penurunan ekspresi mRNA bergantung pada dosis: ekspresi cMYC, NRF1 dan TFAM menurun masing-masing sebesar 5,7, 2,6 dan 1,9 kali pada 3 mM, dan sebesar 11,2, 3 dan 2,2 kali pada 5 mM. Sebaliknya, gen biogenesis redoks sentral NFE2L2 tidak berubah pada konsentrasi PPA apa pun, meskipun tren penurunan ekspresi yang bergantung pada dosis serupa diamati (Gambar 3d).
Kami juga memeriksa ekspresi gen klasik yang terlibat dalam regulasi pembelahan dan fusi. STOML2 diduga terlibat dalam fusi, mitofagi, dan biogenesis, dan ekspresinya berkurang secara signifikan (p < 0,0001) oleh PPA 3 mM (perubahan 2,4 kali lipat) dan 5 mM (perubahan 2,8 kali lipat) (Gambar 1). 3d). Demikian pula, ekspresi gen fusi OPA1 menurun pada PPA 3 mM (perubahan 1,6 kali lipat) dan 5 mM (perubahan 1,9 kali lipat) (p = 0,006 dan p = 0,0024, masing-masing) (Gambar 3f). Namun, kami tidak menemukan perbedaan signifikan dalam ekspresi gen fusi MFN1, MFN2, atau gen pembelahan DRP1 di bawah tekanan PPA 24 jam (Gambar 3g–i). Selain itu, kami menemukan bahwa kadar empat protein fusi dan fisi (OPA1, MFN1, MFN2, dan DRP1) tidak berubah dalam kondisi yang sama (Gambar 4a–d). Penting untuk dicatat bahwa data ini mencerminkan satu titik waktu dan mungkin tidak mencerminkan perubahan ekspresi protein atau tingkat aktivitas selama tahap awal stres PPA. Namun, penurunan signifikan dalam ekspresi cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, dan OPA1 menunjukkan disregulasi transkripsional yang signifikan pada metabolisme, biogenesis, dan dinamika mitokondria. Selain itu, data ini menyoroti kegunaan teknik pencitraan untuk secara langsung mempelajari perubahan keadaan akhir dalam fungsi mitokondria.
Kadar protein faktor fusi dan fisi tidak berubah setelah perlakuan asam propionat (PPA). Sel SH-SY5Y diberi perlakuan dengan PPA 3 dan 5 mM selama 24 jam. Kadar protein dikuantifikasi dengan analisis Western blot, dan kadar ekspresi dinormalisasi terhadap total protein. Ekspresi protein rata-rata dan Western blot representatif dari protein target dan total protein ditunjukkan. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Batang menunjukkan mean ± SEM, dan data yang ditampilkan merupakan representasi dari n = 3 replikasi biologis. Perbandingan berganda (p < 0,05) dilakukan menggunakan analisis varians satu arah dan uji Dunnett. Gel dan blot asli ditunjukkan pada Gambar S1.
Disfungsi mitokondria dikaitkan dengan penyakit multisistem mulai dari penyakit metabolik, kardiovaskular, dan otot hingga penyakit neurologis1,10. Banyak penyakit neurodegeneratif dan neurodegeneratif dikaitkan dengan disfungsi mitokondria, yang menyoroti pentingnya organel ini sepanjang masa hidup otak. Penyakit-penyakit ini termasuk penyakit Parkinson, penyakit Alzheimer, dan ASD3,4,18. Namun, akses ke jaringan otak untuk mempelajari penyakit-penyakit ini sulit, terutama pada tingkat mekanistik, sehingga sistem model seluler menjadi alternatif yang diperlukan. Dalam penelitian ini, kami menggunakan sistem model seluler menggunakan sel SH-SY5Y yang diberi perlakuan PPA untuk merekapitulasi disfungsi mitokondria yang diamati pada penyakit neuronal, khususnya gangguan spektrum autisme. Menggunakan model PPA ini untuk mempelajari dinamika mitokondria pada neuron dapat memberikan wawasan tentang etiologi ASD.
