Alamat saat ini: Cologne 50931, Jerman, Cologne Excellence Cluster Research on Cellular Stress Response in Aging-related Diseases (CECAD).
Neurodegenerasi akibat penyakit mitokondria dianggap ireversibel karena plastisitas metabolik neuron terbatas, tetapi efek disfungsi mitokondria pada otonomi sel metabolisme neuron dalam tubuh masih kurang dipahami. Di sini, kami memperkenalkan proteom spesifik sel neuron Purkinje dengan defisiensi OXPHOS progresif yang disebabkan oleh gangguan dinamika fusi mitokondria. Kami menemukan bahwa disfungsi mitokondria memicu perubahan mendalam di bidang proteomik, yang pada akhirnya menyebabkan aktivasi berurutan dari program metabolisme yang tepat sebelum kematian sel. Secara tak terduga, kami menentukan induksi yang jelas dari piruvat karboksilase (PCx) dan enzim anti-penuaan lainnya yang melengkapi intermediat siklus TCA. Inhibisi PCx memperburuk stres oksidatif dan neurodegenerasi, menunjukkan bahwa aterosklerosis memiliki efek perlindungan pada neuron yang kekurangan OXPHOS. Pemulihan fusi mitokondria pada neuron yang mengalami degenerasi terminal sepenuhnya membalikkan karakteristik metabolisme ini, sehingga mencegah kematian sel. Temuan kami mengidentifikasi jalur yang sebelumnya tidak diketahui yang memberikan ketahanan terhadap disfungsi mitokondria dan menunjukkan bahwa neurodegenerasi dapat dibalikkan bahkan pada tahap akhir penyakit.
Peran sentral mitokondria dalam menjaga metabolisme energi neuron ditekankan oleh gejala neurologis yang luas yang terkait dengan penyakit mitokondria pada manusia. Sebagian besar penyakit ini disebabkan oleh mutasi gen yang mengatur ekspresi gen mitokondria (1, 2) atau kerusakan gen yang terkait dengan dinamika mitokondria, yang secara tidak langsung memengaruhi stabilitas DNA mitokondria (mtDNA) (3, 4). Penelitian pada model hewan telah menunjukkan bahwa sebagai respons terhadap disfungsi mitokondria di jaringan sekitarnya, jalur metabolisme konservatif (5-7) dapat diaktifkan, yang memberikan informasi penting untuk pemahaman mendalam tentang patogenesis penyakit kompleks ini. Sebaliknya, pemahaman kita tentang perubahan metabolisme jenis sel tertentu yang disebabkan oleh kegagalan umum produksi adenosin trifosfat (ATP) mitokondria otak sangat mendasar (8), menekankan perlunya mengidentifikasi target terapi yang dapat digunakan untuk mencegah atau menanggulangi penyakit neurodegenerasi (9). Kurangnya informasi disebabkan oleh fakta bahwa sel saraf secara luas dianggap memiliki fleksibilitas metabolisme yang sangat terbatas dibandingkan dengan jenis sel jaringan sekitarnya (10). Mengingat sel-sel ini memainkan peran sentral dalam mengoordinasikan pasokan metabolit ke neuron untuk meningkatkan transmisi sinaptik dan merespons cedera dan kondisi penyakit, kemampuan untuk mengadaptasi metabolisme sel terhadap kondisi menantang jaringan otak hampir terbatas pada sel glial (11-14). Selain itu, heterogenitas seluler yang melekat pada jaringan otak sebagian besar menghambat studi perubahan metabolisme yang terjadi pada subkelompok neuron tertentu. Akibatnya, sedikit yang diketahui tentang konsekuensi seluler dan metabolik yang tepat dari disfungsi mitokondria pada neuron.
Untuk memahami konsekuensi metabolik dari disfungsi mitokondria, kami mengisolasi neuron Purkinje (PN) pada berbagai tahap neurodegenerasi yang disebabkan oleh kerusakan fusi membran luar mitokondria (Mfn2). Meskipun mutasi Mfn2 pada manusia dikaitkan dengan suatu bentuk neuropati motorik sensorik herediter yang dikenal sebagai Charcot-Marie-Tooth tipe 2A (15), kerusakan Mfn2 secara kondisional pada tikus merupakan metode induksi disfungsi oksidasi fosforilasi (OXPHOS) yang sudah dikenal. Berbagai subtipe neuron (16-19) dan fenotipe neurodegeneratif yang dihasilkan disertai dengan gejala neurologis progresif, seperti gangguan gerakan (18, 19) atau ataksia serebelar (16). Dengan menggunakan kombinasi proteomik kuantitatif tanpa label (LFQ), metabolomik, pencitraan, dan metode virologi, kami menunjukkan bahwa neurodegenerasi progresif sangat menginduksi piruvat karboksilase (PCx) dan faktor-faktor lain yang terlibat dalam arteriosklerosis PN secara in vivo. Untuk memverifikasi relevansi temuan ini, kami secara spesifik menurunkan ekspresi PCx pada PN yang kekurangan Mfn2, dan menemukan bahwa operasi ini memperburuk stres oksidatif dan mempercepat neurodegenerasi, sehingga membuktikan bahwa azoospermia memberikan kemampuan adaptasi metabolisme terhadap kematian sel. Ekspresi MFN2 yang parah dapat sepenuhnya menyelamatkan PN degenerasi terminal dengan defisiensi OXPHOS yang parah, konsumsi DNA mitokondria yang masif, dan jaringan mitokondria yang tampak rusak, yang lebih lanjut menekankan bahwa bentuk neurodegenerasi ini bahkan dapat pulih pada stadium lanjut penyakit sebelum kematian sel.
Untuk memvisualisasikan mitokondria pada PN yang mengalami penghapusan gen Mfn2, kami menggunakan strain tikus yang memungkinkan mitokondria yang bergantung pada Cre untuk menargetkan ekspresi protein fluoresen kuning (YFP) (mtYFP) (20) Cre dan memeriksa morfologi mitokondria secara in vivo. Kami menemukan bahwa penghancuran gen Mfn2 pada PN akan menyebabkan pembelahan bertahap jaringan mitokondria (Gambar S1A), dan perubahan paling awal ditemukan pada usia 3 minggu. Sebaliknya, degenerasi substansial lapisan sel PN, seperti yang dibuktikan oleh hilangnya imunostaining Calbindin, tidak dimulai sampai usia 12 minggu (Gambar 1, A dan B). Ketidaksesuaian waktu antara perubahan paling awal dalam morfologi mitokondria dan awal kematian neuron yang terlihat mendorong kami untuk menyelidiki perubahan metabolisme yang dipicu oleh disfungsi mitokondria sebelum kematian sel. Kami mengembangkan strategi berbasis pengurutan sel yang diaktifkan fluoresensi (FACS) untuk mengisolasi PN yang mengekspresikan YFP (YFP+) (Gambar 1C), dan pada tikus kontrol (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), selanjutnya disebut sebagai CTRL (Gambar S1B). Optimalisasi strategi gating berdasarkan intensitas relatif sinyal YFP memungkinkan kami untuk memurnikan badan YFP+ (YFPhigh) dari PN dari non-PN (YFPneg) (Gambar S1B) atau fragmen akson/dendritik fluoresen (YFPlow; Gambar S1D, kiri), yang dikonfirmasi oleh mikroskop konfokal (Gambar S1D, kanan). Untuk memverifikasi identitas populasi yang diklasifikasikan, kami melakukan proteomik LFQ dan kemudian analisis komponen utama, dan menemukan bahwa ada pemisahan yang jelas antara sel YFPhigh dan YFPneg (Gambar S1C). Sel YFPhigh menunjukkan pengayaan bersih penanda PN yang diketahui (yaitu Calb1, Pcp2, Grid2 dan Itpr3) (21, 22), tetapi tidak ada pengayaan protein yang umumnya diekspresikan dalam neuron atau jenis sel lain (Gambar 1D)). Perbandingan antara sampel dalam sel YFPhigh yang diklasifikasikan yang dikumpulkan dalam percobaan independen menunjukkan koefisien korelasi > 0,9, menunjukkan reproduktivitas yang baik antara replikasi biologis (Gambar S1E). Singkatnya, data ini memvalidasi rencana kami untuk isolasi akut dan spesifik PN yang layak. Karena sistem penggerak L7-cre yang digunakan menginduksi rekombinasi mosaik pada minggu pertama setelah pemberian (23), kami mulai memusnahkan tikus dari CTRL dan kondisional (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) untuk mengumpulkan neuron. Setelah rekombinasi selesai, tikus tersebut disebut Mfn2cKO pada usia 4 minggu. Sebagai titik akhir, kami memilih usia 8 minggu ketika lapisan PN masih utuh meskipun terjadi fragmentasi mitokondria yang jelas (Gambar 1B dan Gambar S1A). Secara total, kami mengkuantifikasi total 3013 protein, di mana sekitar 22% didasarkan pada anotasi MitoCarta 2.0 berdasarkan proteom mitokondria sebagai mitokondria (Gambar 1E) (Gambar 1E) (24). Analisis ekspresi gen diferensial yang dilakukan pada minggu ke-8 menunjukkan bahwa hanya 10,5% dari semua protein yang mengalami perubahan signifikan (Gambar 1F dan Gambar S1F), di mana 195 protein mengalami penurunan regulasi dan 120 protein mengalami peningkatan regulasi (Gambar 1F). Perlu dicatat bahwa "analisis jalur inovatif" dari kumpulan data ini menunjukkan bahwa gen yang diekspresikan secara diferensial sebagian besar termasuk dalam serangkaian jalur metabolisme spesifik yang terbatas (Gambar 1G). Menariknya, meskipun penurunan regulasi jalur yang terkait dengan OXPHOS dan pensinyalan kalsium mengkonfirmasi induksi disfungsi mitokondria pada PN yang kekurangan fusi, kategori lain yang terutama melibatkan metabolisme asam amino justru meningkat secara signifikan, yang sejalan dengan metabolisme yang terjadi pada PN mitokondria yang konsisten dengan disfungsi.
(A) Foto konfokal representatif dari potongan serebelum tikus CTRL dan Mfn2cKO yang menunjukkan hilangnya PN secara progresif (kalbindin, abu-abu); inti diwarnai dengan DAPI. (B) Kuantifikasi dari (A) (analisis varians satu arah, ***P<0,001; n = 4 hingga 6 lingkaran dari tiga tikus). (C) Alur kerja eksperimental. (D) Peta panas distribusi penanda spesifik untuk Purkinje (atas) dan jenis sel lainnya (tengah). (E) Diagram Venn yang menunjukkan jumlah protein mitokondria yang diidentifikasi dalam PN yang diklasifikasikan. (F) Plot gunung berapi dari protein yang diekspresikan secara berbeda dalam neuron Mfn2cKO pada usia 8 minggu (nilai batas signifikansi 1,3). (G) Analisis jalur kreativitas menunjukkan lima jalur peningkatan (merah) dan penurunan (biru) terpenting dalam PN Mfn2cKO yang diklasifikasikan pada usia 8 minggu. Tingkat ekspresi rata-rata dari setiap protein yang terdeteksi ditunjukkan. Peta panas skala abu-abu: nilai P yang disesuaikan. ns, tidak penting.
