Artikel ini merupakan bagian dari topik penelitian “Teknologi bioremediasi canggih dan proses daur ulang senyawa organik sintetis (SOC)”. Lihat semua 14 artikel
Hidrokarbon aromatik polisiklik (PAH) dengan berat molekul rendah seperti naftalena dan naftalena tersubstitusi (metilnaftalena, asam naftoat, 1-naftil-N-metilkarbamat, dll.) banyak digunakan di berbagai industri dan bersifat genotoksik, mutagenik, dan/atau karsinogenik bagi organisme. Senyawa organik sintetis (SOC) atau xenobiotik ini dianggap sebagai polutan prioritas dan menimbulkan ancaman serius bagi lingkungan global dan kesehatan masyarakat. Intensitas aktivitas manusia (misalnya gasifikasi batubara, penyulingan minyak, emisi kendaraan, dan aplikasi pertanian) menentukan konsentrasi, nasib, dan transportasi senyawa yang ada di mana-mana dan persisten ini. Selain metode pengolahan/penghilangan fisik dan kimia, teknologi hijau dan ramah lingkungan seperti bioremediasi, yang memanfaatkan mikroorganisme yang mampu mendegradasi POC secara sempurna atau mengubahnya menjadi produk sampingan yang tidak beracun, telah muncul sebagai alternatif yang aman, hemat biaya, dan menjanjikan. Berbagai spesies bakteri yang termasuk dalam filum Proteobacteria (Pseudomonas, Pseudomonas, Comamonas, Burkholderia, dan Neosphingobacterium), Firmicutes (Bacillus dan Paenibacillus), dan Actinobacteria (Rhodococcus dan Arthrobacter) dalam mikrobiota tanah telah menunjukkan kemampuan untuk mendegradasi berbagai senyawa organik. Studi metabolisme, genomika, dan analisis metagenomik membantu kita memahami kompleksitas dan keragaman katabolisme yang ada pada bentuk kehidupan sederhana ini, yang selanjutnya dapat diterapkan untuk biodegradasi yang efisien. Keberadaan PAH dalam jangka panjang telah menghasilkan munculnya fenotipe degradasi baru melalui transfer gen horizontal menggunakan elemen genetik seperti plasmid, transposon, bakteriofag, pulau genomik, dan elemen konjugatif integratif. Biologi sistem dan rekayasa genetika dari isolat spesifik atau komunitas model (konsorsium) dapat memungkinkan bioremediasi PAH yang komprehensif, cepat, dan efisien melalui efek sinergis. Dalam tinjauan ini, kami berfokus pada berbagai jalur metabolisme dan keanekaragaman, komposisi dan keanekaragaman genetik, serta respons/adaptasi seluler bakteri pengurai naftalena dan naftalena tersubstitusi. Hal ini akan memberikan informasi ekologis untuk aplikasi lapangan dan optimasi strain untuk bioremediasi yang efisien.
Perkembangan industri yang pesat (petrokimia, pertanian, farmasi, pewarna tekstil, kosmetik, dll.) telah berkontribusi pada kemakmuran ekonomi global dan peningkatan standar hidup. Perkembangan eksponensial ini telah menghasilkan produksi sejumlah besar senyawa organik sintetis (SOC), yang digunakan untuk memproduksi berbagai produk. Senyawa asing atau SOC ini meliputi hidrokarbon aromatik polisiklik (PAH), pestisida, herbisida, plasticizer, pewarna, obat-obatan, organofosfat, penghambat api, pelarut organik volatil, dll. Senyawa-senyawa ini dilepaskan ke atmosfer, ekosistem perairan dan darat di mana mereka memiliki dampak multidimensional, menyebabkan efek merugikan pada berbagai bentuk bio melalui perubahan sifat fisikokimia dan struktur komunitas (Petrie et al., 2015; Bernhardt et al., 2017; Sarkar et al., 2020). Banyak polutan aromatik memiliki dampak yang kuat dan merusak pada banyak ekosistem/pusat keanekaragaman hayati yang masih utuh (misalnya terumbu karang, lapisan es Arktik/Antartika, danau pegunungan tinggi, sedimen laut dalam, dll.) (Jones 2010; Beyer et al. 2020; Nordborg et al. 2020). Studi geomikrobiologi terbaru menunjukkan bahwa pengendapan materi organik sintetis (misalnya polutan aromatik) dan turunannya pada permukaan struktur buatan (lingkungan binaan) (misalnya situs warisan budaya dan monumen yang terbuat dari granit, batu, kayu, dan logam) mempercepat degradasinya (Gadd 2017; Liu et al. 2018). Aktivitas manusia dapat memperintensifkan dan memperburuk degradasi biologis monumen dan bangunan melalui polusi udara dan perubahan iklim (Liu et al. 2020). Kontaminan organik ini bereaksi dengan uap air di atmosfer dan mengendap pada struktur, menyebabkan degradasi fisik dan kimia material. Biodegradasi secara luas diakui sebagai perubahan yang tidak diinginkan pada penampilan dan sifat material yang disebabkan oleh organisme hidup yang memengaruhi pelestariannya (Pochon dan Jaton, 1967). Aksi mikroba lebih lanjut (metabolisme) dari senyawa-senyawa ini dapat mengurangi integritas struktural, efektivitas konservasi, dan nilai budaya (Gadd, 2017; Liu dkk., 2018). Di sisi lain, dalam beberapa kasus, adaptasi dan respons mikroba terhadap struktur ini telah ditemukan bermanfaat karena membentuk biofilm dan lapisan pelindung lainnya yang mengurangi laju pembusukan/dekomposisi (Martino, 2016). Oleh karena itu, pengembangan strategi konservasi berkelanjutan jangka panjang yang efektif