Kami mengeksplorasi kemungkinan penggunaan TEM untuk melihat perubahan morfologi mitokondria. Penting untuk dicatat bahwa TEM harus digunakan dengan benar untuk memaksimalkan efektivitasnya. Preparasi spesimen krio memungkinkan pengawetan struktur neuron yang lebih baik dengan secara bersamaan memfiksasi komponen seluler dan mengurangi pembentukan artefak34. Sesuai dengan hal ini, kami mengamati bahwa sel SH-SY5Y yang menyerupai neuron memiliki organel subseluler yang utuh dan mitokondria yang memanjang (Gambar 1a). Hal ini menyoroti kegunaan teknik preparasi kriogenik untuk mempelajari morfologi mitokondria dalam model sel neuron. Meskipun pengukuran kuantitatif sangat penting untuk analisis objektif data TEM, masih belum ada konsensus tentang parameter spesifik apa yang harus diukur untuk mengkonfirmasi perubahan morfologi mitokondria. Berdasarkan sejumlah besar penelitian yang telah secara kuantitatif memeriksa morfologi mitokondria17,31,32, kami mengembangkan alur kerja analisis citra mitokondria otomatis yang mengukur delapan parameter morfologi, yaitu: luas, luas2, rasio aspek, keliling, sirkularitas, derajat, diameter Feret, dan kebulatan.
Di antara faktor-faktor tersebut, PPA secara signifikan mengurangi luas 2, luas, keliling, dan diameter Feret (Gambar 1b–e). Hal ini menunjukkan bahwa mitokondria menjadi lebih kecil dan lebih bulat, yang konsisten dengan penelitian sebelumnya yang menunjukkan penurunan luas mitokondria setelah 72 jam stres mitokondria yang diinduksi PPA30. Ciri-ciri morfologis ini mungkin mengindikasikan pembelahan mitokondria, suatu proses yang diperlukan untuk memisahkan komponen yang rusak dari jaringan mitokondria untuk mendorong degradasinya melalui mitofagi35,36,37. Di sisi lain, penurunan ukuran mitokondria rata-rata mungkin terkait dengan peningkatan biogenesis, yang menghasilkan pembentukan mitokondria baru yang kecil. Peningkatan pembelahan atau biogenesis merupakan respons kompensasi untuk mempertahankan mitosis terhadap stres mitokondria. Namun, penurunan pertumbuhan mitokondria, gangguan fusi, atau kondisi lain tidak dapat dikesampingkan.
Meskipun citra beresolusi tinggi yang dihasilkan oleh TEM memungkinkan penentuan karakteristik morfologi pada tingkat mitokondria individual, metode ini menghasilkan gambaran dua dimensi pada satu titik waktu. Untuk mempelajari respons dinamis terhadap stres metabolik, kami mewarnai mitokondria dengan TMRE dan menggunakan mikroskopi time-lapse dengan analisis MEL, yang memungkinkan visualisasi 3D berkecepatan tinggi dari perubahan dalam jaringan mitokondria dari waktu ke waktu33,38. Kami mengamati perubahan halus namun signifikan dalam dinamika mitokondria di bawah stres PPA (Gambar 2). Pada 3 mM, jumlah peristiwa fisi meningkat secara signifikan, sementara peristiwa fusi tetap sama seperti pada kontrol. Peningkatan jumlah peristiwa fisi dan fusi diamati pada 5 mM PPA, tetapi perubahan ini kira-kira proporsional, menunjukkan bahwa kinetika fisi dan fusi mencapai keseimbangan pada konsentrasi yang lebih tinggi (Gambar 2b). Volume mitokondria rata-rata tetap tidak berubah pada konsentrasi PPA 3 dan 5 mM, menunjukkan bahwa integritas jaringan mitokondria tetap terjaga (Gambar 2d). Hal ini mencerminkan kemampuan jaringan mitokondria yang dinamis untuk merespons stres metabolik ringan guna mempertahankan homeostasis secara efektif tanpa menyebabkan fragmentasi jaringan. Pada konsentrasi PPA 3 mM, peningkatan pembelahan cukup untuk mendorong transisi ke keseimbangan baru, tetapi diperlukan penataan ulang kinetik yang lebih mendalam sebagai respons terhadap stres yang diinduksi oleh konsentrasi PPA yang lebih tinggi.
Jumlah mitokondria meningkat pada kedua konsentrasi stres PPA, tetapi volume mitokondria rata-rata tidak berubah secara signifikan (Gambar 2c). Hal ini mungkin disebabkan oleh peningkatan biogenesis atau peningkatan pembelahan; namun, tanpa penurunan signifikan pada volume mitokondria rata-rata, kemungkinan besar biosintesis meningkat. Namun, data pada Gambar 2 mendukung keberadaan dua mekanisme kompensasi: peningkatan jumlah peristiwa pembelahan, yang konsisten dengan peningkatan pembelahan mitokondria, dan peningkatan jumlah peristiwa, yang konsisten dengan biogenesis mitokondria. Pada akhirnya, kompensasi dinamis untuk stres ringan mungkin terdiri dari proses simultan yang melibatkan pembelahan, fusi, biogenesis, dan mitofagi. Meskipun penulis sebelumnya telah menunjukkan bahwa PPA meningkatkan mitosis30,39 dan mitofagi29, kami memberikan bukti untuk penataan ulang dinamika pembelahan dan fusi mitokondria sebagai respons terhadap PPA. Data ini mengkonfirmasi perubahan morfologis yang diamati oleh TEM dan memberikan wawasan lebih lanjut tentang mekanisme yang terkait dengan disfungsi mitokondria yang disebabkan oleh PPA.