Data proteomik menunjukkan bahwa ekspresi protein kompleks I, III, dan IV secara bertahap menurun. Kompleks I, III, dan IV semuanya mengandung subunit penting yang dikodekan mtDNA, sedangkan kompleks II, yang hanya dikodekan nukleus, pada dasarnya tidak terpengaruh (Gambar 2A dan Gambar S2A). Konsisten dengan hasil proteomik, imunohistokimia potongan jaringan serebelum menunjukkan bahwa tingkat subunit MTCO1 (subunit 1 sitokrom C oksidase mitokondria) dari kompleks IV pada PN secara bertahap menurun (Gambar 2B). Subunit Mtatp8 yang dikodekan mtDNA berkurang secara signifikan (Gambar S2A), sedangkan tingkat keadaan stabil subunit ATP sintase yang dikodekan nukleus tetap tidak berubah, yang konsisten dengan kompleks subrakitan ATP sintase F1 yang stabil yang diketahui ketika ekspresi mtDNA stabil. Pembentukannya konsisten. Interupsi (7). Evaluasi tingkat mtDNA pada PN Mfn2cKO yang telah disortir menggunakan reaksi berantai polimerase waktu nyata (qPCR) mengkonfirmasi penurunan bertahap jumlah salinan mtDNA. Dibandingkan dengan kelompok kontrol, pada usia 8 minggu, hanya sekitar 20% tingkat mtDNA yang dipertahankan (Gambar 2C). Konsisten dengan hasil ini, pewarnaan mikroskop konfokal pada PN Mfn2cKO digunakan untuk mendeteksi DNA, menunjukkan konsumsi nukleotida mitokondria yang bergantung pada waktu (Gambar 2D). Kami menemukan bahwa hanya beberapa kandidat yang terlibat dalam degradasi protein mitokondria dan respons stres yang mengalami peningkatan regulasi, termasuk Lonp1, Afg3l2 dan Clpx, serta faktor perakitan kompleks OXPHOS. Tidak ada perubahan signifikan pada tingkat protein yang terlibat dalam apoptosis yang terdeteksi (Gambar S2B). Demikian pula, kami menemukan bahwa saluran mitokondria dan retikulum endoplasma yang terlibat dalam transpor kalsium hanya mengalami perubahan kecil (Gambar S2C). Selain itu, evaluasi protein terkait autofagi tidak menemukan perubahan signifikan, yang konsisten dengan induksi autofagosom yang terlihat secara in vivo melalui imunohistokimia dan mikroskop elektron (Gambar S3). Namun, disfungsi OXPHOS progresif pada PN disertai dengan perubahan ultrastruktural mitokondria yang jelas. Gugus mitokondria dapat dilihat di badan sel dan pohon dendritik PN Mfn2cKO berusia 5 dan 8 minggu, dan struktur membran bagian dalam telah mengalami perubahan mendalam (Gambar S4, A dan B). Konsisten dengan perubahan ultrastruktural ini dan penurunan mtDNA yang signifikan, analisis irisan serebelum akut dengan tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) menunjukkan bahwa potensial membran mitokondria pada PN Mfn2cKO menurun secara signifikan (Gambar S4C).
(A) Analisis perubahan ekspresi kompleks OXPHOS seiring waktu. Hanya pertimbangkan protein dengan P<0,05 pada 8 minggu (ANOVA dua arah). Garis putus-putus: Tidak ada penyesuaian dibandingkan dengan CTRL. (B) Kiri: Contoh potongan serebelum yang diberi label dengan antibodi anti-MTCO1 (skala bar, 20 μm). Area yang ditempati oleh badan sel Purkinje ditutupi dengan warna kuning. Kanan: Kuantifikasi kadar MTCO1 (analisis varians satu arah; n = 7 hingga 20 sel yang dianalisis dari tiga tikus). (C) Analisis qPCR jumlah salinan mtDNA pada PN yang telah disortir (analisis varians satu arah; n = 3 hingga 7 tikus). (D) Kiri: Contoh potongan serebelum yang diberi label dengan antibodi anti-DNA (skala bar, 20 μm). Area yang ditempati oleh badan sel Purkinje ditutupi dengan warna kuning. Kanan: Kuantifikasi lesi mtDNA (analisis varians satu arah; n = 5 hingga 9 sel dari tiga tikus). (E) Contoh penampang serebelum akut yang menunjukkan sel Purkinje mitoYFP+ ​​(panah) dalam perekaman patch clamp sel utuh. (F) Kuantifikasi kurva IV. (G) Rekaman representatif injeksi arus depolarisasi pada sel Purkinje CTRL dan Mfn2cKO. Jejak atas: Pulsa pertama yang memicu AP. Jejak bawah: Frekuensi AP maksimum. (H) Kuantifikasi input spontan postsynaptic (sPSP). Jejak rekaman representatif dan rasio zoom-nya ditunjukkan pada (I). Analisis varians satu arah menganalisis n = 5 hingga 20 sel dari tiga tikus. Data dinyatakan sebagai mean±SEM; *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001. (J) Jejak representatif AP spontan yang direkam menggunakan mode patch clamp berlubang. Jejak atas: Frekuensi AP maksimum. Jejak bawah: perbesaran dari satu AP. (K) Kuantifikasi frekuensi AP rata-rata dan maksimum menurut (J). Uji Mann-Whitney; n = 5 sel dianalisis dari empat tikus. Data dinyatakan sebagai mean±SEM; tidak penting.
Kerusakan OXPHOS yang jelas terdeteksi pada PN Mfn2cKO berusia 8 minggu, menunjukkan bahwa fungsi fisiologis neuron sangat abnormal. Oleh karena itu, kami menganalisis karakteristik listrik pasif neuron yang kekurangan OXPHOS pada usia 4 hingga 5 minggu dan 7 hingga 8 minggu dengan melakukan perekaman patch clamp sel utuh pada irisan serebelum akut (Gambar 2E). Secara tak terduga, potensial membran istirahat rata-rata dan resistansi input neuron Mfn2cKO mirip dengan kontrol, meskipun ada perbedaan halus antar sel (Tabel 1). Demikian pula, pada usia 4 hingga 5 minggu, tidak ditemukan perubahan signifikan dalam hubungan arus-tegangan (kurva IV) (Gambar 2F). Namun, tidak ada neuron Mfn2cKO berusia 7 hingga 8 minggu yang bertahan hidup pada regimen IV (langkah hiperpolarisasi), menunjukkan bahwa ada sensitivitas yang jelas terhadap potensial hiperpolarisasi pada tahap akhir ini. Sebaliknya, pada neuron Mfn2cKO, arus depolarisasi yang menyebabkan pelepasan potensial aksi (AP) berulang dapat ditoleransi dengan baik, menunjukkan bahwa pola pelepasan keseluruhannya tidak berbeda secara signifikan dari neuron kontrol berusia 8 minggu (Tabel 1 dan Gambar 2G). Demikian pula, frekuensi dan amplitudo arus postsynaptic spontan (sPSC) sebanding dengan kelompok kontrol, dan frekuensi kejadian meningkat dari 4 minggu ke 5 minggu ke 7 minggu ke 8 minggu dengan peningkatan yang serupa (Gambar 2, H dan I). Periode pematangan sinaptik pada PN (25). Hasil serupa diperoleh setelah patch PN berlubang. Konfigurasi ini mencegah kemungkinan kompensasi defek ATP seluler, seperti yang mungkin terjadi pada perekaman patch clamp sel utuh. Secara khusus, potensial membran istirahat dan frekuensi penembakan spontan neuron Mfn2cKO tidak terpengaruh (Gambar 2, J dan K). Singkatnya, hasil ini menunjukkan bahwa PN dengan disfungsi OXPHOS yang jelas dapat mengatasi pola pelepasan frekuensi tinggi dengan baik, yang mengindikasikan adanya mekanisme kompensasi yang memungkinkan mereka untuk mempertahankan respons elektrofisiologis yang mendekati normal.
Data dinyatakan sebagai mean ± SEM (analisis varians satu arah, uji perbandingan berganda Holm-Sidak; *P<0,05). Nomor unit ditunjukkan dengan tanda kurung.
Kami berupaya menyelidiki apakah ada kategori dalam dataset proteomik (Gambar 1G) yang mencakup jalur yang dapat melawan defisiensi OXPHOS yang parah, sehingga menjelaskan mengapa PN yang terpengaruh dapat mempertahankan elektrofisiologi yang hampir normal (Gambar 2, E hingga K). Analisis proteomik menunjukkan bahwa enzim yang terlibat dalam katabolisme asam amino rantai bercabang (BCAA) secara signifikan meningkat (Gambar 3A dan Gambar S5A), dan produk akhir asetil-CoA (CoA) atau suksinil CoA dapat melengkapi trikarboksilat dalam siklus asam amino (TCA). Kami menemukan bahwa kandungan transaminase BCAA 1 (BCAT1) dan BCAT2 keduanya meningkat. Mereka mengkatalisis langkah pertama katabolisme BCAA dengan menghasilkan glutamat dari α-ketoglutarat (26). Semua subunit yang membentuk kompleks branched chain keto acid dehydrogenase (BCKD) mengalami peningkatan regulasi (kompleks ini mengkatalisis dekarboksilasi selanjutnya dan ireversibel dari kerangka karbon BCAA yang dihasilkan) (Gambar 3A dan Gambar S5A). Namun, tidak ditemukan perubahan yang jelas pada BCAA itu sendiri pada PN yang telah dipilah, yang mungkin disebabkan oleh peningkatan penyerapan seluler asam amino esensial ini atau penggunaan sumber lain (glukosa atau asam laktat) untuk melengkapi siklus TCA (Gambar S5B). PN yang kekurangan OXPHOS juga menunjukkan peningkatan aktivitas dekomposisi dan transaminasi glutamin pada usia 8 minggu, yang dapat tercermin dari peningkatan regulasi enzim mitokondria glutaminase (GLS) dan glutamin piruvat transaminase 2 (GPT2) (Gambar 3, A dan C). Perlu dicatat bahwa peningkatan regulasi GLS terbatas pada isoform glutaminase C (GLS-GAC) yang telah mengalami penyambungan (perubahan Mfn2cKO/CTRL sekitar 4,5 kali lipat, P = 0,05), dan peningkatan regulasi spesifiknya pada jaringan kanker dapat mendukung bioenergi mitokondria. (27).
(A) Peta panas menunjukkan perubahan lipatan pada tingkat protein untuk rute yang ditentukan pada 8 minggu. (B) Contoh irisan serebelum yang diberi label dengan antibodi anti-PCx (skala bar, 20 μm). Panah kuning menunjuk ke badan sel Purkinje. (C) Analisis ekspresi protein berdasarkan waktu yang diidentifikasi sebagai kandidat penting untuk aterosklerosis (uji t berganda, *FDR <5%; n = 3-5 tikus). (D) Atas: Diagram skematis yang menunjukkan berbagai cara masuknya karbon berlabel yang terkandung dalam pelacak [1-13C]piruvat (yaitu, melalui PDH atau rute trans-arterial). Bawah: Bagan biola menunjukkan persentase karbon berlabel tunggal (M1) yang diubah menjadi asam aspartat, asam sitrat, dan asam malat setelah memberi label irisan serebelum akut dengan [1-13C]piruvat (uji t berpasangan; ** P <0,01). (E) Analisis riwayat waktu komprehensif dari jalur yang ditunjukkan. Hanya pertimbangkan protein dengan P<0,05 pada 8 minggu. Garis putus-putus: tidak ada nilai penyesuaian (analisis varians dua arah; * P <0,05; *** P <0,001). Data dinyatakan sebagai mean±SEM.
Dalam analisis kami, katabolisme BCAA telah menjadi salah satu jalur peningkatan regulasi utama. Fakta ini sangat menunjukkan bahwa volume ventilasi yang memasuki siklus TCA dapat berubah pada PN yang kekurangan OXPHOS. Ini mungkin mewakili bentuk utama penataan ulang metabolisme neuron, yang dapat berdampak langsung pada fisiologi dan kelangsungan hidup neuron selama pemeliharaan disfungsi OXPHOS yang parah. Konsisten dengan hipotesis ini, kami menemukan bahwa enzim anti-aterosklerotik utama PCx mengalami peningkatan regulasi (perubahan Mfn2cKO/CTRL sekitar 1,5 kali; Gambar 3A), yang mengkatalisis konversi piruvat menjadi oksaloasetat (28), yang diyakini ekspresinya di jaringan otak terbatas pada astrosit (29, 30). Sesuai dengan hasil proteomik, mikroskopi konfokal menunjukkan bahwa ekspresi PCx secara spesifik dan signifikan meningkat pada PN yang kekurangan OXPHOS, sementara reaktivitas PCx sebagian besar terbatas pada sel glial Bergmann yang berdekatan pada kontrol (Gambar 3B). Untuk menguji secara fungsional peningkatan PCx yang diamati, kami mengobati irisan serebelum akut dengan pelacak [1-13C]piruvat. Ketika piruvat dioksidasi oleh piruvat dehidrogenase (PDH), label isotopnya menghilang, tetapi dimasukkan ke dalam intermediet siklus TCA ketika piruvat dimetabolisme oleh reaksi vaskular (Gambar 3D). Sebagai dukungan terhadap data proteomik kami, kami mengamati sejumlah besar penanda dari pelacak ini dalam asam aspartat dari irisan Mfn2cKO, sementara asam sitrat dan asam malat juga menunjukkan tren sedang, meskipun tidak signifikan (Gambar 3D).