untuk monumen batu, logam, dan kayu membutuhkan pemahaman menyeluruh tentang proses-proses kunci yang terlibat dalam proses ini. Dibandingkan dengan proses alami (proses geologi, kebakaran hutan, letusan gunung berapi, reaksi tumbuhan dan bakteri), aktivitas manusia mengakibatkan pelepasan sejumlah besar hidrokarbon aromatik polisiklik (PAH) dan karbon organik (OC) lainnya ke dalam ekosistem. Banyak PAH yang digunakan dalam pertanian (insektisida dan pestisida seperti DDT, atrazin, karbaril, pentaklorofenol, dll.), industri (minyak mentah, lumpur/limbah minyak, plastik turunan minyak bumi, PCB, plasticizer, deterjen, disinfektan, fumigan, pewangi, dan pengawet), produk perawatan pribadi (tabir surya, disinfektan, penolak serangga, dan musk polisiklik), dan amunisi (bahan peledak seperti 2,4,6-TNT) adalah xenobiotik potensial yang dapat berdampak pada kesehatan planet (Srogi, 2007; Vamsee-Krishna dan Phale, 2008; Petrie dkk., 2015). Daftar ini dapat diperluas untuk mencakup senyawa turunan minyak bumi (minyak bakar, pelumas, aspalten), bioplastik dengan berat molekul tinggi, dan cairan ionik (Amde dkk., 2015). Tabel 1 mencantumkan berbagai polutan aromatik dan aplikasinya di berbagai industri. Dalam beberapa tahun terakhir, emisi antropogenik senyawa organik volatil, serta karbon dioksida dan gas rumah kaca lainnya, mulai meningkat (Dvorak et al., 2017). Namun, dampak antropogenik secara signifikan melebihi dampak alami. Selain itu, kami menemukan bahwa sejumlah SOC (Senyawa Organik Padat) bertahan di banyak lingkungan dan telah diidentifikasi sebagai polutan baru dengan efek buruk pada bioma (Gambar 1). Badan lingkungan seperti Badan Perlindungan Lingkungan Amerika Serikat (USEPA) telah memasukkan banyak polutan ini dalam daftar prioritas mereka karena sifat sitotoksik, genotoksik, mutagenik, dan karsinogeniknya. Oleh karena itu, diperlukan peraturan pembuangan yang ketat dan strategi efektif untuk pengolahan/pembuangan limbah dari ekosistem yang terkontaminasi. Berbagai metode pengolahan fisik dan kimia seperti pirolisis, pengolahan termal oksidatif, aerasi udara, penimbunan, pembakaran, dll., tidak efektif dan mahal serta menghasilkan produk sampingan yang korosif, beracun, dan sulit diolah. Dengan meningkatnya kesadaran lingkungan global, mikroorganisme yang mampu mendegradasi polutan ini dan turunannya (seperti halogenasi, nitro, alkil dan/atau metil) semakin menarik perhatian (Fennell et al., 2004; Haritash dan Kaushik, 2009; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020; Schwanemann et al., 2020). Penggunaan mikroorganisme kandidat asli ini sendiri atau dalam kultur campuran (koloni) untuk menghilangkan polutan aromatik memiliki keuntungan dalam hal keamanan lingkungan, biaya, efisiensi, efektivitas, dan keberlanjutan. Para peneliti juga mengeksplorasi integrasi proses mikroba dengan metode redoks elektrokimia, yaitu sistem bioelektrokimia (BES), sebagai teknologi yang menjanjikan untuk pengolahan/penghilangan polutan (Huang et al., 2011). Teknologi BES telah menarik perhatian yang semakin meningkat karena efisiensinya yang tinggi, biaya rendah, keamanan lingkungan, pengoperasian pada suhu ruangan, material yang biokompatibel, dan kemampuan untuk memulihkan produk sampingan yang berharga (misalnya, listrik, bahan bakar, dan bahan kimia) (Pant et al., 2012; Nazari et al., 2020). Munculnya pengurutan genom berkecepatan tinggi dan alat/metode omics telah memberikan banyak informasi baru tentang regulasi genetik, proteomik, dan fluksomi dari reaksi berbagai mikroorganisme pendegradasi. Menggabungkan alat-alat ini dengan biologi sistem telah lebih meningkatkan pemahaman kita tentang seleksi dan penyesuaian jalur katabolik target pada mikroorganisme (yaitu, desain metabolik) untuk mencapai biodegradasi yang efisien dan efektif. Untuk merancang strategi bioremediasi yang efektif menggunakan mikroorganisme kandidat yang sesuai, kita perlu memahami potensi biokimia, keragaman metabolik, komposisi genetik, dan ekologi (autoekologi/sinekologi) mikroorganisme.
Gambar 1. Sumber dan jalur PAH berbobot molekul rendah melalui berbagai lingkungan dan berbagai faktor yang memengaruhi biota. Garis putus-putus mewakili interaksi antar elemen ekosistem.
Dalam tinjauan ini, kami telah mencoba merangkum data tentang degradasi PAH sederhana seperti naftalena dan naftalena tersubstitusi oleh berbagai isolat bakteri yang mencakup jalur metabolisme dan keanekaragaman, enzim yang terlibat dalam degradasi, komposisi/kandungan gen dan keanekaragaman, respons seluler, dan berbagai aspek bioremediasi. Pemahaman pada tingkat biokimia dan molekuler akan membantu dalam mengidentifikasi strain inang yang sesuai dan rekayasa genetika lebih lanjut untuk bioremediasi polutan prioritas tersebut secara efektif. Hal ini akan membantu dalam mengembangkan strategi untuk pembentukan konsorsium bakteri spesifik lokasi untuk bioremediasi yang efektif.