Karena analisis TEM maupun MEL tidak memberikan bukti langsung tentang mekanisme pengaturan gen yang mendasari perubahan morfologi yang diamati, kami memeriksa ekspresi RNA dari gen yang terlibat dalam metabolisme, biogenesis, dan dinamika mitokondria. Proto-onkogen cMYC adalah faktor transkripsi yang terlibat dalam pengaturan mitokondria, glikolisis, metabolisme asam amino dan asam lemak40. Selain itu, cMYC diketahui mengatur ekspresi hampir 600 gen mitokondria yang terlibat dalam transkripsi, translasi, dan perakitan kompleks mitokondria, termasuk NRF1 dan TFAM41. NRF1 dan TFAM adalah dua regulator sentral mitosis, yang bekerja di hilir PGC-1α untuk mengaktifkan replikasi mtDNA. Jalur ini diaktifkan oleh sinyal cAMP dan AMPK dan sensitif terhadap pengeluaran energi dan stres metabolik. Kami juga memeriksa NFE2L2, regulator redoks biogenesis mitokondria, untuk menentukan apakah efek PPA mungkin dimediasi oleh stres oksidatif.
Meskipun ekspresi NFE2L2 tetap tidak berubah, kami menemukan penurunan ekspresi cMYC, NRF1, dan TFAM yang konsisten dan bergantung pada dosis setelah 24 jam pengobatan dengan 3 mM dan 5 mM PPA (Gambar 3a–c). Penurunan ekspresi cMYC sebelumnya telah dilaporkan sebagai respons terhadap stres mitokondria42, dan sebaliknya, penurunan ekspresi cMYC dapat menyebabkan disfungsi mitokondria dengan memodifikasi metabolisme mitokondria, konektivitas jaringan, dan polarisasi membran43. Menariknya, cMYC juga terlibat dalam regulasi pembelahan dan fusi mitokondria42,43 dan diketahui meningkatkan fosforilasi DRP1 dan lokalisasi mitokondria selama pembelahan sel44, serta memediasi remodeling morfologi mitokondria pada sel induk neuron45. Memang, fibroblas yang kekurangan cMYC menunjukkan ukuran mitokondria yang berkurang, konsisten dengan perubahan yang diinduksi oleh stres PPA43. Data ini menggambarkan hubungan yang menarik namun masih belum jelas antara cMYC dan dinamika mitokondria, yang memberikan target menarik untuk studi masa depan tentang penataan ulang yang diinduksi oleh stres PPA.
Penurunan NRF1 dan TFAM konsisten dengan peran cMYC sebagai aktivator transkripsi penting. Data ini juga konsisten dengan penelitian sebelumnya pada sel kanker usus besar manusia yang menunjukkan bahwa PPA mengurangi ekspresi mRNA NRF1 pada 22 jam, yang dikaitkan dengan penipisan ATP dan peningkatan ROS46. Para penulis tersebut juga melaporkan bahwa ekspresi TFAM meningkat pada 8,5 jam tetapi kembali ke tingkat dasar pada 22 jam. Sebaliknya, Kim dkk. (2019) menunjukkan bahwa ekspresi mRNA TFAM menurun secara signifikan setelah 4 jam stres PPA pada sel SH-SY5Y; namun, setelah 72 jam, ekspresi protein TFAM meningkat secara signifikan dan jumlah salinan mtDNA meningkat secara signifikan. Dengan demikian, penurunan jumlah gen biogenesis mitokondria yang kami amati setelah 24 jam tidak mengesampingkan kemungkinan bahwa peningkatan jumlah mitokondria dikaitkan dengan aktivasi biogenesis pada titik waktu yang lebih awal. Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa PPA secara signifikan meningkatkan mRNA dan protein PGC-1α pada sel SH-SY5Y pada 4 jam 30 menit, sementara asam propionat meningkatkan biogenesis mitokondria pada hepatosit anak sapi melalui PGC-1α pada 12 jam 39 menit. Menariknya, PGC-1α tidak hanya merupakan regulator transkripsi langsung dari NRF1 dan TFAM, tetapi juga telah terbukti mengatur aktivitas MFN2 dan DRP1 dengan mengatur pembelahan dan fusi47. Secara keseluruhan, ini menyoroti keterkaitan erat mekanisme yang mengatur respons kompensasi mitokondria yang diinduksi oleh PPA. Selain itu, data kami mencerminkan disregulasi signifikan dari regulasi transkripsi biogenesis dan metabolisme di bawah tekanan PPA.