Pada neuron dopamin tikus MitoPark dengan disfungsi mitokondria yang disebabkan oleh neuron dopamin yang secara spesifik menghancurkan gen faktor transkripsi mitokondria A (Tfam) (Gambar S6B), ekspresi PCx juga meningkat secara signifikan (31), menunjukkan bahwa terjadinya penyakit arteriosklerosis asam aseton diatur selama disfungsi OXPHOS neuronal dalam tubuh. Perlu dicatat bahwa telah ditemukan bahwa enzim unik (32-34) yang mungkin diekspresikan dalam neuron yang mungkin terkait dengan arteriosklerosis meningkat secara signifikan pada PN yang kekurangan OXPHOS, seperti propionil-CoA karboksilase (PCC-A), Malonil-CoA yang mengubah propionil-CoA menjadi suksinil-CoA dan enzim malat mitokondria 3 (ME3), yang peran utamanya adalah memulihkan piruvat dari malat (Gambar 3, A dan C) (33, 35). Selain itu, kami menemukan peningkatan signifikan pada enzim Pdk3, yang memfosforilasi dan dengan demikian menonaktifkan PDH (36), sementara tidak ada perubahan yang terdeteksi pada enzim Pdp1 yang mengaktifkan PDH atau kompleks enzim PDH itu sendiri (Gambar 3A). Secara konsisten, pada PN Mern2cKO, fosforilasi subunit α1 (PDHE1α) dari komponen piruvat dehidrogenase E1 dari kompleks PDH pada Ser293 (yang diketahui menghambat aktivitas enzim PDH) meningkat (Gambar S6C). Piruvat tidak memiliki akses vaskular.
Akhirnya, kami menemukan bahwa jalur super biosintesis serin dan glisin, siklus folat mitokondria (1C) terkait, dan biosintesis prolin (Gambar 1G dan Gambar S5C) semuanya mengalami peningkatan regulasi yang signifikan, menurut laporan, selama proses aktivasi. Jaringan di sekitarnya diaktifkan dengan disfungsi mitokondria (5-7). Analisis konfokal yang mendukung data proteomik ini menunjukkan bahwa pada PN dengan OXPHOS yang hilang, irisan serebelum tikus berusia 8 minggu mengalami respons imun yang signifikan (Gambar S5D). Pada irisan serebelum akut yang diinkubasi dengan 13 CU-glukosa, percobaan penelusuran metabolisme lebih lanjut mengkonfirmasi peningkatan regulasi biosintesis serin dan prolin, menunjukkan bahwa fluks isoform karbon ke dalam serin dan prolin meningkat (Gambar S5E). Karena reaksi yang dipromosikan oleh GLS dan GPT2 bertanggung jawab atas sintesis glutamat dari glutamin dan transaminasi antara glutamat dan α-ketoglutarat, peningkatan regulasinya menunjukkan bahwa neuron yang kekurangan OXPHOS memiliki peningkatan kebutuhan akan glutamat. Hal ini mungkin bertujuan untuk mempertahankan peningkatan biosintesis prolin (Gambar S5C). Berbeda dengan perubahan ini, analisis proteomik astrosit serebelum dari tikus Mfn2cKO spesifik PN menunjukkan bahwa jalur-jalur ini (termasuk semua antiperoksidase) tidak mengalami perubahan ekspresi yang signifikan, sehingga menunjukkan bahwa pengalihan metabolisme ini selektif terhadap PN yang terdegradasi (Gambar S6, D hingga G).
Singkatnya, analisis ini mengungkapkan pola aktivasi temporal yang sangat berbeda dari jalur metabolisme spesifik pada PN. Meskipun fungsi mitokondria neuron yang abnormal dapat menyebabkan aterosklerosis dini dan remodeling 1C (Gambar 3E dan Gambar S5C), dan bahkan perubahan yang dapat diprediksi dalam ekspresi kompleks I dan IV, perubahan dalam sintesis de novo serin hanya terlihat jelas pada tahap akhir disfungsi OXPHOS (Gambar 3E dan Gambar S5C). Temuan ini mendefinisikan proses berurutan di mana respons mitokondria (siklus 1C) dan sitoplasma (biosintesis serin) yang diinduksi stres bekerja secara sinergis dengan peningkatan aterosklerosis dalam siklus TCA untuk membentuk kembali metabolisme neuron.
Neuron PN yang kekurangan OXPHOS berusia 8 minggu dapat mempertahankan aktivitas eksitasi frekuensi tinggi dan mengalami rekoneksi metabolik yang signifikan untuk mengkompensasi disfungsi mitokondria. Penemuan ini memunculkan kemungkinan menarik bahwa bahkan pada saat ini, sel-sel ini mungkin juga menerima intervensi terapeutik untuk menunda atau mencegah neurodegenerasi. Kami menyelesaikan kemungkinan ini melalui dua intervensi independen. Dalam metode pertama, kami merancang vektor virus adeno-associated (AAV) yang bergantung pada Cre sehingga MFN2 dapat diekspresikan secara selektif pada neuron PN yang kekurangan OXPHOS secara in vivo (Gambar S7A). AAV yang mengkode MFN2 dan gen reporter fluoresen mCherry (Mfn2-AAV) diverifikasi dalam kultur neuron primer secara in vitro, yang menyebabkan MFN2 diekspresikan secara bergantung pada Cre dan menyelamatkan morfologi mitokondria, sehingga mencegah neuromutasi pada neuron Mfn2cKO (Gambar S7, B, D dan E). Selanjutnya, kami melakukan eksperimen in vivo untuk memberikan Mfn2-AAV berusia 8 minggu secara stereotaktik ke korteks serebelum tikus Mfn2cKO dan tikus kontrol, dan menganalisis tikus berusia 12 minggu (Gambar 4A). Tikus Mfn2cKO yang diobati mati (Gambar 1, A dan B) (16). Transduksi virus in vivo menghasilkan ekspresi selektif PN di beberapa lingkaran serebelum (Gambar S7, G dan H). Injeksi AAV kontrol yang hanya mengekspresikan mCherry (Ctrl-AAV) tidak memiliki efek signifikan pada tingkat neurodegenerasi pada hewan Mfn2cKO. Sebaliknya, analisis Mfn2cKO yang ditransduksi dengan Mfn2-AAV menunjukkan efek perlindungan yang signifikan dari lapisan sel PN (Gambar 4, B dan C). Secara khusus, kepadatan neuron tampaknya hampir tidak dapat dibedakan dari hewan kontrol (Gambar 4, B dan C, dan Gambar S7, H dan I). Ekspresi MFN1 tetapi bukan MFN2 sama efektifnya dalam mencegah kematian neuron (Gambar 4C dan Gambar S7, C dan F), yang menunjukkan bahwa ekspresi MFN1 ektopik dapat secara efektif melengkapi kekurangan MFN2. Analisis lebih lanjut pada tingkat PN tunggal menunjukkan bahwa Mfn2-AAV sebagian besar menyelamatkan ultrastruktur mitokondria, menormalkan kadar mtDNA, dan membalikkan ekspresi tinggi penanda anti-angiogenesis PCx (Gambar 4, C hingga E). Inspeksi visual pada tikus Mfn2cKO yang diselamatkan dalam keadaan istirahat menunjukkan bahwa postur dan gejala motorik mereka (gerakan S1 hingga S3) membaik. Kesimpulannya, percobaan ini menunjukkan bahwa pengenalan kembali MFN2 yang tertunda ke dalam PN yang sangat kekurangan OXPHOS cukup untuk membalikkan konsumsi mtDNA dan menginduksi aterosklerosis, sehingga mencegah degenerasi akson dan kematian neuron in vivo.
(A) Skema yang menunjukkan jadwal eksperimental untuk penyuntikan AAV yang mengkode MFN2 ketika jalur metabolisme yang ditunjukkan diaktifkan. (B) Gambar konfokal representatif dari irisan serebelum berusia 12 minggu yang ditransduksi pada usia 8 minggu pada tikus Mfn2cKO dan diberi label dengan antibodi anti-Calbindin. Kanan: Skala serat akson. Skala pembesaran akson adalah 450 dan 75 μm. (C) Kiri: Kuantifikasi kepadatan sel Purkinje dalam loop transduksi AAV (AAV+) (analisis varians satu arah; n = 3 tikus). Kanan: Analisis fokus mtDNA pada PN yang ditransduksi pada minggu ke-12 (uji t tidak berpasangan; n = 6 sel dari tiga tikus). * P <0,05; ** P <0,01. (D) Mikrograf elektron transmisi representatif dari PN irisan serebelum Mfn2cKO yang ditransduksi dengan vektor virus yang ditunjukkan. Masker berwarna merah muda menggambarkan area yang ditempati oleh dendrit, dan persegi bertitik kuning menggambarkan perbesaran yang diberikan di sebelah kanan; n mewakili nukleus. Skala bar, 1μm. (E) menunjukkan contoh pewarnaan PCx pada PN yang ditransduksi pada usia 12 minggu. Skala bar, 20μm. OE, ekspresi berlebih; ​​FC, perubahan lipatan.
Terakhir, kami menyelidiki pentingnya kelangsungan hidup sel yang diinduksi peroksidase pada PN yang mengalami disfungsi OXPHOS. Kami membuat AAV-shRNA (short hairpin RNA) yang mengkode mCherry yang secara spesifik menargetkan mRNA PCx tikus (AAV-shPCx), dan menyuntikkan virus atau kontrol acaknya (AAV-scr) ke dalam serebelum tikus Mfn2cKO. Penyuntikan dilakukan pada minggu keempat usia (Gambar 5A) untuk mencapai penekanan PCx yang efektif selama periode ketika ekspresi PCx meningkat (Gambar 3C) dan lapisan sel PN masih utuh (Gambar 1A). Perlu dicatat bahwa penekanan PCx (Gambar S8A) menyebabkan percepatan kematian PN yang signifikan, yang terbatas pada cincin yang terinfeksi (Gambar 5, B dan C). Untuk memahami mekanisme efek metabolik yang diinduksi oleh peningkatan regulasi PCx, kami mempelajari status redoks PN setelah PCx ​​knockdown dan biosensor optik yang dimediasi AAV Grx1-roGFP2 diekspresikan secara bersamaan (Gambar S8, B hingga D) untuk mengevaluasi perubahan relatif potensial redoks peptida glutathione (38). Kemudian, kami melakukan mikroskopi pencitraan masa hidup fluoresensi dua foton (FLIM) pada irisan otak akut dari tikus Mfn2cKO berusia 7 minggu atau tikus kontrol untuk mendeteksi potensi perubahan status redoks sitoplasma setelah memverifikasi kondisi FLIM (Gambar S8, E hingga G). Analisis menunjukkan peningkatan signifikan dalam keadaan oksidasi PN Mfn2cKO tunggal yang kekurangan ekspresi PCx, yang berbeda dari neuron kontrol atau PN Mfn2cKO yang hanya mengekspresikan shRNA acak (Gambar 5, D dan E). Ketika ekspresi PCx diturunkan, persentase PN Mfn2cKO yang menunjukkan keadaan teroksidasi tinggi meningkat lebih dari tiga kali lipat (Gambar 5E), menunjukkan bahwa peningkatan ekspresi PCx mempertahankan kapasitas redoks neuron yang mengalami degenerasi.
(A) Skema yang menunjukkan jadwal eksperimen untuk penyuntikan AAV yang mengkode shPCx ketika jalur metabolisme yang ditunjukkan diaktifkan. (B) Foto konfokal representatif dari potongan serebelum berusia 8 minggu pada tikus Mfn2cKO yang ditransduksi dan diberi label dengan antibodi anti-kalsineurin pada usia 4 minggu. Skala bar, 450μm. (C) Kuantifikasi kepadatan sel Purkinje dalam loop yang ditransduksi AAV (analisis varians satu arah; n = 3 hingga 4 tikus). Data dinyatakan sebagai mean±SEM; ***P<0,001. (D) Gambar FLIM representatif menunjukkan rentang hidup rata-rata PN berusia 7 minggu yang mengekspresikan sensor redoks glutathione Grx1-roGFP2 di bawah kondisi eksperimental yang ditentukan. Rasio LUT (tabel pencarian): interval waktu bertahan hidup (dalam pikodetik). Skala bar, 25μm. (E) Histogram menunjukkan distribusi nilai masa hidup Grx1-roGFP2 dari (D) (n=158 hingga 368 sel pada dua tikus di bawah setiap kondisi). Diagram lingkaran di atas setiap histogram: menunjukkan jumlah sel dengan nilai masa hidup yang secara signifikan lebih lama (merah, teroksidasi) atau lebih pendek (biru, tereduksi), yang melebihi 1 SD dari nilai masa hidup rata-rata pada CTRL-AAV-scr. (F) Model yang diusulkan menunjukkan efek perlindungan dari peningkatan regulasi PCx neuronal.
Secara keseluruhan, data yang kami berikan di sini menunjukkan bahwa ekspresi ulang MFN2 dapat sepenuhnya menyelamatkan PN stadium lanjut dengan defisiensi OXPHOS yang parah, penipisan mtDNA yang parah, dan morfologi seperti ista yang sangat abnormal, sehingga memberikan kemajuan berkelanjutan bahkan pada penyakit stadium lanjut. Neurodegenerasi memberikan bukti reversibel dari tahap sebelum kematian sel. Tingkat fleksibilitas metabolisme ini semakin ditekankan oleh kemampuan neuron untuk menginduksi aterosklerosis (penataan ulang siklus TCA), yang menghambat ekspresi PCx pada PN yang kekurangan OXPHOS dan meningkatkan kematian sel, sehingga berperan sebagai pelindung (Gambar 5F).