Keberadaan sejumlah besar senyawa aromatik beracun dan berbahaya (yang memenuhi aturan Huckel 4n + 2π elektron, n = 1, 2, 3, …) menimbulkan ancaman serius bagi berbagai media lingkungan seperti udara, tanah, sedimen, dan air permukaan serta air tanah (Puglisi et al., 2007). Senyawa-senyawa ini memiliki cincin benzena tunggal (monosiklik) atau cincin benzena ganda (polisiklik) yang tersusun dalam bentuk linier, sudut, atau gugus dan menunjukkan stabilitas (stabilitas/ketidakstabilan) di lingkungan karena energi resonansi negatif yang tinggi dan kelembaman (inertness), yang dapat dijelaskan oleh hidrofobisitas dan keadaan tereduksinya. Ketika cincin aromatik digantikan lebih lanjut oleh gugus metil (-CH3), karboksil (-COOH), hidroksil (-OH), atau sulfonat (-HSO3), senyawa tersebut menjadi lebih stabil, memiliki afinitas yang lebih kuat terhadap makromolekul, dan bersifat bioakumulatif dalam sistem biologis (Seo et al., 2009; Phale et al., 2020). Beberapa hidrokarbon aromatik polisiklik berbobot molekul rendah (LMWAH), seperti naftalena dan turunannya [metilnaftalena, asam naftoat, naftalensulfonat, dan 1-naftil N-metilkarbamat (karbaril)], telah dimasukkan dalam daftar polutan organik prioritas oleh Badan Perlindungan Lingkungan AS karena bersifat genotoksik, mutagenik, dan/atau karsinogenik (Cerniglia, 1984). Pelepasan kelas NM-PAH ini ke lingkungan dapat mengakibatkan bioakumulasi senyawa-senyawa ini di semua tingkatan rantai makanan, sehingga memengaruhi kesehatan ekosistem (Binkova et al., 2000; Srogi, 2007; Quinn et al., 2009).
Sumber dan jalur PAH ke biota terutama melalui migrasi dan interaksi antara berbagai komponen ekosistem seperti tanah, air tanah, air permukaan, tanaman, dan atmosfer (Arey dan Atkinson, 2003). Gambar 1 menunjukkan interaksi dan distribusi berbagai PAH dengan berat molekul rendah dalam ekosistem dan jalurnya ke biota/paparan manusia. PAH diendapkan pada permukaan sebagai akibat dari polusi udara dan melalui migrasi (hanyutan) emisi kendaraan, gas buang industri (gasifikasi batubara, pembakaran, dan produksi kokas) dan pengendapannya. Aktivitas industri seperti pembuatan tekstil sintetis, pewarna dan cat; pengawetan kayu; pengolahan karet; kegiatan pembuatan semen; produksi pestisida; dan aplikasi pertanian merupakan sumber utama PAH dalam sistem terestrial dan akuatik (Bamforth dan Singleton, 2005; Wick dkk., 2011). Studi menunjukkan bahwa tanah di daerah pinggiran kota dan perkotaan, dekat jalan raya, dan di kota-kota besar lebih rentan terhadap hidrokarbon aromatik polisiklik (PAH) karena emisi dari pembangkit listrik, pemanasan perumahan, beban lalu lintas udara dan jalan, serta kegiatan konstruksi (Suman et al., 2016). (2008) menunjukkan bahwa PAH dalam tanah di dekat jalan di New Orleans, Louisiana, AS mencapai 7189 μg/kg, sedangkan di ruang terbuka, hanya 2404 μg/kg. Demikian pula, kadar PAH setinggi 300 μg/kg telah dilaporkan di daerah dekat lokasi gasifikasi batubara di beberapa kota di AS (Kanaly dan Harayama, 2000; Bamforth dan Singleton, 2005). Tanah dari berbagai kota di India seperti Delhi (Sharma et al., 2008), Agra (Dubey et al., 2014), Mumbai (Kulkarni dan Venkataraman, 2000) dan Visakhapatnam (Kulkarni et al., 2014) dilaporkan mengandung konsentrasi PAH yang tinggi. Senyawa aromatik lebih mudah terserap ke partikel tanah, bahan organik, dan mineral lempung, sehingga menjadi penyerap karbon utama dalam ekosistem (Srogi, 2007; Peng et al., 2008). Sumber utama PAH dalam ekosistem perairan adalah curah hujan (curah hujan basah/kering dan uap air), limpasan perkotaan, pembuangan air limbah, pengisian ulang air tanah, dll. (Srogi, 2007). Diperkirakan sekitar 80% PAH dalam ekosistem laut berasal dari curah hujan, sedimentasi, dan pembuangan limbah (Motelay-Massei et al., 2006; Srogi, 2007). Konsentrasi PAH yang lebih tinggi di air permukaan atau air lindi dari tempat pembuangan sampah padat akhirnya merembes ke air tanah, menimbulkan ancaman kesehatan masyarakat yang besar karena lebih dari 70% penduduk di Asia Selatan dan Tenggara mengonsumsi air tanah (Duttagupta et al., 2019). Sebuah studi baru-baru ini oleh Duttagupta et al. (2020) tentang analisis sungai (32) dan air tanah (235) dari Benggala Barat, India, menemukan bahwa diperkirakan 53% penduduk perkotaan dan 44% penduduk pedesaan (total 20 juta penduduk) mungkin terpapar naftalena (4,9–10,6 μg/L) dan turunannya. Pola penggunaan lahan yang berbeda dan peningkatan pengambilan air tanah dianggap sebagai faktor utama yang mengendalikan transportasi vertikal (adveksi) PAH dengan berat molekul rendah di bawah permukaan tanah. Limpasan pertanian, pembuangan air limbah perkotaan dan industri, serta pembuangan sampah padat telah ditemukan terpengaruh oleh PAH di daerah aliran sungai dan sedimen bawah permukaan tanah. Curah hujan atmosfer semakin memperburuk polusi PAH. Konsentrasi PAH dan turunan alkilnya yang tinggi (total 51 jenis) telah dilaporkan di sungai/daerah aliran sungai di seluruh dunia, seperti Sungai Fraser, Sungai Louan, Sungai Denso, Sungai Missouri, Sungai Anacostia, Sungai Ebro, dan