Gen STOML2, OPA1, MFN1, MFN2, dan DRP1 termasuk di antara regulator sentral pembelahan, fusi, dan dinamika mitokondria37,48,49. Terdapat banyak gen lain yang terlibat dalam dinamika mitokondria, namun, STOML2, OPA1, dan MFN2 sebelumnya telah ditemukan mengalami metilasi berbeda pada kelompok ASD,16 dan beberapa studi independen telah melaporkan perubahan pada faktor transkripsi ini sebagai respons terhadap stres mitokondria50,51, 52. Ekspresi OPA1 dan STOML2 secara signifikan berkurang dengan perlakuan PPA 3 mM dan 5 mM (Gambar 3e, f). OPA1 adalah salah satu regulator klasik fusi mitokondria melalui interaksi langsung dengan MFN1 dan 2 dan berperan dalam remodeling krista dan morfologi mitokondria53. Peran pasti STOML2 dalam dinamika mitokondria masih belum jelas, tetapi bukti menunjukkan bahwa ia berperan dalam fusi mitokondria, biogenesis, dan mitofagi.
STOML2 terlibat dalam menjaga kopling respirasi mitokondria dan pembentukan kompleks rantai respirasi54,55 dan telah terbukti secara signifikan mengubah karakteristik metabolisme sel kanker56. Studi menunjukkan bahwa STOML2 meningkatkan potensial membran mitokondria dan biogenesis melalui interaksi dengan BAN dan kardiolipin 55, 57, 58. Selain itu, studi independen menunjukkan bahwa interaksi antara STOML2 dan PINK1 mengatur mitofagi59,60. Yang perlu diperhatikan, STOML2 dilaporkan berinteraksi langsung dengan dan menstabilkan MFN2 dan juga memainkan peran penting dalam menstabilkan isoform OPA1 panjang dengan menghambat protease yang bertanggung jawab atas degradasi OPA153,61,62. Penurunan ekspresi STOML2 yang diamati dalam reaksi PPA dapat membuat protein fusi ini lebih rentan terhadap degradasi melalui jalur yang bergantung pada ubiquitin dan proteasom48. Meskipun peran pasti STOML2 dan OPA1 dalam respons dinamis terhadap PPA belum jelas, penurunan ekspresi gen fusi ini (Gambar 3) dapat mengganggu keseimbangan antara pembelahan dan fusi dan menyebabkan penurunan ukuran mitokondria (Gambar 3). 1).
Di sisi lain, ekspresi protein OPA1 tetap tidak berubah setelah 24 jam, sedangkan kadar mRNA dan protein MFN1, MFN2, atau DRP1 tidak berubah secara signifikan setelah perlakuan PPA (Gambar 3g-i, Gambar 4). Hal ini mungkin menunjukkan bahwa tidak ada perubahan dalam regulasi faktor-faktor yang terlibat dalam fusi dan fisi mitokondria. Namun, perlu dicatat bahwa masing-masing dari keempat gen ini juga diatur oleh modifikasi pascatranskripsi (PTM) yang mengontrol aktivitas protein. OPA1 memiliki delapan varian splicing alternatif yang dibelah secara proteolitik di mitokondria untuk menghasilkan dua isoform berbeda 63. Keseimbangan antara isoform panjang dan pendek pada akhirnya menentukan peran OPA1 dalam fusi mitokondria dan pemeliharaan jaringan mitokondria64. Aktivitas DRP1 diatur oleh fosforilasi protein kinase II (CaMKII) yang bergantung pada kalsium/kalmodulin, sedangkan degradasi DRP1 diatur oleh ubikuitinasi dan SUMOylation65. Terakhir, baik DRP1 maupun MFN1/2 adalah GTPase, sehingga aktivitasnya dapat dipengaruhi oleh laju produksi GTP di mitokondria 66. Oleh karena itu, meskipun ekspresi protein ini tetap konstan, hal ini mungkin tidak mencerminkan aktivitas atau lokalisasi protein yang tidak berubah67,68. Memang, repertoar protein PTM yang ada sering berfungsi sebagai garis pertahanan pertama yang bertanggung jawab untuk memediasi respons stres akut. Dengan adanya stres metabolik sedang dalam model kami, kemungkinan PTM mendorong peningkatan aktivitas protein fusi dan fisi untuk memulihkan integritas mitokondria secara memadai tanpa memerlukan aktivasi tambahan gen-gen ini pada tingkat mRNA atau protein.