Dalam penelitian ini, kami memberikan bukti bahwa respons PN terhadap disfungsi OXPHOS adalah secara bertahap mengarah pada aterosklerosis siklus TCA melalui jalur aktivasi diferensial yang diaktifkan oleh program metabolisme. Kami mengkonfirmasi analisis proteomik dengan banyak metode pelengkap dan mengungkapkan bahwa ketika dihadapkan pada disfungsi mitokondria yang parah, neuron memiliki bentuk elastisitas metabolisme yang sebelumnya tidak diketahui. Yang mengejutkan kami, seluruh proses penataan ulang tidak selalu menandai keadaan metabolisme terminal yang menyertai neurodegenerasi secara bertahap dan ireversibel, tetapi data kami menunjukkan bahwa hal itu dapat membentuk mekanisme kompensasi fungsional neuron pemeliharaan bahkan pada tahap sebelum kematian sel. Temuan ini menunjukkan bahwa neuron memiliki tingkat plastisitas metabolisme yang cukup besar di dalam tubuh. Fakta ini membuktikan bahwa pengenalan kembali MFN2 di kemudian hari dapat membalikkan ekspresi penanda metabolisme utama dan mencegah degenerasi PN. Sebaliknya, hal itu menghambat aterosklerosis dan mempercepat degenerasi saraf.
Salah satu temuan paling menarik dalam penelitian kami adalah bahwa PN yang kekurangan OXPHOS dapat memodifikasi metabolisme siklus TCA dengan meningkatkan enzim yang secara khusus merangsang arteriosklerosis. Penataan ulang metabolisme merupakan ciri umum sel kanker, beberapa di antaranya bergantung pada glutamin untuk melengkapi perantara siklus TCA untuk menghasilkan ekuivalen pereduksi, yang menggerakkan rantai pernapasan dan mempertahankan produksi prekursor biosintesis lipid dan nukleotida (39, 40). Sebuah studi baru-baru ini menunjukkan bahwa pada jaringan perifer yang mengalami disfungsi OXPHOS, penyambungan kembali metabolisme glutamin/glutamat juga merupakan ciri yang menonjol (5, 41), di mana arah masuknya glutamin ke dalam siklus TCA bergantung pada tingkat keparahan cedera OXPHOS (41). Namun, masih kurang bukti yang jelas tentang kesamaan plastisitas metabolisme neuronal di dalam tubuh dan kemungkinan relevansinya dalam konteks penyakit. Dalam sebuah studi in vitro baru-baru ini, neuron kortikal primer terbukti memobilisasi kumpulan glutamat untuk neurotransmisi, sehingga mendorong metabolisme oksidatif dan aterosklerosis dalam kondisi stres metabolik (42). Perlu dicatat bahwa di bawah penghambatan farmakologis enzim siklus TCA suksinat dehidrogenase, karboksilasi piruvat diyakini mempertahankan sintesis oksaloasetat pada neuron granula serebelum yang dikultur (34). Namun, relevansi fisiologis mekanisme ini terhadap jaringan otak (di mana aterosklerosis diyakini terutama terbatas pada astrosit) masih memiliki signifikansi fisiologis yang penting (43). Dalam hal ini, data kami menunjukkan bahwa PN yang rusak oleh OXPHOS dalam tubuh dapat dialihkan ke degradasi BCAA dan karboksilasi piruvat, yang merupakan dua sumber utama suplementasi intermediet kumpulan TCA. Meskipun kontribusi katabolisme BCAA terhadap metabolisme energi neuron telah diusulkan, selain peran glutamat dan GABA untuk neurotransmisi (44), masih belum ada bukti untuk mekanisme ini secara in vivo. Oleh karena itu, mudah untuk berspekulasi bahwa PN yang disfungsional dapat secara otomatis mengkompensasi konsumsi intermediet TCA yang didorong oleh proses asimilasi dengan meningkatkan aterosklerosis. Secara khusus, peningkatan PCx mungkin diperlukan untuk mempertahankan peningkatan permintaan asam aspartat, yang disarankan pada sel yang berproliferasi dengan disfungsi mitokondria (45). Namun, analisis metabolomik kami tidak mengungkapkan perubahan signifikan pada tingkat keadaan stabil asam aspartat di PN Mfn2cKO (Gambar S6A), yang mungkin mencerminkan pemanfaatan metabolik asam aspartat yang berbeda antara sel yang berproliferasi dan neuron pasca-mitotik. Meskipun mekanisme pasti peningkatan PCx pada neuron disfungsional in vivo masih perlu dikarakterisasi, kami menunjukkan bahwa respons prematur ini memainkan peran penting dalam menjaga keadaan redoks neuron, yang ditunjukkan dalam eksperimen FLIM pada irisan serebelum. Secara khusus, mencegah PN meningkatkan PCx dapat menyebabkan keadaan yang lebih teroksidasi dan mempercepat kematian sel. Aktivasi degradasi BCAA dan karboksilasi piruvat bukanlah cara untuk mengkarakterisasi jaringan perifer disfungsi mitokondria (7). Oleh karena itu, tampaknya hal tersebut merupakan fitur prioritas neuron yang kekurangan OXPHOS, meskipun bukan satu-satunya fitur, yang penting untuk neurodegenerasi.
Penyakit serebelum merupakan jenis penyakit neurodegeneratif heterogen yang biasanya bermanifestasi sebagai ataksia dan sering merusak neuron parasimpatik (PN) (46). Populasi neuron ini sangat rentan terhadap disfungsi mitokondria karena degenerasi selektifnya pada tikus cukup untuk mereproduksi banyak gejala motorik yang menjadi ciri ataksia spinoserebelum manusia (16, 47, 48). Menurut laporan, model tikus transgenik dengan gen mutan dikaitkan dengan ataksia spinoserebelum manusia dan memiliki disfungsi mitokondria (49, 50), yang menekankan pentingnya mempelajari konsekuensi defisiensi OXPHOS pada PNPH. Oleh karena itu, sangat cocok untuk secara efektif mengisolasi dan mempelajari populasi neuron unik ini. Namun, mengingat bahwa PN sangat sensitif terhadap tekanan dan hanya menyumbang sebagian kecil dari seluruh populasi sel serebelum, untuk banyak studi berbasis omik, pemisahan selektifnya sebagai sel utuh masih merupakan aspek yang menantang. Meskipun hampir mustahil untuk mencapai ketiadaan kontaminasi absolut dari jenis sel lain (terutama jaringan dewasa), kami menggabungkan langkah disosiasi yang efektif dengan FACS untuk mendapatkan jumlah neuron yang cukup untuk analisis proteomik selanjutnya, dan memiliki cakupan protein yang cukup tinggi (sekitar 3000 protein) dibandingkan dengan kumpulan data yang ada dari seluruh serebelum (51). Dengan menjaga viabilitas seluruh sel, metode yang kami berikan di sini memungkinkan kami tidak hanya untuk memeriksa perubahan jalur metabolisme di mitokondria, tetapi juga untuk memeriksa perubahan pada rekan-rekan sitoplasmanya, yang melengkapi penggunaan penanda membran mitokondria untuk memperkaya jenis sel. Metode baru untuk jumlah mitokondria dalam jaringan kompleks (52, 53). Metode yang kami jelaskan tidak hanya terkait dengan studi sel Purkinje, tetapi dapat dengan mudah diterapkan pada semua jenis sel untuk mengatasi perubahan metabolisme pada otak yang sakit, termasuk model disfungsi mitokondria lainnya.
Akhirnya, kami telah mengidentifikasi jendela terapeutik selama proses penataan ulang metabolisme ini yang dapat sepenuhnya membalikkan tanda-tanda utama stres seluler dan mencegah degenerasi neuron. Oleh karena itu, pemahaman tentang implikasi fungsional dari penataan ulang yang dijelaskan di sini dapat memberikan wawasan mendasar tentang kemungkinan pengobatan untuk mempertahankan kelangsungan hidup neuron selama disfungsi mitokondria. Penelitian di masa mendatang yang bertujuan untuk menganalisis perubahan metabolisme energi pada jenis sel otak lainnya diperlukan untuk sepenuhnya mengungkap penerapan prinsip ini pada penyakit neurologis lainnya.
Tikus MitoPark telah dijelaskan sebelumnya (31). Tikus C57BL/6N dengan loxP yang mengapit gen Mfn2 telah dijelaskan sebelumnya (18) dan disilangkan dengan tikus L7-Cre (23). Keturunan heterozigot ganda yang dihasilkan kemudian disilangkan dengan tikus homozigot Mfn2loxP/Mfn2loxP untuk menghasilkan knockout gen spesifik Purkinje untuk Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). Dalam subset perkawinan, alel Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP (stop-mtYFP) diperkenalkan melalui persilangan tambahan (20). Semua prosedur hewan dilakukan sesuai dengan pedoman Eropa, nasional, dan institusional serta disetujui oleh LandesamtfürNatur dari Umwelt and Verbraucherschutz, Rhine Utara-Westphalia, Jerman. Pekerjaan hewan juga mengikuti panduan dari Federasi Asosiasi Ilmu Hewan Laboratorium Eropa.
Setelah membius ibu hamil yang mengalami dislokasi serviks, embrio tikus diisolasi (E13). Korteks dipisahkan dalam Larutan Garam Seimbang Hanks (HBSS) yang ditambah dengan 10 mM Hepes dan dikultur dalam Medium Eagle yang Dimodifikasi Dulbecco yang mengandung papain (20 U/ml) dan sistein (1 μg/ml). Jaringan diinkubasi dalam DMEM dan dipisahkan dengan pencernaan enzimatik. Sel diinkubasi pada suhu 37°C selama 20 menit, kemudian digiling secara mekanis dalam DMEM yang ditambah dengan 10% serum janin sapi. Sel ditanam pada kaca penutup yang dilapisi polilisin dengan kepadatan 2×10⁶ per cawan kultur 6 cm atau dengan kepadatan 0,5×10⁵ sel/cm² untuk analisis pencitraan. Setelah 4 jam, medium diganti dengan medium bebas serum Neurobasal yang mengandung 1% suplemen B27 dan 0,5 mM GlutaMax. Neuron kemudian dipelihara pada suhu 37°C dan 5% CO2 selama percobaan, dan diberi makan sekali seminggu. Untuk menginduksi rekombinasi in vitro, 3μl (cawan kultur 24 sumur) atau 0,5μl (pelat 24 sumur) vektor virus AAV9 berikut digunakan untuk mengobati neuron pada hari kedua in vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP.WPRE.bGH (Addgene, nomor katalog 105530-AAV9) dan AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, nomor katalog 105545-AAV9).
DNA komplementer Mfn1 dan Mfn2 tikus (diperoleh dari plasmid Addgene #23212 dan #23213, masing-masing) ditandai dengan sekuens V5 (GKPIPNPLLGLDST) di ujung C, dan disambung dengan mCherry secara berurutan melalui sekuens T2A. Grx1-roGFP2 adalah hadiah dari Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). Dengan mengganti kaset tdTomato menggunakan metode kloning konvensional, kaset tersebut disubklon ke dalam kerangka pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (nomor referensi Addgene 28306) untuk menghasilkan vektor pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5, dan pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2. Strategi serupa digunakan untuk menghasilkan vektor kontrol pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Untuk menghasilkan konstruksi AAV-shPCx, diperlukan vektor plasmid AAV (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]), yang mengandung sekuens DNA yang mengkode shRNA yang menargetkan PCx tikus (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′) di bawah kendali promotor U6, sedangkan mCherry digunakan di bawah kendali promotor CMV. Produksi vektor AAV tambahan dilakukan sesuai dengan instruksi pabrikan (Cell Biolabs). Singkatnya, gunakan plasmid transfer yang membawa gen pengkode mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) secara sementara. Transfeksi sel 293AAV-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) atau Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2), serta protein kapsid AAV1 dan protein aksesori. Plasmid pengemasan digunakan dengan metode kalsium fosfat. Supernatan virus mentah diperoleh dengan siklus pembekuan-pencairan dalam penangas es kering/etanol dan sel dilisis dalam larutan garam fosfat (PBS). Vektor AAV dimurnikan dengan ultrasentrifugasi gradien iodixanol diskontinu (24 jam pada 32.000 rpm dan 4°C) dan dikonsentrasikan menggunakan filter sentrifugal Amicon ultra-15. Titer genom AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2,9×1013 salinan genom (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX diukur dengan PCR kuantitatif waktu nyata (qPCR) -MFN1-V5 (1,9×1013 GC/ml) dan AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9×1012 GC/ml).