Sungai Delaware (Yunker et al., 2002; Motelay-Massei et al., 2006; Li et al., 2010; Amoako et al., 2011; Kim et al., 2018). Di sedimen cekungan Sungai Gangga, naftalena dan fenantrena ditemukan sebagai yang paling signifikan (terdeteksi dalam 70% sampel) (Duttagupta et al., 2019). Selain itu, penelitian menunjukkan bahwa klorinasi air minum dapat menyebabkan pembentukan PAH teroksigenasi dan terklorinasi yang lebih beracun (Manoli dan Samara, 1999). PAH terakumulasi dalam sereal, buah-buahan, dan sayuran sebagai akibat penyerapan oleh tanaman dari tanah, air tanah, dan curah hujan yang terkontaminasi (Fismes et al., 2002). Banyak organisme akuatik seperti ikan, kerang, remis, dan udang terkontaminasi PAH melalui konsumsi makanan dan air laut yang terkontaminasi, serta melalui jaringan dan kulit (Mackay dan Fraser, 2000). Metode memasak/pengolahan seperti memanggang, membakar, mengasapi, menggoreng, mengeringkan, memanggang, dan memasak dengan arang juga dapat menyebabkan jumlah PAH yang signifikan dalam makanan. Hal ini sebagian besar bergantung pada pilihan bahan pengasapan, kandungan hidrokarbon fenolik/aromatik, prosedur memasak, jenis pemanas, kadar air, pasokan oksigen, dan suhu pembakaran (Guillén et al., 2000; Gomes et al., 2013). Hidrokarbon aromatik polisiklik (PAH) juga telah terdeteksi dalam susu pada berbagai konsentrasi (0,75–2,1 mg/L) (Girelli et al., 2014). Akumulasi PAH dalam makanan juga bergantung pada sifat fisikokimia makanan, sedangkan efek toksiknya terkait dengan fungsi fisiologis, aktivitas metabolisme, penyerapan, distribusi, dan distribusi dalam tubuh (Mechini et al., 2011).
Toksisitas dan efek berbahaya dari hidrokarbon aromatik polisiklik (PAH) telah diketahui sejak lama (Cherniglia, 1984). Hidrokarbon aromatik polisiklik berbobot molekul rendah (LMW-PAH) (dua hingga tiga cincin) dapat berikatan secara kovalen dengan berbagai makromolekul seperti DNA, RNA, dan protein serta bersifat karsinogenik (Santarelli et al., 2008). Karena sifat hidrofobiknya, PAH dipisahkan oleh membran lipid. Pada manusia, sitokrom P450 monooxygenase mengoksidasi PAH menjadi epoksida, beberapa di antaranya sangat reaktif (misalnya, baediol epoksida) dan dapat menyebabkan transformasi sel normal menjadi sel ganas (Marston et al., 2001). Selain itu, produk transformasi PAH seperti kuinon, fenol, epoksida, diol, dll., lebih toksik daripada senyawa induknya. Beberapa PAH dan intermediat metaboliknya dapat memengaruhi hormon dan berbagai enzim dalam metabolisme, sehingga berdampak buruk pada pertumbuhan, sistem saraf pusat, sistem reproduksi, dan sistem kekebalan tubuh (Swetha dan Phale, 2005; Vamsee-Krishna dkk., 2006; Oostingh dkk., 2008). Paparan jangka pendek terhadap PAH dengan berat molekul rendah telah dilaporkan menyebabkan gangguan fungsi paru-paru dan trombosis pada penderita asma serta meningkatkan risiko kanker kulit, paru-paru, kandung kemih, dan saluran pencernaan (Olsson dkk., 2010; Diggs dkk., 2011). Studi pada hewan juga menunjukkan bahwa paparan PAH dapat berdampak buruk pada fungsi dan perkembangan reproduksi serta dapat menyebabkan katarak, kerusakan ginjal dan hati, dan penyakit kuning. Berbagai produk biotransformasi PAH seperti diol, epoksida, kuinon, dan radikal bebas (kation) telah terbukti membentuk adduksi DNA. Adduksi stabil telah terbukti mengubah mesin replikasi DNA, sedangkan adduksi tidak stabil dapat mendepurinasi DNA (terutama menjadi adenin dan kadang-kadang menjadi guanin); keduanya dapat menghasilkan kesalahan yang menyebabkan mutasi (Schweigert et al. 2001). Selain itu, kuinon (benzo-/pan-) dapat menghasilkan spesies oksigen reaktif (ROS), menyebabkan kerusakan fatal pada DNA dan makromolekul lainnya, sehingga memengaruhi fungsi/kelangsungan hidup jaringan (Ewa dan Danuta 2017). Paparan kronis terhadap konsentrasi rendah pirena, bifenil, dan naftalena telah dilaporkan menyebabkan kanker pada hewan percobaan (Diggs et al. 2012). Karena toksisitasnya yang mematikan, pembersihan/pengangkatan PAH ini dari lokasi yang terdampak/terkontaminasi merupakan prioritas.
Berbagai metode fisik dan kimia telah digunakan untuk menghilangkan PAH dari lokasi/lingkungan yang terkontaminasi. Proses seperti pembakaran, deklorsinasi, oksidasi UV, fiksasi, dan ekstraksi pelarut memiliki banyak kekurangan, termasuk pembentukan produk sampingan beracun, kompleksitas proses, masalah keamanan dan regulasi, efisiensi rendah, dan biaya tinggi. Namun, biodegradasi mikroba (disebut bioremediasi) merupakan pendekatan alternatif yang menjanjikan yang melibatkan penggunaan mikroorganisme dalam bentuk kultur murni atau koloni. Dibandingkan dengan metode fisik dan kimia, proses ini ramah lingkungan, non-invasif, hemat biaya, dan berkelanjutan. Bioremediasi dapat dilakukan di lokasi yang terdampak (in situ) atau di lokasi yang disiapkan khusus (ex situ) dan oleh karena itu dianggap sebagai metode remediasi yang lebih berkelanjutan daripada metode fisik dan kimia tradisional (Juhasz dan Naidu, 2000; Andreoni dan Gianfreda, 2007; Megharaj dkk., 2011; Phale dkk., 2020; Sarkar dkk., 2020).