Secara keseluruhan, data di atas menyoroti regulasi morfologi mitokondria yang kompleks dan bergantung pada waktu, serta tantangan dalam menjelaskan mekanisme ini. Untuk mempelajari ekspresi gen, pertama-tama perlu mengidentifikasi gen target spesifik dalam jalur tersebut. Namun, data kami menunjukkan bahwa gen dalam jalur yang sama tidak merespons dengan cara yang sama terhadap stres yang sama. Bahkan, penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa gen yang berbeda dalam jalur yang sama dapat menunjukkan profil respons temporal yang berbeda30,46. Selain itu, terdapat mekanisme pasca-transkripsi yang kompleks yang mengganggu hubungan antara transkripsi dan fungsi gen. Studi proteomik dapat memberikan wawasan tentang dampak PTM dan fungsi protein, tetapi juga menimbulkan tantangan termasuk metode dengan throughput rendah, rasio sinyal-ke-noise yang tinggi, dan resolusi yang buruk.
Dalam konteks ini, mempelajari morfologi mitokondria menggunakan TEM dan MEL memiliki potensi besar untuk menjawab pertanyaan mendasar tentang hubungan antara dinamika dan fungsi mitokondria serta bagaimana hal ini memengaruhi penyakit. Yang terpenting, TEM menyediakan metode langsung untuk mengukur morfologi mitokondria sebagai titik akhir konvergen dari disfungsi dan dinamika mitokondria51. MEL juga menyediakan metode langsung untuk memvisualisasikan peristiwa pembelahan dan fusi dalam lingkungan seluler tiga dimensi, memungkinkan kuantifikasi remodeling mitokondria dinamis bahkan tanpa adanya perubahan ekspresi gen33. Di sini kami menyoroti kegunaan teknik pencitraan mitokondria dalam penyakit mitokondria sekunder. Penyakit-penyakit ini biasanya ditandai dengan stres metabolik ringan kronis yang ditandai dengan remodeling halus jaringan mitokondria daripada kerusakan mitokondria akut. Namun, kompensasi mitokondria yang diperlukan untuk mempertahankan mitosis di bawah stres kronis memiliki konsekuensi fungsional yang mendalam. Dalam konteks ilmu saraf, pemahaman yang lebih baik tentang mekanisme kompensasi ini dapat memberikan informasi penting tentang neuropatologi pleiotropik yang terkait dengan disfungsi mitokondria.
Pada akhirnya, data kami menyoroti kegunaan teknik pencitraan untuk memahami konsekuensi fungsional dari interaksi kompleks antara ekspresi gen, modifikasi protein, dan aktivitas protein yang mengontrol dinamika mitokondria neuron. Kami menggunakan PPA untuk memodelkan disfungsi mitokondria dalam model sel neuron untuk mendapatkan wawasan tentang komponen mitokondria dari ASD. Sel SH-SY5Y yang diberi perlakuan PPA menunjukkan perubahan morfologi mitokondria: mitokondria menjadi kecil dan bulat, dan krista kurang jelas ketika diamati dengan TEM. Analisis MEL menunjukkan bahwa perubahan ini terjadi bersamaan dengan peningkatan peristiwa pembelahan dan fusi untuk mempertahankan jaringan mitokondria sebagai respons terhadap stres metabolik ringan. Selain itu, PPA secara signifikan mengganggu regulasi transkripsi metabolisme dan homeostasis mitokondria. Kami mengidentifikasi cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, dan OPA1 sebagai regulator mitokondria utama yang terganggu oleh stres PPA dan mungkin berperan dalam memediasi perubahan morfologi dan fungsi mitokondria yang diinduksi PPA. Studi lebih lanjut diperlukan untuk mengkarakterisasi perubahan temporal yang diinduksi PPA pada ekspresi gen dan aktivitas protein, lokalisasi, dan modifikasi pasca-translasi dengan lebih baik. Data kami menyoroti kompleksitas dan saling ketergantungan mekanisme pengaturan yang memediasi respons stres mitokondria dan menunjukkan kegunaan TEM dan teknik pencitraan lainnya untuk studi mekanistik yang lebih terarah.