Neuron primer dikerok dalam larutan PBS 1x dingin, disentrifugasi, dan kemudian dihomogenkan dalam buffer lisis 0,5% Triton X-100 / 0,5% natrium deoksikolat/PBS yang mengandung inhibitor fosfatase dan protease (Roche). Kuantifikasi protein dilakukan dengan menggunakan uji asam bicinchoninic (Thermo Fisher Scientific). Protein kemudian dipisahkan dengan elektroforesis gel SDS-poliakrilamida, dan kemudian di-blot ke membran polivinilidena fluorida (GE Healthcare). Blokir situs non-spesifik dan inkubasi dengan antibodi primer (lihat Tabel S1 untuk detailnya) dalam 5% susu dalam TBST (larutan garam buffer Tris dengan Tween), langkah pencucian dan antibodi sekunder dalam TBST. Inkubasi. Inkubasi dengan antibodi primer semalaman pada suhu +4°C. Setelah pencucian, aplikasikan antibodi sekunder selama 2 jam pada suhu kamar. Selanjutnya, dengan menginkubasi blot yang sama dengan antibodi anti-β-aktin, pemuatan yang sama dikonfirmasi. Deteksi dengan konversi ke kemiluminesensi dan peningkatan kemiluminesensi (GE Healthcare).
Neuron yang sebelumnya ditanam pada kaca penutup difiksasi dengan 4% paraformaldehida (PFA)/PBS pada titik waktu yang ditentukan pada suhu kamar selama 10 menit. Kaca penutup terlebih dahulu diresapi dengan 0,1% Triton X-100/PBS selama 5 menit pada suhu kamar, dan kemudian dalam larutan penyangga pemblokiran [3% albumin serum sapi (BSA)/PBS]. Pada hari kedua, kaca penutup dicuci dengan larutan penyangga pemblokiran dan diinkubasi dengan antibodi sekunder terkonjugasi fluorofor yang sesuai selama 2 jam pada suhu kamar; akhirnya, sampel dicuci bersih dalam PBS dengan 4′,6-diamidino-2-Phenylindole (DAPI) yang diwarnai dengan pewarna kontras dan kemudian difiksasi pada slide mikroskop dengan Aqua-Poly/Mount.
Tikus (jantan dan betina) dibius dengan injeksi intraperitoneal ketamin (130 mg/kg) dan xilazin (10 mg/kg) serta diberikan analgesik karprofen (5 mg/kg) secara subkutan, dan ditempatkan pada instrumen stereotaktik (Kopf) yang dilengkapi dengan bantalan penghangat. Tengkorak diekspos dan digunakan bor gigi untuk menipiskan bagian korteks serebelum yang sesuai dengan tulang mis (dari lambda: ekor 1,8, lateral 1, sesuai dengan lobulus IV dan V). Jarum suntik lengkung digunakan untuk membuat lubang kecil di tengkorak dengan hati-hati agar tidak mengganggu pembuluh darah di bawahnya. Kemudian kapiler kaca tipis yang ditarik perlahan dimasukkan ke dalam lubang mikro (dari -1,3 hingga -1 di sisi ventral dura mater), dan 200 hingga 300 nl AAV disuntikkan ke dalam mikroinjektor (Narishige) dengan jarum suntik manual (Narishige) beberapa kali dengan tekanan rendah selama periode waktu 10 hingga 20 menit. Setelah infus, letakkan kapiler selama 10 menit lagi untuk memungkinkan virus menyebar sepenuhnya. Setelah kapiler ditarik, kulit dijahit dengan hati-hati untuk meminimalkan peradangan luka dan memungkinkan hewan untuk pulih. Hewan-hewan tersebut diobati dengan analgesik (caspofen) selama beberapa hari setelah operasi, selama waktu tersebut kondisi fisik mereka dipantau dengan cermat dan kemudian mereka di-eutanasia pada titik waktu yang ditentukan. Semua prosedur dilakukan sesuai dengan pedoman Eropa, nasional, dan institusional dan telah disetujui oleh Landesamt für Natur dari Umwelt and Verbraucherschutz, Rhine Utara-Westphalia, Jerman.
Hewan-hewan tersebut dibius dengan ketamin (100 mg/kg) dan xilazin (10 mg/kg), dan jantungnya diperfusi dengan PBS 0,1 M terlebih dahulu, kemudian dengan PFA 4% dalam PBS. Jaringan tersebut dipotong dan difiksasi dalam PFA 4%/PBS semalaman pada suhu 4°C. Pisau getar (Leica Microsystems GmbH, Wina, Austria) digunakan untuk menyiapkan potongan sagital (ketebalan 50 μm) dari otak yang telah difiksasi dalam PBS. Kecuali dinyatakan lain, pewarnaan potongan yang mengambang bebas dilakukan seperti yang dijelaskan di atas (13) pada suhu ruang dan pengadukan. Singkatnya, pertama, irisan yang diperoleh dipermeabilisasi dengan Triton X-100 0,5%/PBS selama 15 menit pada suhu ruang; untuk beberapa epitop (Pcx dan Shmt2), dengan memanaskan irisan dalam buffer tris-EDTA pada suhu 80°C (pH 9) selama 25 menit sebagai pengganti langkah ini. Selanjutnya, irisan jaringan diinkubasi dengan antibodi primer (lihat Tabel S1) dalam larutan penyangga pemblokiran (3% BSA/PBS) pada suhu 4°C semalaman sambil diaduk. Keesokan harinya, irisan jaringan dicuci dengan larutan penyangga pemblokiran dan diinkubasi dengan antibodi sekunder berkonjugasi fluorofor yang sesuai selama 2 jam pada suhu kamar; akhirnya, irisan jaringan dicuci bersih dengan PBS, diwarnai dengan DAPI, dan kemudian difiksasi dengan AquaPolymount pada slide mikroskop.
Mikroskop konfokal pemindaian laser (TCS SP8-X atau TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) yang dilengkapi dengan laser cahaya putih dan laser ultraviolet dioda 405 digunakan untuk pencitraan sampel. Dengan mengeksitasi fluorofor dan mengumpulkan sinyal dengan Hybrid Detector (HyDs), perangkat lunak LAS-X digunakan untuk mengumpulkan gambar bertumpuk yang sesuai dengan pengambilan sampel Nyquist dalam mode sekuensial: untuk panel non-kuantitatif, sinyal yang sangat dinamis (misalnya, pada sel somatik dan dendrit) mtYFP) Gunakan HyD untuk mendeteksi jumlah PN dalam mode BrightR). Pembatasan dari 0,3 hingga 6 ns diterapkan untuk mengurangi latar belakang.
Pencitraan sel yang telah disortir secara real-time. Setelah disortir dalam medium Neurobasal-A yang mengandung 1% suplemen B27 dan 0,5 mM GlutaMax, sel-sel segera ditanam pada slide kaca berlapis poli-l-lisin (μ-Slide8 Well, Ibidi, nomor katalog 80826), dan kemudian disimpan pada suhu 37°C dan 5% CO2 selama 1 jam agar sel-sel dapat mengendap. Pencitraan real-time dilakukan pada mikroskop confocal pemindaian laser Leica SP8 yang dilengkapi dengan laser putih, HyD, lensa objektif minyak 63×[apertur numerik (NA) 1,4] dan meja pemanas.
Tikus tersebut dengan cepat dibius dengan karbon dioksida dan dipenggal kepalanya, otaknya segera dikeluarkan dari tengkorak, dan dipotong menjadi bagian sagital setebal 200μm (untuk percobaan pelabelan 13C) atau 275μm (untuk percobaan dua foton) yang diisi dengan bahan-bahan berikut: Es krim (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Jerman) diisi dengan zat-zat berikut: cairan serebrospinal buatan (ACSF) rendah Ca2+ yang sangat dingin dan jenuh karbon (95% O2 dan 5% CO2) 125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM buffer natrium fosfat, 25 mM NaHCO3, 25 mM glukosa, 0,5 mM CaCl2 dan 3,5 mM MgCl2 (tekanan osmotik 310 hingga 330 mmol). Pindahkan irisan otak yang diperoleh ke ruang pra-inkubasi yang mengandung medium ACSF dengan konsentrasi Ca2+ lebih tinggi (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM buffer natrium fosfat, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukosa, 1,0 mM CaCl2 dan 2,0 mM MgCl2) pH 7,4 dan 310 hingga 320 mmol).
Selama proses pencitraan, irisan dipindahkan ke ruang pencitraan khusus, dan percobaan dilakukan di bawah perfusi ACSF kontinu pada suhu konstan 32° hingga 33°C. Mikroskop pemindaian laser multiphoton (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) yang dilengkapi dengan lensa objektif Leica 25x (NA 0,95, air), laser Ti: Sapphire (Chameleon Vision II, Coherent) digunakan untuk pencitraan irisan. Modul FLIM (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM Grx1-roGFP2. Perubahan keadaan redoks sitoplasma PN diukur dengan FLIM dua-foton pada irisan otak sagital, di mana biosensor Grx1-roGFP2 menargetkan PN. Pada lapisan PN, bidang akuisisi dipilih sekitar 50 hingga 80 μm di bawah permukaan irisan untuk memastikan adanya PN yang layak (yaitu, tidak adanya struktur manik-manik atau perubahan morfologi neuron di sepanjang dendrit) dan sensor roGFP2 positif ganda serta AAV yang mengkode shRNA PCx atau sekuens kontrolnya (masing-masing mengekspresikan mCherry). Kumpulkan gambar tumpukan tunggal dengan zoom digital 2x [panjang gelombang eksitasi: 890 nm; 512 nm 512 piksel]. Deteksi: HyD internal, kelompok filter fluorescein isothiocyanate (FITC)] dan perataan gambar dalam 2 hingga 3 menit digunakan untuk memastikan bahwa cukup banyak foton yang dikumpulkan (total 1000 foton) untuk pencocokan kurva. Sensitivitas probe Grx1-roGFP2 dan verifikasi kondisi FLIM dilakukan dengan memantau nilai masa hidup roGFP2 ketika menambahkan 10 mM H2O2 eksogen ke dalam perfusi ACSF (untuk memaksimalkan oksidasi, yang menghasilkan peningkatan masa hidup), dan kemudian menambahkan 2 mM dithiothreitol (meminimalkan tingkat reduksi, yang menghasilkan penurunan masa hidup) (Gambar S8, D hingga G). Gunakan perangkat lunak FLIMfit 5.1.1 untuk menganalisis hasil yang diperoleh, sesuaikan kurva peluruhan eksponensial tunggal dari seluruh gambar dengan IRF (fungsi respons instrumen) yang terukur, dan χ2 kira-kira 1. Untuk menghitung masa hidup PN tunggal, masker di sekitar badan saraf digambar secara manual, dan masa hidup rata-rata di setiap masker digunakan untuk kuantifikasi.
Analisis potensial mitokondria. Setelah potongan akut diinkubasi dengan 100 nM TMRM yang ditambahkan langsung ke ACSF yang dialirkan selama 30 menit, perubahan potensial mitokondria PN diukur dengan mikroskop dua-foton. Pencitraan TMRM dilakukan dengan mengeksitasi probe pada 920 nm dan menggunakan HyD internal (tetramethylrhodamine isothiocyanate: 585/40 nm) untuk mengumpulkan sinyal; dengan menggunakan panjang gelombang eksitasi yang sama tetapi menggunakan HyD internal yang berbeda (FITC: 525/50) untuk pencitraan mtYFP. Gunakan plug-in Image Calculator dari ImageJ untuk mengevaluasi potensial mitokondria pada tingkat sel tunggal. Singkatnya, persamaan plug-in: sinyal = min (mtYFP, TMRM) digunakan untuk mengidentifikasi wilayah mitokondria yang menunjukkan sinyal TMRM di Purkinje Somali dalam gambar konfokal tumpukan tunggal dari saluran yang sesuai. Kemudian area piksel pada mask yang dihasilkan dikuantifikasi, dan kemudian dinormalisasi pada citra tumpukan tunggal ambang batas yang sesuai dari saluran mtYFP untuk mendapatkan fraksi mitokondria yang menunjukkan potensi mitokondria.
Gambar tersebut didekonvolusi dengan perangkat lunak Huygens Pro (Scientific Volume Imaging). Untuk gambar ubin yang dipindai, montase satu ubin dibuat menggunakan algoritma penyambungan otomatis yang disediakan oleh perangkat lunak LAS-X. Setelah kalibrasi gambar, gunakan ImageJ dan Adobe Photoshop untuk memproses gambar lebih lanjut dan menyesuaikan kecerahan dan kontras secara seragam. Gunakan Adobe Illustrator untuk persiapan grafis.