Memahami tahapan metabolisme mikroba yang terlibat dalam degradasi polutan aromatik memiliki implikasi ilmiah dan ekonomi yang sangat besar bagi keberlanjutan ekologi dan lingkungan. Diperkirakan 2,1 × 10¹⁸ gram karbon (C) tersimpan dalam sedimen dan senyawa organik (yaitu, minyak, gas alam, dan batubara, yaitu bahan bakar fosil) di seluruh dunia, memberikan kontribusi signifikan terhadap siklus karbon global. Namun, industrialisasi yang cepat, ekstraksi bahan bakar fosil, dan aktivitas manusia menguras cadangan karbon litosfer ini, melepaskan sekitar 5,5 × 10¹⁵ g karbon organik (sebagai polutan) ke atmosfer setiap tahunnya (Gonzalez-Gaya dkk., 2019). Sebagian besar karbon organik ini memasuki ekosistem darat dan laut melalui sedimentasi, transportasi, dan limpasan. Selain itu, polutan sintetis baru yang berasal dari bahan bakar fosil, seperti plastik, plasticizer, dan penstabil plastik (ftalat dan isomernya), sangat mencemari ekosistem laut, tanah, dan perairan serta biota di dalamnya, sehingga memperburuk risiko iklim global. Berbagai jenis mikroplastik, nanoplastik, fragmen plastik, dan produk monomer beracun yang berasal dari polietilen tereftalat (PET) telah terakumulasi di Samudra Pasifik antara Amerika Utara dan Asia Tenggara, membentuk "Great Pacific Garbage Patch" (Gugusan Sampah Pasifik Besar), yang membahayakan kehidupan laut (Newell dkk., 2020). Studi ilmiah telah membuktikan bahwa tidak mungkin untuk menghilangkan polutan/limbah tersebut dengan metode fisik atau kimia apa pun. Dalam konteks ini, mikroorganisme yang paling bermanfaat adalah mikroorganisme yang mampu memetabolisme polutan secara oksidatif menjadi karbon dioksida, energi kimia, dan produk sampingan non-toksik lainnya yang pada akhirnya memasuki proses siklus nutrisi lainnya (H, O, N, S, P, Fe, dll.). Dengan demikian, pemahaman tentang ekofisiologi mikroba dari mineralisasi polutan aromatik dan pengendalian lingkungannya sangat penting untuk menilai siklus karbon mikroba, anggaran karbon bersih, dan risiko iklim di masa depan. Mengingat kebutuhan mendesak untuk menghilangkan senyawa tersebut dari lingkungan, berbagai industri ramah lingkungan yang berfokus pada teknologi bersih telah muncul. Alternatifnya, pemanfaatan limbah industri/bahan kimia limbah yang terakumulasi dalam ekosistem (yaitu pendekatan limbah menjadi kekayaan) dianggap sebagai salah satu pilar ekonomi sirkular dan tujuan pembangunan berkelanjutan (Close et al., 2012). Oleh karena itu, pemahaman tentang aspek metabolik, enzimatik, dan genetik dari kandidat degradasi potensial ini sangat penting untuk penghapusan dan bioremediasi polutan aromatik tersebut secara efektif.
Di antara banyak polutan aromatik, kami memberikan perhatian khusus pada PAH berbobot molekul rendah seperti naftalena dan naftalena tersubstitusi. Senyawa-senyawa ini merupakan komponen utama bahan bakar turunan minyak bumi, pewarna tekstil, produk konsumen, pestisida (kapur barus dan penolak serangga), plasticizer, dan tanin, sehingga tersebar luas di banyak ekosistem (Preuss et al., 2003). Laporan terbaru menyoroti akumulasi konsentrasi naftalena dalam sedimen akuifer, air tanah dan tanah bawah permukaan, zona vadose, dan dasar sungai, yang menunjukkan bioakumulasinya di lingkungan (Duttagupta et al., 2019, 2020). Tabel 2 merangkum sifat fisikokimia, aplikasi, dan efek kesehatan naftalena dan turunannya. Dibandingkan dengan PAH berbobot molekul tinggi lainnya, naftalena dan turunannya kurang hidrofobik, lebih larut dalam air, dan tersebar luas di ekosistem, sehingga sering digunakan sebagai substrat model untuk mempelajari metabolisme, genetika, dan keanekaragaman metabolisme PAH. Sejumlah besar mikroorganisme mampu memetabolisme naftalena dan turunannya, dan informasi komprehensif tersedia tentang jalur metabolisme, enzim, dan fitur pengaturannya (Mallick et al., 2011; Phale et al., 2019, 2020). Selain itu, naftalena dan turunannya ditetapkan sebagai senyawa prototipe untuk penilaian pencemaran lingkungan karena kelimpahan dan bioavailabilitasnya yang tinggi. Badan Perlindungan Lingkungan AS memperkirakan bahwa kadar naftalena rata-rata adalah 5,19 μg per meter kubik dari asap rokok, terutama dari pembakaran tidak sempurna, dan 7,8 hingga 46 μg dari asap sampingan, sementara paparan kreosot dan naftalena 100 hingga 10.000 kali lebih tinggi (Preuss et al. 2003). Naftalena khususnya telah ditemukan memiliki toksisitas pernapasan dan karsinogenisitas spesifik spesies, wilayah, dan jenis kelamin. Berdasarkan studi hewan, Badan Internasional untuk Penelitian Kanker (IARC) telah mengklasifikasikan naftalena sebagai "kemungkinan karsinogen manusia" (Grup 2B)1. Paparan naftalena tersubstitusi, terutama melalui inhalasi atau pemberian parenteral (oral), menyebabkan cedera jaringan paru-paru dan meningkatkan kejadian tumor paru-paru pada tikus dan mencit (Program Toksikologi Nasional 2). Efek akutnya meliputi mual, muntah, sakit perut, diare, sakit kepala, kebingungan, keringat berlebihan, demam, takikardia, dan lain-lain. Di sisi lain, insektisida karbamat spektrum luas karbaril (1-naftil N-metilkarbamat) dilaporkan beracun bagi invertebrata air, amfibi, lebah madu, dan manusia, serta terbukti menghambat asetilkolinesterase yang menyebabkan kelumpuhan (Smulders et al., 2003; Bulen dan Distel, 2011). Oleh karena itu, pemahaman tentang mekanisme degradasi mikroba, regulasi genetik, reaksi enzimatik dan seluler sangat penting untuk mengembangkan strategi bioremediasi di lingkungan yang terkontaminasi.