Sel SH-SY5Y (ECACC, 94030304-1VL) dibeli dari Sigma-Aldrich. Sel SH-SY5Y ditumbuhkan dalam campuran nutrisi Dulbecco's modified Eagle's medium/F-12 (DMEM/F-12) dan L-glutamin (SC09411, ScienCell) dalam labu 25 cm2 yang dilengkapi dengan 20% serum janin sapi (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) dan 1% penisilin-streptomisin (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) pada suhu 37 °C, 5% CO2. Sel dikultur ulang hingga mencapai 80% konfluensi menggunakan 0,05% tripsin-EDTA (15400054, ThermoFisher Scientific), disentrifugasi pada 300 g, dan ditanam pada kepadatan sekitar 7 × 10⁵ sel/ml. Semua percobaan dilakukan pada sel SH-SY5Y yang belum terdiferensiasi antara passage 19–22. PPA diberikan sebagai NaP. Larutkan bubuk NaP (CAS No. 137-40-6, rumus kimia C₃H₅NaO₂, P5436-100G, Sigma-Aldrich) dalam air MilliQ hangat hingga konsentrasi 1 M dan simpan pada suhu 4 °C. Pada hari pengobatan, encerkan larutan ini dengan 1 M PPA hingga 3 mM dan 5 mM PPA dalam medium bebas serum (DMEM/F-12 dengan L-glutamin). Konsentrasi perlakuan untuk semua percobaan adalah tanpa PPA (0 mM, kontrol), 3 mM, dan 5 mM PPA. Percobaan dilakukan dalam setidaknya tiga replikasi biologis.
Sel SH-SY5Y ditanam ke dalam labu 25 cm5 dengan laju 5,5 × 10⁵ sel/ml dan ditumbuhkan selama 24 jam. Perlakuan PPA ditambahkan ke dalam labu sebelum inkubasi 24 jam. Kumpulkan pelet sel mengikuti protokol subkultur jaringan mamalia normal (seperti yang dijelaskan di atas). Suspensi ulang pelet sel dalam 100 µl glutaraldehida 2,5%, 1× PBS dan simpan pada suhu 4 °C hingga diproses. Sel SH-SY5Y disentrifugasi sebentar untuk memisahkan sel dan menghilangkan larutan glutaraldehida 2,5%, 1× PBS. Suspensi ulang endapan dalam gel agarosa 4% yang dibuat dalam air suling (rasio volume agarosa terhadap endapan adalah 1:1). Potongan agarosa ditempatkan pada kisi-kisi di atas pelat datar dan dilapisi dengan 1-heksadesena sebelum dibekukan dengan tekanan tinggi. Sampel dibekukan dalam aseton kering 100% pada suhu -90°C selama 24 jam. Suhu kemudian dinaikkan menjadi -80°C dan ditambahkan larutan 1% osmium tetroksida dan 0,1% glutaraldehida. Sampel disimpan pada suhu -80°C selama 24 jam. Setelah itu, suhu secara bertahap dinaikkan ke suhu ruangan selama beberapa hari: dari –80°C ke –50°C selama 24 jam, ke –30°C selama 24 jam, ke –10°C selama 24 jam dan akhirnya ke suhu ruangan.
Setelah preparasi kriogenik, sampel diimpregnasi dengan resin dan sayatan ultra tipis (∼100 nm) dibuat menggunakan ultramikrotom Leica Reichert UltracutS (Leica Microsystems). Sayatan diwarnai dengan 2% uranil asetat dan timbal sitrat. Sampel diamati menggunakan mikroskop elektron transmisi FEI Tecnai 20 (ThermoFisher (sebelumnya FEI), Eindhoven, Belanda) yang beroperasi pada 200 kV (pemancar Lab6) dan kamera CCD Gatan (Gatan, Inggris) yang dilengkapi dengan filter energi Tridiem.