Analisis fokus mtDNA. Jumlah lesi mtDNA dikuantifikasi pada potongan serebelum yang diberi label dengan antibodi terhadap DNA menggunakan mikroskop konfokal. Setiap area target dibuat untuk badan sel dan inti setiap sel, dan area masing-masing dihitung menggunakan plug-in Multi Measure (perangkat lunak ImageJ). Kurangi area inti dari area badan sel untuk mendapatkan area sitoplasma. Terakhir, plug-in Analyze Particles (perangkat lunak ImageJ) digunakan untuk secara otomatis mengkuantifikasi titik DNA sitoplasma yang menunjukkan mtDNA pada gambar ambang batas, dan hasil yang diperoleh dinormalisasi terhadap rata-rata PN tikus CTRL. Hasilnya dinyatakan sebagai jumlah rata-rata nukleosida per sel.
Analisis ekspresi protein. Gunakan plug-in Image Calculator dari ImageJ untuk mengevaluasi ekspresi protein di PN pada tingkat sel tunggal. Singkatnya, pada citra konfokal lapisan tunggal dari saluran yang sesuai, melalui persamaan: sinyal = min (mtYFP, antibodi), wilayah mitokondria yang menunjukkan imunoreaktivitas terhadap antibodi tertentu di Purkina diidentifikasi. Kemudian area piksel pada mask yang dihasilkan dikuantifikasi, dan kemudian dinormalisasi pada citra tumpukan tunggal ambang batas yang sesuai dari saluran mtYFP untuk mendapatkan fraksi mitokondria dari protein yang ditampilkan.
Analisis kepadatan sel Purkinje. Plugin Cell Counter pada ImageJ digunakan untuk mengevaluasi kepadatan Purkinje dengan membagi jumlah sel Purkinje yang dihitung dengan panjang cincin serebelum yang ditempati oleh sel-sel yang dihitung.
Persiapan dan pengumpulan sampel. Otak dari kelompok kontrol dan tikus Mfn2cKO difiksasi dalam 2% PFA/2,5% glutaraldehida dalam buffer fosfat (PB) 0,1 M, kemudian dibuat potongan koronal menggunakan siliata (Leica Mikrosysteme GmbH, Wina, Austria) (Ketebalan 50 hingga 60 μm). Kemudian difiksasi dalam buffer PB dengan 1% os tetraoksida dan 1,5% kalium ferrocyanida pada suhu kamar selama 1 jam. Potongan dicuci tiga kali dengan air suling, kemudian diwarnai dengan etanol 70% yang mengandung 1% uranil asetat selama 20 menit. Potongan kemudian didehidrasi dalam alkohol bertingkat dan ditanamkan dalam resin epoksi Durcupan ACM (resin pengecoran Araldite M) (Electron Microscopy Sciences, nomor katalog 14040) di antara slide kaca berlapis silikon, dan akhirnya dipolimerisasi dalam oven pada suhu 60°C selama 48 jam. Area korteks serebelum dipilih dan sayatan ultra tipis 50 nm dipotong menggunakan Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Wina, Austria) dan diletakkan pada kisi celah tembaga 2×1 mm yang dilapisi film polistirena. Sayatan diwarnai dengan larutan uranil asetat 4% dalam H2O selama 10 menit, dicuci dengan H2O beberapa kali, kemudian dengan timbal sitrat Reynolds dalam H2O selama 10 menit, dan kemudian dicuci dengan H2O beberapa kali. Mikrograf diambil dengan mikroskop elektron transmisi Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, AS) menggunakan kamera digital TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, AS, Jerman).
Untuk tikus yang terinfeksi AAV, otak dipisahkan dan diiris menjadi bagian sagital setebal 1 mm, dan serebelum diperiksa menggunakan mikroskop fluoresensi untuk mengidentifikasi cincin yang terinfeksi AAV (yaitu, yang mengekspresikan mCherry). Hanya eksperimen yang injeksi AAV-nya menghasilkan efisiensi transduksi yang sangat tinggi pada lapisan sel Purkinje (yaitu, hampir seluruh lapisan) di setidaknya dua cincin serebelum yang berurutan yang digunakan. Lingkaran yang ditransduksi AAV dimikrodiseksi untuk fiksasi pasca-perlakuan semalaman (4% PFA dan 2,5% glutaraldehida dalam buffer kokoat 0,1 M) dan diproses lebih lanjut. Untuk penyematan EPON, jaringan yang difiksasi dicuci dengan buffer natrium kokoat 0,1 M (Applichem), dan diinkubasi dengan 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) dalam buffer natrium kokoat 0,1 M (Applichem) selama 4 jam, kemudian dicuci selama 2 jam. Ulangi 3 kali dengan buffer kokamida 0,1 M. Selanjutnya, serangkaian etanol bertingkat digunakan untuk menginkubasi setiap larutan etanol pada suhu 4°C selama 15 menit untuk mendehidrasi jaringan. Jaringan dipindahkan ke propilen oksida dan diinkubasi semalaman dalam EPON (Sigma-Aldrich) pada suhu 4°C. Letakkan jaringan dalam EPON segar pada suhu kamar selama 2 jam, lalu tanamkan pada suhu 62°C selama 72 jam. Gunakan ultramikrotom (Leica Microsystems, UC6) dan pisau berlian (Diatome, Biel, Swiss) untuk memotong bagian ultratipis 70 nm, dan warnai dengan uranil asetat 1,5% selama 15 menit pada suhu 37°C, dan warnai dengan larutan timbal sitrat selama 4 menit. Mikrograf elektron diambil menggunakan mikroskop elektron transmisi JEM-2100 Plus (JEOL) yang dilengkapi dengan Kamera OneView 4K 16-bit (Gatan) dan perangkat lunak DigitalMicrograph (Gatan). Untuk analisis, mikrograf elektron diperoleh dengan perbesaran digital 5000× atau 10.000×.
Analisis morfologi mitokondria. Untuk semua analisis, kontur mitokondria individu digariskan secara manual pada gambar digital menggunakan perangkat lunak ImageJ. Berbagai parameter morfologi dianalisis. Kepadatan mitokondria dinyatakan sebagai persentase yang diperoleh dengan membagi total luas mitokondria setiap sel dengan luas sitoplasma (luas sitoplasma = luas sel - luas inti sel) × 100. Kebulatan mitokondria dihitung dengan rumus [4π∙(luas/keliling²)]. Morfologi mitokondria dianalisis dan dibagi menjadi dua kategori (“tabung” dan “lepuh”) sesuai dengan bentuk utamanya.
Analisis jumlah dan kepadatan autofagosom/lisosom. Gunakan perangkat lunak ImageJ untuk secara manual menggariskan kontur setiap autofagosom/lisosom dalam gambar digital. Luas autofagosom/lisosom dinyatakan sebagai persentase yang dihitung dengan membagi total luas struktur autofagosom/lisosom setiap sel dengan luas sitoplasma (luas sitoplasma = luas sel - luas inti) × 100. Kepadatan autofagosom/lisosom dihitung dengan membagi jumlah total dengan jumlah struktur autofagosom/lisosom per sel (dalam hal luas sitoplasma) (luas sitoplasma = luas sel - luas inti).
Pelabelan untuk pemotongan akut dan persiapan sampel. Untuk eksperimen yang memerlukan pelabelan glukosa, pindahkan irisan otak akut ke ruang pra-inkubasi, yang berisi karbon jenuh (95% O2 dan 5% CO2), Ca2+ tinggi ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM buffer natrium fosfat, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukosa, 1,0 mM CaCl2 dan 2,0 mM MgCl2, disesuaikan hingga pH 7,4 dan 310 hingga 320 mOsm), di mana glukosa adalah substitusi 13C6-Glukosa (Eurisotop, nomor katalog CLM-1396). Untuk eksperimen yang memerlukan pelabelan piruvat, pindahkan irisan otak akut ke ACSF dengan konsentrasi Ca2+ lebih tinggi (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM buffer natrium fosfat, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukosa, 1,0 mM CaCl2 dan tambahkan 2,0 mM MgCl2, sesuaikan pH menjadi 7,4 dan 310 hingga 320 mOsm), dan tambahkan 1 mM 1-[1-13C]piruvat (Eurisotop, nomor katalog CLM-1082). Inkubasi irisan selama 90 menit pada suhu 37°C. Pada akhir percobaan, potongan jaringan dicuci dengan cepat menggunakan larutan berair (pH 7,4) yang mengandung 75 mM amonium karbonat, kemudian dihomogenkan dalam campuran 40:40:20 (v:v:v) asetonitril (ACN): metanol: air. Setelah potongan jaringan diinkubasi di atas es selama 30 menit, sampel disentrifugasi pada 21.000 g selama 10 menit pada suhu 4°C, dan supernatan yang jernih dikeringkan dalam konsentrator SpeedVac. Pelet metabolit kering yang dihasilkan disimpan pada suhu -80°C hingga analisis.
Analisis kromatografi cair-spektrometri massa asam amino berlabel 13C. Untuk analisis kromatografi cair-spektrometri massa (LC-MS), pelet metabolit dilarutkan kembali dalam 75 μl air kualitas LC-MS (Honeywell). Setelah sentrifugasi pada 21.000 g selama 5 menit pada suhu 4°C, 20 μl supernatan yang telah dijernihkan digunakan untuk analisis fluks asam amino, sedangkan sisa ekstrak segera digunakan untuk analisis anion (lihat di bawah). Analisis asam amino dilakukan menggunakan protokol derivatisasi benzoil klorida yang telah dijelaskan sebelumnya (55, 56). Pada langkah pertama, 10 μl natrium karbonat 100 mM (Sigma-Aldrich) ditambahkan ke 20 μl ekstrak metabolit, dan kemudian 10 μl benzoil klorida 2% (Sigma-Aldrich) ditambahkan ke ACN kualitas LC. Sampel di-vortex sebentar lalu disentrifugasi pada 21.000 g selama 5 menit pada suhu 20°C. Supernatan yang jernih dipindahkan ke vial autosampler 2 ml dengan sisipan kaca kerucut (volume 200 μl). Sampel dianalisis menggunakan sistem LC ultra-high performance Acquity iClass (Waters) yang terhubung ke spektrometer massa presisi resolusi tinggi Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) (Thermo Fisher Scientific). Untuk analisis, 2 μl sampel yang telah didervatisasi diinjeksikan ke dalam kolom silika T3 berkekuatan tinggi 100×1,0 mm (Waters) yang berisi partikel 1,8 μm. Laju alir adalah 100 μl/menit, dan sistem buffer terdiri dari buffer A (10 mM amonium format dan 0,15% asam format dalam air) dan buffer B (ACN). Gradiennya adalah sebagai berikut: 0% B pada 0 menit; 0%B. 0 hingga 15% B pada 0 hingga 0,1 menit; 15 hingga 17% B pada 0,1 hingga 0,5 menit; B pada 17 hingga 55% pada 0,5 hingga 14 menit; B pada 55 hingga 70% pada 14 hingga 14,5 menit; pada 14,5 hingga 70 hingga 100% B pada 18 menit; 100% B pada 18 hingga 19 menit; 100 hingga 0% B pada 19 hingga 19,1 menit; 0% B pada 19,1 hingga 28 menit (55, 56). Spektrometer massa QE-HF beroperasi dalam mode ionisasi positif dengan rentang massa m/z (rasio massa/muatan) 50 hingga 750. Resolusi yang diterapkan adalah 60.000, dan target ion kontrol penguatan (AGC) yang diperoleh adalah 3×10⁶, dan waktu ion maksimum adalah 100 milidetik. Sumber ionisasi elektrospray (ESI) yang dipanaskan beroperasi pada tegangan semprot 3,5 kV, suhu kapiler 250°C, aliran udara selubung 60 AU (satuan arbitrer), dan aliran udara tambahan 20 AU. Lensa S diatur ke 60 AU.
Analisis kromatografi anion-MS dari asam organik berlabel 13C. Endapan metabolit yang tersisa (55μl) dianalisis menggunakan sistem kromatografi ion Dionex (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) yang terhubung ke spektrometer massa QE-HF (Thermo Fisher Scientific). Singkatnya, 5μl ekstrak metabolit diinjeksikan ke dalam kolom Dionex IonPac AS11-HC yang dilengkapi dengan HPLC (2 mm × 250 mm, ukuran partikel 4μm, Thermo Fisher Scientific) dalam mode push-in partial loop dengan rasio pengisian 1. Kolom pelindung Dionex IonPac AG11-HC (2 mm x 50 mm, 4μm, Thermo Fisher Scientific) digunakan. Suhu kolom dipertahankan pada 30°C, dan autosampler diatur pada 6°C. Gunakan kartrid kalium hidroksida yang dilengkapi dengan air deionisasi untuk menghasilkan gradien kalium hidroksida melalui generator eluen. Pemisahan metabolit pada laju aliran 380 μl/menit, dengan menerapkan gradien berikut: 0 hingga 3 menit, 10 mM KOH; 3 hingga 12 menit, 10 hingga 50 mM KOH; 12 hingga 19 menit, 50 hingga 100 mM KOH; 19 hingga 21 menit, 100 mM KOH; 21 hingga 21,5 menit, 100 hingga 10 mM KOH. Kolom diseimbangkan kembali di bawah 10 mM KOH selama 8,5 menit.