Tabel 2. Informasi rinci tentang sifat fisikokimia, penggunaan, metode identifikasi, dan penyakit terkait naftalena dan turunannya.
Di lingkungan yang tercemar, polutan aromatik hidrofobik dan lipofilik dapat menyebabkan berbagai efek seluler pada mikrobioma lingkungan (komunitas), seperti perubahan fluiditas membran, permeabilitas membran, pembengkakan lapisan lipid, gangguan transfer energi (rantai transpor elektron/gaya gerak proton), dan aktivitas protein yang terkait dengan membran (Sikkema et al., 1995). Selain itu, beberapa zat perantara yang larut seperti katekol dan kuinon menghasilkan spesies oksigen reaktif (ROS) dan membentuk aduk dengan DNA dan protein (Penning et al., 1999). Dengan demikian, kelimpahan senyawa tersebut dalam ekosistem memberikan tekanan selektif pada komunitas mikroba untuk menjadi pendegradasi yang efisien pada berbagai tingkat fisiologis, termasuk penyerapan/transportasi, transformasi intraseluler, asimilasi/pemanfaatan, dan kompartementalisasi.
Penelusuran pada Ribosomal Database Project-II (RDP-II) mengungkapkan bahwa total 926 spesies bakteri diisolasi dari media atau kultur pengayaan yang terkontaminasi naftalena atau turunannya. Kelompok Proteobacteria memiliki jumlah perwakilan tertinggi (n = 755), diikuti oleh Firmicutes (52), Bacteroidetes (43), Actinobacteria (39), Tenericutes (10), dan bakteri yang tidak terklasifikasi (8) (Gambar 2). Perwakilan γ-Proteobacteria (Pseudomonadales dan Xanthomonadales) mendominasi semua kelompok Gram-negatif dengan kandungan G+C tinggi (54%), sedangkan Clostridiales dan Bacillales (30%) merupakan kelompok Gram-positif dengan kandungan G+C rendah. Pseudomonas (jumlah terbanyak, 338 spesies) dilaporkan mampu mendegradasi naftalena dan turunan metilnya di berbagai ekosistem yang tercemar (tar batubara, minyak bumi, minyak mentah, lumpur, tumpahan minyak, air limbah, limbah organik, dan tempat pembuangan sampah) serta di ekosistem yang utuh (tanah, sungai, sedimen, dan air tanah) (Gambar 2). Lebih lanjut, studi pengayaan dan analisis metagenomik di beberapa wilayah ini mengungkapkan bahwa spesies Legionella dan Clostridium yang belum dikultur mungkin memiliki kapasitas degradasi, menunjukkan perlunya mengkultur bakteri ini untuk mempelajari jalur baru dan keragaman metabolisme.
Gambar 2. Keragaman taksonomi dan distribusi ekologis perwakilan bakteri di lingkungan yang terkontaminasi naftalena dan turunan naftalena.
Di antara berbagai mikroorganisme pengurai hidrokarbon aromatik, sebagian besar mampu menguraikan naftalena sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi. Urutan kejadian yang terlibat dalam metabolisme naftalena telah dijelaskan untuk Pseudomonas sp. (galur: NCIB 9816-4, G7, AK-5, PMD-1 dan CSV86), Pseudomonas stutzeri AN10, Pseudomonas fluorescens PC20 dan galur lainnya (ND6 dan AS1) (Mahajan et al., 1994; Resnick et al., 1996; Annweiler et al., 2000; Basu et al., 2003; Dennis dan Zylstra, 2004; Sota et al., 2006; Metabolisme dimulai oleh dioksigenase multikomponen [naftalena dioksigenase (NDO), dioksigenase hidroksilasi cincin] yang mengkatalisis oksidasi salah satu cincin aromatik naftalena menggunakan oksigen molekuler sebagai substrat lainnya, mengubah naftalena menjadi cis-naftalenediol (Gambar 3). Cis-dihidrodiol diubah menjadi 1,2-dihidroksinaftalena didegradasi oleh dehidrogenase. Suatu dioksigenase pemecah cincin, 1,2-dihidroksinaftalena dioksigenase (12DHNDO), mengubah 1,2-dihidroksinaftalena menjadi asam 2-hidroksikromena-2-karboksilat. Isomerisasi cis-trans enzimatik menghasilkan trans-o-hidroksibenzilidenepiruvat, yang kemudian dipecah oleh hidratase aldolase menjadi salisilat aldehida dan piruvat. Asam organik piruvat adalah senyawa C3 pertama yang berasal dari kerangka karbon naftalena dan diarahkan ke jalur karbon sentral. Selain itu, dehidrogenase salisilaldehida yang bergantung pada NAD+ mengubah salisilaldehida menjadi asam salisilat. Metabolisme pada tahap ini disebut "jalur atas" degradasi naftalena. Jalur ini sangat umum pada sebagian besar bakteri pengurai naftalena. Namun, ada beberapa pengecualian; misalnya, pada Bacillus hamburgii termofilik. 2. Degradasi naftalena dimulai oleh naftalena 2,3-dioksigenase untuk membentuk 2,3-dihidroksinaftalena (Annweiler et al., 2000).