Pada setiap replikasi teknis, setidaknya 24 gambar sel tunggal diperoleh, dengan total 266 gambar. Semua gambar dianalisis menggunakan makro Region of Interest (ROI) dan makro Mitokondria. Makro mitokondria didasarkan pada metode yang telah dipublikasikan17,31,32 dan memungkinkan pemrosesan batch semi-otomatis gambar TEM di Fiji/ImageJ69. Singkatnya: gambar dibalik dan dibalik menggunakan pengurangan latar belakang bola bergulir (radius 60 piksel) dan filter bandpass FFT (menggunakan batas atas dan bawah masing-masing 60 dan 8 piksel) dan penekanan garis vertikal dengan toleransi orientasi 5%. Gambar yang diproses secara otomatis diberi ambang batas menggunakan algoritma entropi maksimum dan masker biner dihasilkan. Wilayah gambar yang terkait dengan ROI yang dipilih secara manual dalam gambar TEM mentah diekstrak, yang mengkarakterisasi mitokondria dan mengecualikan membran plasma dan wilayah kontras tinggi lainnya. Untuk setiap ROI yang diekstrak, partikel biner yang lebih besar dari 600 piksel dianalisis, dan luas partikel, keliling, sumbu mayor dan minor, diameter Feret, kebulatan, dan sirkularitas diukur menggunakan fungsi pengukuran bawaan Fiji/ImageJ. Mengikuti Merrill, Flippo, dan Strack (2017), luas 2, rasio aspek partikel (rasio sumbu mayor terhadap sumbu minor), dan faktor bentuk (FF) dihitung dari data ini, di mana FF = keliling 2/4pi x luas. Definisi rumus parametrik dapat ditemukan dalam Merrill, Flippo, dan Strack (2017). Makro yang disebutkan tersedia di GitHub (lihat Pernyataan Ketersediaan Data). Rata-rata, sekitar 5.600 partikel dianalisis per perlakuan PPA, dengan total sekitar 17.000 partikel (data tidak ditampilkan).
Sel SH-SH5Y ditempatkan dalam cawan kultur 8 ruang (ThermoFisher, #155411) untuk memungkinkan adhesi semalaman dan kemudian diinkubasi dengan TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) dan Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024) untuk pewarnaan. Gambar diperoleh menggunakan laser 405 nm dan 561 nm selama 10 menit, dan gambar mentah diperoleh sebagai tumpukan z yang berisi 10 mikrograf gambar dengan langkah az 0,2 μm antara bingkai gambar pada 12 titik waktu berikutnya. Gambar dikumpulkan menggunakan platform super-resolusi Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 (Carl Zeiss, Oberkochen, Jerman) menggunakan lensa LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27. Gambar dianalisis di ImageJ menggunakan alur kerja yang telah dijelaskan sebelumnya dan plugin ImageJ untuk mengukur peristiwa fusi dan fisi, jumlah rata-rata struktur mitokondria, dan volume mitokondria rata-rata per sel33. Makro MEL tersedia di GitHub (lihat Pernyataan Ketersediaan Data).
Sel SH-SY5Y ditumbuhkan dalam lempeng enam sumur dengan kepadatan 0,3 × 10⁶ sel/mL selama 24 jam sebelum perlakuan. RNA diekstraksi menggunakan protokol Quick-RNA™ Miniprep (ZR R1055, Zymo Research) dengan sedikit modifikasi: tambahkan 300 μl buffer lisis RNA ke setiap sumur sebelum dikeluarkan dan lisis setiap sampel sebagai langkah akhir dengan 30 μl elusi DNase/RNase. Semua sampel diperiksa kuantitas dan kualitasnya menggunakan Spektrofotometer UV-Vis NanoDrop ND-1000. Total protein dari lisat sel diperoleh menggunakan 200 μl buffer lisis RIPA, dan konsentrasi protein dikuantifikasi menggunakan uji protein Bradford⁷⁰.
Sintesis cDNA dilakukan menggunakan Kit Sintesis cDNA Tetro™ (BIO-65043, Meridian Bioscience) sesuai petunjuk pabrik dengan beberapa modifikasi. cDNA disintesis dalam reaksi 20 μl menggunakan 0,7 hingga 1 μg total RNA. Primer dipilih dari makalah yang telah dipublikasikan sebelumnya 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (Tabel S1) dan probe yang menyertainya dirancang menggunakan alat PrimerQuest dari Integrated DNA Technologies. Semua gen yang diminati dinormalisasi terhadap gen B2M nuklir. Ekspresi gen STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC, dan OPA1 diukur dengan RT-qPCR. Master mix tersebut mencakup polimerase LUNA Taq (M3003L, New England Biolabs), primer maju dan mundur 10 μM, cDNA, dan air murni untuk PCR sehingga menghasilkan volume akhir 10 μL untuk setiap reaksi. Ekspresi gen pembelahan dan fisi (DRP1, MFN1/2) diukur menggunakan assay multipleks TaqMan. Luna Universal Probe qPCR Master Mix (M3004S, New England Biolabs) digunakan sesuai petunjuk pabrik dengan sedikit modifikasi. Master mix RT-qPCR multipleks mencakup polimerase LUNA Taq 1X, primer maju dan mundur 10 μM, probe 10 μM, cDNA, dan air murni untuk PCR, menghasilkan volume akhir 20 μL untuk setiap reaksi. RT-qPCR dilakukan menggunakan Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG—nomor seri: R0618110). Kondisi siklus ditunjukkan pada Tabel S1. Semua sampel cDNA diamplifikasi dalam rangkap tiga dan kurva standar dihasilkan menggunakan serangkaian pengenceran sepuluh kali lipat. Data pencilan dalam sampel rangkap tiga dengan deviasi standar ambang siklus (Ct) >0,5 dikeluarkan dari analisis untuk memastikan reproduktivitas data30,72. Ekspresi gen relatif dihitung menggunakan metode 2-ΔΔCt79.