Metabolit yang terelusi digabungkan dengan aliran suplemen isopropanol 150 μl/min setelah kolom dan kemudian diarahkan ke spektrometer massa resolusi tinggi yang beroperasi dalam mode ionisasi negatif. MS memantau rentang massa dari m/z 50 hingga 750 dengan resolusi 60.000. AGC diatur ke 1×10⁶, dan waktu ion maksimum dijaga pada 100 ms. Sumber ESI yang dipanaskan dioperasikan pada tegangan semprot 3,5 kV. Pengaturan lain dari sumber ion adalah sebagai berikut: suhu kapiler 275°C; aliran gas selubung, 60 AU; aliran gas bantu, 20 AU pada 300°C, dan pengaturan lensa S ke 60 AU.
Analisis data metabolit berlabel 13C. Gunakan perangkat lunak TraceFinder (versi 4.2, Thermo Fisher Scientific) untuk analisis data rasio isotop. Identitas setiap senyawa diverifikasi dengan senyawa referensi yang andal dan dianalisis secara independen. Untuk melakukan analisis pengayaan isotop, luas kromatogram ion terekstraksi (XIC) dari setiap isotop 13C (Mn) diekstraksi dari [M + H] +, di mana n adalah jumlah karbon dari senyawa target, digunakan untuk menganalisis asam amino atau [ MH] + digunakan untuk menganalisis anion. Akurasi massa XIC kurang dari lima bagian per juta, dan akurasi RT adalah 0,05 menit. Analisis pengayaan dilakukan dengan menghitung rasio setiap isotop yang terdeteksi terhadap jumlah semua isotop dari senyawa yang bersangkutan. Rasio ini diberikan sebagai nilai persentase untuk setiap isotop, dan hasilnya dinyatakan sebagai persentase pengayaan molar (MPE), seperti yang dijelaskan sebelumnya (42).
Pelet neuron beku dihomogenkan dalam metanol 80% dingin (v/v), divortex, dan diinkubasi pada -20°C selama 30 menit. Vortex sampel lagi dan aduk pada +4°C selama 30 menit. Sampel disentrifugasi pada 21.000 g selama 5 menit pada 4°C, dan kemudian supernatan yang dihasilkan dikumpulkan dan dikeringkan menggunakan konsentrator SpeedVac pada 25°C untuk analisis selanjutnya. Seperti yang dijelaskan di atas, analisis LC-MS dilakukan pada asam amino sel yang telah disortir. Menggunakan TraceFinder (versi 4.2, Thermo Fisher Scientific), analisis data dilakukan menggunakan massa monoisotopik dari setiap senyawa. Normalisasi kuantil data metabolit dilakukan menggunakan paket perangkat lunak preprocessCore (57).
Persiapan irisan. Tikus dengan cepat dibius dengan karbon dioksida dan dipenggal kepalanya, otaknya segera dikeluarkan dari tengkorak, dan pisau getar berisi es (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Jerman) digunakan untuk memotongnya menjadi irisan sagital 300 hingga 375 μm. Gasifikasi karbon dingin (95% O2 dan 5% CO2) Ca2+ rendah + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM buffer natrium fosfat, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukosa, 1,0 mM CaCl2 dan 6,0 mM MgCl2. Sesuaikan pH menjadi 7,4 dan 310 hingga 330 mOsm). Pindahkan irisan otak yang diperoleh ke ruang yang berisi larutan ACSF dengan konsentrasi Ca2+ lebih tinggi (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM buffer natrium fosfat, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukosa, 4,0 mM CaCl2 dan 3,5 mM MgCl2) pH 7,4 dan 310 hingga 320 mOsm). Simpan irisan tersebut selama 20 hingga 30 menit agar dapat dipulihkan sebelum perekaman.
Perekaman. Meja mikroskop yang dilengkapi dengan ruang perekaman tetap dan lensa objektif perendaman air 20x (Scientifica) digunakan untuk semua perekaman. Sel Purkinje yang diduga diidentifikasi berdasarkan (i) ukuran tubuh, (ii) lokasi anatomi serebelum, dan (iii) ekspresi gen reporter fluoresen mtYFP. Pipet patch dengan resistansi ujung 5 hingga 11 megohm ditarik keluar oleh kapiler kaca borosilikat (GB150-10, 0,86 mm × 1,5 mm × 100 mm, Science Products, Hofheim, Jerman) dan pipet horizontal Instruments (P-1000, Sutter, Novato, CA). Semua perekaman dilakukan oleh amplifier patch clamp ELC-03XS npi (npi electronic GmbH, Tam, Jerman), yang dikendalikan oleh perangkat lunak Signal (versi 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, UK). Percobaan direkam pada laju sampling 12,5 kHz. Sinyal disaring dengan dua filter Bessel short-pass dengan frekuensi cutoff masing-masing 1,3 dan 10 kHz. Kapasitansi membran dan pipet dikompensasi oleh rangkaian kompensasi menggunakan penguat. Semua percobaan dilakukan di bawah kendali kamera Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Jerman), yang dikendalikan oleh perangkat lunak Hokawo (versi 2.8, Hamamatsu, Gerden, Jerman).
Konfigurasi dan analisis sel utuh rutin. Tepat sebelum perekaman, isi pipet dengan larutan internal yang mengandung zat-zat berikut: 4,0 mM KCl, 2,0 mM NaCl, 0,2 mM EGTA, 135,0 mM kalium glukonat, 10,0 mM Hepes, 4,0 mM ATP (Mg), 0,5 mM Guanosin trifosfat (GTP) (Na) dan 10,0 mM kreatinin fosfat yang disesuaikan hingga pH 7,25, dan tekanan osmotik 290 mOsm (sukrosa). Segera setelah menerapkan gaya 0 pA untuk merusak membran, potensial membran istirahat diukur. Resistansi input diukur dengan menerapkan arus hiperpolarisasi -40, -30, -20, dan -10 pA. Ukur besarnya respons tegangan dan gunakan hukum Ohm untuk menghitung resistansi input. Aktivitas spontan direkam dalam penjepit tegangan selama 5 menit, dan sPSC diidentifikasi dan diukur di Igor Pro (versi 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, AS) menggunakan skrip pengenalan semi-otomatis. Kurva IV dan arus keadaan tunak diukur dengan menjepit baterai pada potensial yang berbeda (mulai dari -110 mV) dan meningkatkan tegangan dalam langkah 5 mV. Produksi AP diuji dengan menerapkan arus depolarisasi. Jepit sel pada -70 mV sambil menerapkan pulsa arus depolarisasi. Sesuaikan ukuran langkah setiap unit perekaman secara terpisah (10 hingga 60 pA). Hitung frekuensi AP maksimum dengan menghitung secara manual lonjakan pulsa yang menyebabkan frekuensi AP tertinggi. Ambang batas AP dianalisis dengan menggunakan turunan kedua dari pulsa depolarisasi yang pertama kali memicu satu atau lebih AP.
Konfigurasi dan analisis patch berlubang. Lakukan perekaman patch berlubang menggunakan protokol standar. Gunakan pipet bebas ATP dan GTP yang tidak mengandung bahan-bahan berikut: 128 mM glukonat K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0,1 mM EGTA dan 2 mM MgCl2, dan sesuaikan pH menjadi 7,2 (menggunakan KOH). ATP dan GTP dihilangkan dari larutan intraseluler untuk mencegah permeabilitas membran sel yang tidak terkontrol. Pipet patch diisi dengan larutan internal yang mengandung amfoterisin (sekitar 200 hingga 250 μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) untuk mendapatkan rekaman patch berlubang. Amfoterisin dilarutkan dalam dimetil sulfoksida (konsentrasi akhir: 0,1 hingga 0,3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Konsentrasi DMSO yang digunakan tidak memiliki efek signifikan pada neuron yang diteliti. Selama proses pengambilan sampel, resistansi saluran (Ra) dipantau secara terus menerus, dan percobaan dimulai setelah amplitudo Ra dan AP stabil (20-40 menit). Aktivitas spontan diukur dalam penjepit tegangan dan/atau arus selama 2 hingga 5 menit. Analisis data dilakukan menggunakan Igor Pro (versi 7.05.2, WaveMetrics, AS), Excel (versi 2010, Microsoft Corporation, Redmond, AS) dan GraphPad Prism (versi 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, Amerika Serikat). Untuk mengidentifikasi AP spontan, digunakan plug-in NeuroMatic v3.0c dari IgorPro. Secara otomatis mengidentifikasi AP menggunakan ambang batas tertentu, yang disesuaikan secara individual untuk setiap rekaman. Menggunakan interval spike, tentukan frekuensi spike dengan frekuensi spike sesaat maksimum dan frekuensi spike rata-rata.
Isolasi PN. Dengan mengadaptasi protokol yang telah dipublikasikan sebelumnya, PN dimurnikan dari serebelum tikus pada tahap tertentu (58). Singkatnya, serebelum dibedah dan dicincang dalam medium disosiasi dingin es [tanpa HBSS Ca2+ dan Mg2+, ditambah dengan 20 mM glukosa, penisilin (50 U/ml) dan streptomisin (0,05 mg/ml)], dan kemudian dicerna medium dalam papain [HBSS, ditambah dengan 1-sistein·HCl (1 mg/ml), papain (16 U/ml) dan deoksiribonuklease I (DNase I; 0,1 mg/ml)] Perlakuan selama 30 menit pada suhu 30°C. Pertama-tama, cuci jaringan dalam medium HBSS yang mengandung lendir telur (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml), dan DNase (0,1 mg/ml) pada suhu ruang untuk mencegah pencernaan enzimatik, lalu dalam medium HBSS yang mengandung glukosa 20 mM. Gerus perlahan dalam HBSS, penisilin (50 U/ml), streptomisin (0,05 mg/ml), dan DNase (0,1 mg/ml) untuk melepaskan sel tunggal. Suspensi sel yang dihasilkan disaring melalui saringan sel 70μm, kemudian sel-sel diendapkan dengan sentrifugasi (1110 rpm, 5 menit, 4°C) dan disuspensikan kembali dalam medium sortasi [HBSS, ditambah dengan glukosa 20 mM, serum janin sapi 20%, penisilin (50 U/ml), dan streptomisin (0,05 mg/ml)]; Evaluasi viabilitas sel dengan propidium iodida dan sesuaikan kepadatan sel menjadi 1×10⁶ hingga 2×10⁶ sel/ml. Sebelum sitometri aliran, suspensi disaring melalui saringan sel 50 μm.
Flow sitometer. Pemisahan sel dilakukan pada suhu 4°C menggunakan mesin FACSAria III (BD Biosciences) dan perangkat lunak FACSDiva (BD Biosciences, versi 8.0.1). Suspensi sel dipisahkan menggunakan nosel 100 μm di bawah tekanan 20 psi dengan laju ~2800 kejadian/detik. Karena kriteria gating tradisional (ukuran sel, diskriminasi bimodal, dan karakteristik hamburan) tidak dapat memastikan isolasi PN yang benar dari jenis sel lain, strategi gating ditetapkan berdasarkan perbandingan langsung intensitas YFP dan autofluoresensi pada tikus mitoYFP+ ​​dan tikus kontrol mitoYFP−. YFP dieksitasi dengan menyinari sampel dengan garis laser 488 nm, dan sinyal dideteksi menggunakan filter band pass 530/30 nm. Pada tikus mitoYFP+, kekuatan relatif gen reporter Rosa26-mitoYFP juga digunakan untuk membedakan fragmen badan neuron dan akson. 7-AAD dieksitasi dengan laser kuning 561 nm dan dideteksi dengan filter bandpass 675/20 nm untuk mengecualikan sel mati. Untuk memisahkan astrosit secara bersamaan, suspensi sel diwarnai dengan ACSA-2-APC, kemudian sampel disinari dengan garis laser 640 nm, dan filter bandpass 660/20 nm digunakan untuk mendeteksi sinyal.