Gambar 3. Jalur degradasi naftalena, metilnaftalena, asam naftoat, dan karbaril. Angka yang dilingkari mewakili enzim yang bertanggung jawab atas konversi berurutan naftalena dan turunannya menjadi produk selanjutnya. 1 — naftalena dioksigenase (NDO); 2, cis-dihidrodiol dehidrogenase; 3, 1,2-dihidroksinaftalena dioksigenase; 4, 2-hidroksikromena-2-asam karboksilat isomerase; 5, trans-O-hidroksibenzilidenepiruvat hidratase aldolase; 6, salisilaldehid dehidrogenase; 7, salisilat 1-hidroksilase; 8, katekol 2,3-dioksigenase (C23DO); 9, 2-hidroksimukonat semialdehid dehidrogenase; 10, 2-oksopent-4-enoat hidratase; 11, 4-hidroksi-2-oksopentanoat aldolase; 12, asetaldehida dehidrogenase; 13, katekol-1,2-dioksigenase (C12DO); 14, mukonat sikloisomerase; 15, mukonolakton delta-isomerase; 16, β-ketoadipatenolakton hidrolase; 17, β-ketoadipat suksinil-CoA transferase; 18, β-ketoadipat-CoA tiolase; 19, suksinil-CoA: asetil-CoA suksiniltransferase; 20, salisilat 5-hidroksilase; 21 – gentisat 1,2-dioksigenase (GDO); 22, maleilpiruvat isomerase; 23, fumarilpiruvat hidrolase; 24, metilnaftalena hidroksilase (NDO); 25, hidroksimetilnaftalena dehidrogenase; 26, naftaldehida dehidrogenase; 27, 3-formilsalisilat oksidase; 28, hidroksiisophthalat dekarboksilase; 29, karbaril hidrolase (CH); 30, 1-naftol-2-hidroksilase.
Tergantung pada organisme dan susunan genetiknya, asam salisilat yang dihasilkan selanjutnya dimetabolisme baik melalui jalur katekol menggunakan salisilat 1-hidroksilase (S1H) atau melalui jalur gentisat menggunakan salisilat 5-hidroksilase (S5H) (Gambar 3). Karena asam salisilat merupakan perantara utama dalam metabolisme naftalena (jalur atas), langkah-langkah dari asam salisilat ke perantara TCA sering disebut sebagai jalur bawah, dan gen-gen tersebut diorganisasikan ke dalam satu operon. Umumnya terlihat bahwa gen-gen dalam operon jalur atas (nah) dan operon jalur bawah (sal) diatur oleh faktor pengatur umum; misalnya, NahR dan asam salisilat bertindak sebagai penginduksi, memungkinkan kedua operon untuk memetabolisme naftalena secara lengkap (Phale et al., 2019, 2020).
Selain itu, katekol dipecah secara siklik menjadi 2-hidroksimukonat semialdehida melalui jalur meta oleh katekol 2,3-dioksigenase (C23DO) (Yen et al., 1988) dan selanjutnya dihidrolisis oleh 2-hidroksimukonat semialdehida hidrolase untuk membentuk asam 2-hidroksipent-2,4-dienoat. 2-hidroksipent-2,4-dienoat kemudian diubah menjadi piruvat dan asetaldehida oleh hidratase (2-oksopent-4-enoat hidratase) dan aldolase (4-hidroksi-2-oksopentanoat aldolase) dan kemudian memasuki jalur karbon sentral (Gambar 3). Alternatifnya, katekol dipecah secara siklik menjadi cis,cis-mukonat melalui jalur orto oleh katekol 1,2-oksigenase (C12DO). Mukonat sikloisomerase, mukonolakton isomerase, dan β-ketoadipat-nollakton hidrolase mengubah cis,cis-mukonat menjadi 3-oksoadipat, yang memasuki jalur karbon sentral melalui suksinil-CoA dan asetil-CoA (Nozaki et al., 1968) (Gambar 3).
Dalam jalur gentisat (2,5-dihidroksibenzoat), cincin aromatik dibelah oleh gentisat 1,2-dioksigenase (GDO) untuk membentuk maleilpiruvat. Produk ini dapat dihidrolisis langsung menjadi piruvat dan malat, atau dapat diisomerisasi untuk membentuk fumarilpiruvat, yang kemudian dapat dihidrolisis menjadi piruvat dan fumarat (Larkin dan Day, 1986). Pilihan jalur alternatif telah diamati pada bakteri Gram-negatif dan Gram-positif pada tingkat biokimia dan genetik (Morawski dkk., 1997; Whyte dkk., 1997). Bakteri Gram-negatif (Pseudomonas) lebih memilih menggunakan asam salisilat, yang merupakan penginduksi metabolisme naftalena, dengan mendekarboksilasinya menjadi katekol menggunakan salisilat 1-hidroksilase (Gibson dan Subramanian, 1984). Di sisi lain, pada bakteri Gram-positif (Rhodococcus), salisilat 5-hidroksilase mengubah asam salisilat menjadi asam gentisat, sedangkan asam salisilat tidak memiliki efek induktif pada transkripsi gen naftalena (Grund et al., 1992) (Gambar 3).