Sampel protein (60 μg) dicampur dengan buffer pemuatan Laemmli dengan rasio 2:1 dan dijalankan pada gel protein tak berwarna 12% (Bio-Rad #1610184). Protein dipindahkan ke membran PVDF (polivinilidena fluorida) (#170-84156, Bio-Rad) menggunakan sistem Trans-Blot Turbo (#170-4155, Bio-Rad). Membran diblokir dan diinkubasi dengan antibodi primer yang sesuai (OPA1, MFN1, MFN2, dan DRP1) (diencerkan 1:1000) selama 48 jam, diikuti dengan inkubasi dengan antibodi sekunder (1:10.000) selama 1 jam. Membran kemudian diimajinasikan menggunakan Clarity Western ECL Substrate (#170-5061, Bio-Rad) dan direkam menggunakan sistem Bio-Rad ChemiDoc MP. ImageLab versi 6.1 digunakan untuk analisis Western blot. Gel dan blot asli ditunjukkan pada Gambar S1. Informasi antibodi diberikan pada Tabel S2.
Kumpulan data disajikan sebagai nilai rata-rata dan kesalahan standar rata-rata (SEM) dari setidaknya tiga sampel independen. Kumpulan data diuji normalitasnya menggunakan uji Shapiro-Wilks (kecuali dinyatakan lain) sebelum mengasumsikan distribusi Gaussian dan deviasi standar yang sama dan melanjutkan analisis. Selain itu, kumpulan data dianalisis menggunakan uji Fisher's MEL LSD (p < 0,05), ANOVA satu arah (rata-rata perlakuan vs. kontrol), dan uji perbandingan berganda Dunnett untuk menentukan signifikansi (p < 0,05). Nilai p yang signifikan ditunjukkan pada grafik sebagai *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Semua analisis statistik dan grafik dilakukan dan dibuat menggunakan GraphPad Prism 9.4.0.
Makro Fiji/ImageJ untuk analisis gambar TEM tersedia secara publik di GitHub: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. Makro Mitochondrial Event Locator (MEL) tersedia secara publik di GitHub: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Meiliana A., Devi NM dan Vijaya A. Mitokondria: pengatur utama metabolisme, homeostasis, stres, penuaan dan epigenetik. Jurnal Ilmu Biomedis Indonesia. 13, 221–241 (2021).
Ben-Shachar, D. Disfungsi mitokondria multifaset pada skizofrenia, kompleks I sebagai target patologis yang mungkin. Sumber daya skizofrenia. 187, 3–10 (2017).
Bose, A. dan Beal, MF Disfungsi mitokondria pada penyakit Parkinson. J. Neurochemistry. 139, 216–231 (2016).
Sharma VK, Singh TG dan Mehta V. Mitokondria yang mengalami stres: target invasi pada penyakit Alzheimer. Mitokondria 59, 48–57 (2021).
Belenguer P., Duarte JMN, Shook PF dan Ferreira GK Mitokondria dan otak: bioenergetika dan lainnya. Neurotoksin. sumber daya. 36, 219–238 (2019).
Rangaraju, V. dkk. Mitokondria pleiotropik: dampak mitokondria pada perkembangan dan penyakit neuron. J. Neuroscience. 39, 8200–8208 (2019).
Cardaño-Ramos, C. dan Morais, VA. Biogenesis mitokondria pada neuron: bagaimana dan di mana. Internasionalitas. J. Mohr. Sains. 22, 13059 (2021).
Yu, R., Lendahl, U., Nister, M. dan Zhao, J. Regulasi dinamika mitokondria mamalia: peluang dan tantangan. front. endocrine. (Lausanne) 11, 374 (2020).
Khacho, M. dan Slack, RS. Dinamika mitokondria dalam pengaturan neurogenesis: dari perkembangan hingga otak dewasa. perkembangan. dinamis. 247, 47–53 (2018).