Sel-sel yang dikumpulkan diendapkan dengan sentrifugasi (1110 rpm, 5 menit, 4°C) dan disimpan pada suhu -80°C hingga digunakan. Tikus Mfn2cKO dan anak-anaknya diklasifikasikan pada hari yang sama untuk meminimalkan variabilitas prosedural. Presentasi dan analisis data FACS dilakukan menggunakan perangkat lunak FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA).
Seperti yang disebutkan di atas (59), PCR waktu nyata digunakan untuk mengisolasi DNA dari neuron yang telah disortir untuk kuantifikasi mtDNA selanjutnya. Linearitas dan sensitivitas ambang batas awalnya diuji dengan menjalankan qPCR pada jumlah sel yang berbeda. Singkatnya, kumpulkan 300 PN dalam buffer lisis yang terdiri dari 50 mM tris-HCl (pH 8,5), 1 mM EDTA, 0,5% Tween 20 dan proteinase K (200 ng/ml) dan inkubasi pada suhu 55°C selama 120 menit. Sel-sel tersebut kemudian diinkubasi lebih lanjut pada suhu 95°C selama 10 menit untuk memastikan inaktivasi proteinase K yang lengkap. Dengan menggunakan probe TaqMan (Thermo Fisher) yang spesifik untuk mt-Nd1, mtDNA diukur dengan PCR semi-kuantitatif dalam sistem PCR Waktu Nyata 7900HT (Thermo Fisher Scientific). Gen mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, nomor katalog Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, nomor katalog AIVI3E8) dan 18S (Thermo Fisher Scientific, nomor katalog Hs99999901_s1).
Persiapan sampel proteom. Dengan memanaskan larutan pada suhu 95°C selama 10 menit dan melakukan sonikasi, dalam buffer lisis [6 M guanidin klorida, 10 mM tris(2-karboksietil) fosfin hidroklorida, 10 mM kloroasetamida dan 100 mM tris-HCl]. Lisis pelet neuron beku dalam HCl. Pada Bioruptor (Diagenode) selama 10 menit (periode pulsa 30 detik / periode jeda 30 detik). Sampel diencerkan 1:10 dalam 20 mM tris-HCl (pH 8,0), dicampur dengan 300 ng tripsin emas (Promega), dan diinkubasi semalaman pada suhu 37°C untuk mencapai pencernaan lengkap. Pada hari kedua, sampel disentrifugasi pada 20.000 g selama 20 menit. Supernatan diencerkan dengan asam format 0,1%, dan larutan dihilangkan garamnya dengan StageTips buatan sendiri. Sampel dikeringkan dalam instrumen SpeedVac (konsentrator Eppendorf plus 5305) pada suhu 45°C, kemudian peptida disuspensikan dalam asam format 0,1%. Semua sampel disiapkan secara bersamaan oleh orang yang sama. Untuk menganalisis sampel astrosit, 4 μg peptida yang telah dihilangkan garamnya diberi label dengan tag massa tandem (TMT10plex, nomor katalog 90110, Thermo Fisher Scientific) dengan rasio peptida terhadap reagen TMT sebesar 1:20. Untuk pelabelan TMT, 0,8 mg reagen TMT disuspensikan kembali dalam 70 μl ACN anhidrat, dan peptida kering dilarutkan kembali ke dalam 9 μl TEAB (trietilamonium bikarbonat) 0,1 M, yang kemudian ditambahkan 7 μl reagen TMT dalam ACN. Konsentrasinya adalah 43,75%. Setelah inkubasi selama 60 menit, reaksi dihentikan dengan 2 μl hidroksilamin 5%. Peptida berlabel dikumpulkan, dikeringkan, dilarutkan kembali dalam 200 μl asam format (FA) 0,1%, dibagi menjadi dua, dan kemudian dihilangkan garamnya menggunakan StageTips buatan sendiri. Menggunakan kromatograf cair kinerja ultra tinggi UltiMate 3000 (UltiMate 3000 ultra high performance liquid chromatograph), salah satu dari dua bagian tersebut difraksinasi pada kolom kromatografi Acquity 1 mm x 150 mm yang diisi dengan partikel C18 130Å1,7μm (Waters, katalog No. SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific). Pisahkan peptida pada laju aliran 30 μl/menit, pisahkan dari 1% hingga 50% buffer B selama 85 menit dengan gradien bertahap 96 menit, dari 50% hingga 95% buffer B selama 3 menit, kemudian 8 menit untuk 95% buffer B; buffer A adalah 5% ACN dan 10 mM amonium bikarbonat (ABC), dan buffer B adalah 80% ACN dan 10 mM ABC. Kumpulkan fraksi setiap 3 menit dan gabungkan menjadi dua kelompok (1 + 17, 2 + 18, dst.) dan keringkan dalam sentrifugasi vakum.
Analisis LC-MS/MS. Untuk spektrometri massa, peptida (nomor r119.aq) dipisahkan pada kolom analitik PicoFrit 25 cm, diameter dalam 75 μm (lensa objektif baru, nomor bagian PF7508250) yang dilengkapi dengan medium ReproSil-Pur 120 C18-AQ 1,9 μm (Dr. Maisch, mat), menggunakan EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Jerman). Kolom dipertahankan pada suhu 50°C. Buffer A dan B masing-masing adalah asam format 0,1% dalam air dan asam format 0,1% dalam 80% ACN. Peptida dipisahkan dari 6% hingga 31% buffer B selama 65 menit dan dari 31% hingga 50% buffer B selama 5 menit dengan gradien 200 nl/min. Peptida yang terelusi dianalisis menggunakan spektrometer massa Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific). Pengukuran m/z prekursor peptida dilakukan dengan resolusi 120.000 dalam rentang 350 hingga 1500 m/z. Dengan menggunakan energi tumbukan ternormalisasi 27%, prekursor terkuat dengan keadaan muatan 2 hingga 6 dipilih untuk pemutusan disosiasi perangkap C berenergi tinggi (HCD). Waktu siklus diatur menjadi 1 detik. Nilai m/z fragmen peptida diukur dalam perangkap ion menggunakan target AGC terkecil 5×10⁴ dan waktu injeksi maksimum 86 ms. Setelah fragmentasi, prekursor ditempatkan pada daftar pengecualian dinamis selama 45 detik. Peptida berlabel TMT dipisahkan pada kolom Acclaim PepMap 50 cm, 75 μm (Thermo Fisher Scientific, nomor katalog 164942), dan spektrum migrasi dianalisis pada spektrometer massa Orbitrap Lumos Tribrid (Thermo Fisher Scientific) yang dilengkapi dengan peralatan ion gelombang asimetris medan tinggi (FAIMS) (Thermo Fisher Scientific) yang beroperasi pada dua tegangan kompensasi −50 dan −70 V. MS3 yang dipilih berdasarkan prekursor sinkronisasi digunakan untuk pengukuran sinyal ion pelapor TMT. Pemisahan peptida dilakukan pada EASY-nLC 1200, menggunakan elusi gradien linier 90%, dengan konsentrasi buffer 6% hingga 31%; buffer A adalah 0,1% FA, dan buffer B adalah 0,1% FA dan 80% ACN. Kolom analitik dioperasikan pada suhu 50°C. Gunakan FreeStyle (versi 1.6, Thermo Fisher Scientific) untuk memisahkan file asli sesuai dengan tegangan kompensasi FAIMS.
Identifikasi dan kuantifikasi protein. Dengan menggunakan mesin pencari Andromeda terintegrasi, data asli dianalisis menggunakan MaxQuant versi 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Selain sekuens Cre rekombinase dan YFP yang diperoleh dari Aequorea victoria, spektrum fragmen peptida dicari untuk sekuens kanonik dan sekuens isoform dari proteom referensi tikus (ID Proteom UP000000589, diunduh dari UniProt pada Mei 2017). Oksidasi metionin dan asetilasi N-terminal protein ditetapkan sebagai modifikasi variabel; metilasi karbamoil sistein ditetapkan sebagai modifikasi tetap. Parameter pencernaan diatur ke "spesifisitas" dan "tripsin/P". Jumlah minimum peptida dan peptida razor yang digunakan untuk identifikasi protein adalah 1; jumlah minimum peptida unik adalah 0. Dalam kondisi pencocokan peta peptida, tingkat identifikasi protein adalah 0,01. Opsi “Peptida Kedua” diaktifkan. Gunakan opsi “cocokkan antar run” untuk mentransfer identifikasi yang berhasil antara file asli yang berbeda. Gunakan rasio hitungan minimum LFQ 1 untuk kuantifikasi tanpa label (LFQ) (60). Intensitas LFQ difilter untuk setidaknya dua nilai valid dalam setidaknya satu kelompok genotipe pada setiap titik waktu, dan diekstrapolasi dari distribusi normal dengan lebar 0,3 dan turun 1,8. Gunakan platform komputasi Perseus (https://maxquant.net/perseus/) dan R (https://r-project.org/) untuk menganalisis hasil LFQ. Uji t moderat dua arah dari paket perangkat lunak limma digunakan untuk analisis ekspresi diferensial (61). Analisis data eksplorasi dilakukan menggunakan ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally dan pheatmap. Data proteomik berbasis TMT dianalisis menggunakan MaxQuant versi 1.6.10.43. Cari data proteomik mentah dari basis data proteomik manusia UniProt, yang diunduh pada September 2018. Analisis ini mencakup faktor koreksi kemurnian isotop yang disediakan oleh produsen. Gunakan limma di R untuk analisis ekspresi diferensial. Data asli, hasil pencarian basis data, dan alur kerja serta hasil analisis data semuanya disimpan dalam aliansi ProteomeXchange melalui repositori mitra PRIDE dengan pengidentifikasi kumpulan data PXD019690.
Anotasi fungsional memperkaya analisis. Alat Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) digunakan untuk menentukan kekayaan istilah anotasi fungsional dari kumpulan data pada 8 minggu (Gambar 1). Singkatnya, daftar protein kuantitatif yang diperoleh dari analisis data LC-MS/MS (spektrometri massa tandem) digunakan dengan kriteria filter berikut: Mus musculus dipilih sebagai spesies dan latar belakang, dan kategori menunjukkan nilai P yang disesuaikan oleh Benjamini untuk pengayaan 0,05 atau lebih rendah dianggap signifikan. Untuk grafik ini, lima kategori berlebih teratas di setiap kluster berdasarkan nilai P yang disesuaikan ditampilkan. Menggunakan uji t berganda, menggunakan program peningkatan linier dua tahap Benjamini, Krieger, dan Yekutieli (Q = 5%), analisis ekspresi protein berdasarkan waktu dilakukan pada kandidat penting yang diidentifikasi di setiap kategori, dan setiap baris dianalisis secara terpisah. Tidak perlu mengadopsi SD yang konsisten.
Untuk membandingkan hasil penelitian ini dengan basis data yang dipublikasikan dan menghasilkan diagram Venn pada Gambar 1, kami menggabungkan daftar protein kuantitatif dengan anotasi MitoCarta 2.0 (24). Gunakan alat online Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) untuk menghasilkan diagram.
Untuk informasi detail mengenai prosedur statistik yang digunakan untuk analisis proteomik, silakan merujuk ke bagian yang sesuai di bagian Bahan dan Metode. Untuk semua eksperimen lainnya, informasi detail dapat ditemukan di keterangan yang sesuai. Kecuali dinyatakan lain, semua data dinyatakan sebagai mean ± SEM, dan semua analisis statistik dilakukan menggunakan perangkat lunak GraphPad Prism 8.1.2.
Untuk materi tambahan artikel ini, silakan lihat http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
Artikel ini merupakan artikel akses terbuka yang didistribusikan di bawah ketentuan Lisensi Creative Commons Attribution-Non-Commercial, yang mengizinkan penggunaan, distribusi, dan reproduksi dalam media apa pun, selama penggunaan akhir bukan untuk keuntungan komersial dan premisnya adalah bahwa karya asli tersebut benar. Referensi.
Catatan: Kami hanya meminta Anda untuk memberikan alamat email Anda agar orang yang Anda rekomendasikan ke halaman ini mengetahui bahwa Anda ingin mereka melihat email tersebut dan bahwa email tersebut bukan spam. Kami tidak akan menyimpan alamat email apa pun.
Pertanyaan ini digunakan untuk menguji apakah Anda adalah pengunjung dan mencegah pengiriman spam otomatis.
Oleh E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Analisis proteomik pada neuron yang disfungsional mengungkapkan bahwa program metabolisme diaktifkan untuk melawan neurodegenerasi.
Oleh E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Analisis proteomik pada neuron yang disfungsional mengungkapkan bahwa program metabolisme diaktifkan untuk melawan neurodegenerasi.
©2020 Asosiasi Amerika untuk Kemajuan Ilmu Pengetahuan. semua hak dilindungi undang-undang. AAAS adalah mitra dari HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef dan COUNTER. ScienceAdvanced ISSN 2375-2548.