Telah dilaporkan bahwa spesies seperti Pseudomonas CSV86, Oceanobacterium NCE312, Marinhomonas naphthotrophicus, Sphingomonas paucimobilis 2322, Vibrio cyclotrophus, Pseudomonas fluorescens LP6a, spesies Pseudomonas dan Mycobacterium dapat mendegradasi monomethylnaphthalene atau dimethylnaphthalene (Dean-Raymond dan Bartha, 1975; Cane dan Williams, 1982; Mahajan dkk., 1994; Dutta dkk., 1998; Hedlund dkk., 1999). Di antara mereka, jalur degradasi 1-methylnaphthalene dan 2-methylnaphthalene dari Pseudomonas sp. CSV86 telah dipelajari secara jelas pada tingkat biokimia dan enzimatik (Mahajan dkk., 1994). 1-Methylnaphthalene dimetabolisme melalui dua jalur. Pertama, cincin aromatik dihidroksilasi (cincin tak tersubstitusi dari metilnaftalena) untuk membentuk cis-1,2-dihidroksi-1,2-dihidro-8-metilnaftalena, yang selanjutnya dioksidasi menjadi metil salisilat dan metilkatekol, dan kemudian memasuki jalur karbon sentral setelah pemutusan cincin (Gambar 3). Jalur ini disebut "jalur sumber karbon". Pada "jalur detoksifikasi" kedua, gugus metil dapat dihidroksilasi oleh NDO untuk membentuk 1-hidroksimetilnaftalena, yang selanjutnya dioksidasi menjadi asam 1-naftoat dan diekskresikan ke dalam media kultur sebagai produk akhir. Studi menunjukkan bahwa strain CSV86 tidak mampu tumbuh pada asam 1- dan 2-naftoat sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi, yang mengkonfirmasi jalur detoksifikasinya (Mahajan dkk., 1994; Basu dkk., 2003). Pada 2-metilnaftalena, gugus metil mengalami hidroksilasi oleh hidroksilase untuk membentuk 2-hidroksimetilnaftalena. Selain itu, cincin naftalena yang tidak tersubstitusi mengalami hidroksilasi cincin untuk membentuk dihidrodiol, yang dioksidasi menjadi 4-hidroksimetilkatekol dalam serangkaian reaksi yang dikatalisis enzim dan memasuki jalur karbon sentral melalui jalur pemecahan cincin meta. Demikian pula, S. paucimobilis 2322 dilaporkan menggunakan NDO untuk menghidroksilasi 2-metilnaftalena, yang selanjutnya dioksidasi untuk membentuk metil salisilat dan metilkatekol (Dutta dkk., 1998).
Asam naftoat (tersubstitusi/tidak tersubstitusi) adalah produk sampingan detoksifikasi/biotransformasi yang terbentuk selama degradasi metilnaftalena, fenantrena, dan antrasena dan dilepaskan ke dalam media kultur bekas. Telah dilaporkan bahwa isolat tanah Stenotrophomonas maltophilia CSV89 mampu memetabolisme asam 1-naftoat sebagai sumber karbon (Phale et al., 1995). Metabolisme dimulai dengan dihidroksilasi cincin aromatik untuk membentuk 1,2-dihidroksi-8-karboksinaftalena. Diol yang dihasilkan dioksidasi menjadi katekol melalui 2-hidroksi-3-karboksibenzilidenepiruvat, asam 3-formilsalisilat, asam 2-hidroksiisophthalat, dan asam salisilat dan memasuki jalur karbon sentral melalui jalur pemecahan cincin meta (Gambar 3).
Carbaryl adalah pestisida naftil karbamat. Sejak Revolusi Hijau di India pada tahun 1970-an, penggunaan pupuk dan pestisida kimia telah menyebabkan peningkatan emisi hidrokarbon aromatik polisiklik (PAH) dari sumber non-titik pertanian (Pingali, 2012; Duttagupta dkk., 2020). Diperkirakan 55% (85.722.000 hektar) dari total lahan pertanian di India dirawat dengan pestisida kimia. Selama lima tahun terakhir (2015–2020), sektor pertanian India telah menggunakan rata-rata 55.000 hingga 60.000 ton pestisida setiap tahunnya (Departemen Koperasi dan Kesejahteraan Petani, Kementerian Pertanian, Pemerintah India, Agustus 2020). Di dataran Gangga utara dan tengah (negara bagian dengan populasi dan kepadatan penduduk tertinggi), penggunaan pestisida pada tanaman sangat luas, dengan insektisida sebagai yang paling dominan. Carbaryl (1-naftil-N-metilkarbamat) adalah insektisida karbamat spektrum luas dengan toksisitas sedang hingga tinggi yang digunakan dalam pertanian India dengan rata-rata 100–110 ton. Insektisida ini umumnya dijual dengan nama dagang Sevin dan digunakan untuk mengendalikan serangga (kutu daun, semut api, kutu, tungau, laba-laba, dan banyak hama luar ruangan lainnya) yang menyerang berbagai tanaman (jagung, kedelai, kapas, buah-buahan, dan sayuran). Beberapa mikroorganisme seperti Pseudomonas (NCIB 12042, 12043, C4, C5, C6, C7, Pseudomonas putida XWY-1), Rhodococcus (NCIB 12038), Sphingobacterium spp. (CF06), Burkholderia (C3), Micrococcus, dan Arthrobacter juga dapat digunakan untuk mengendalikan hama lainnya. Telah dilaporkan bahwa RC100 dapat mendegradasi karbaril (Larkin dan Day, 1986; Chapalamadugu dan Chaudhry, 1991; Hayatsu dkk., 1999; Swetha dan Phale, 2005; Trivedi dkk., 2017). Jalur degradasi karbaril telah dipelajari secara ekstensif pada tingkat biokimia, enzimatik, dan genetik pada isolat tanah Pseudomonas sp. Strain C4, C5, dan C6 (Swetha dan Phale, 2005; Trivedi dkk., 2016) (Gambar 3). Jalur metabolisme dimulai dengan hidrolisis ikatan ester oleh karbaril hidrolase (CH) untuk membentuk 1-naftol, metilamina, dan karbon dioksida. 1-naftol kemudian diubah menjadi 1,2-dihidroksinaftalena oleh 1-naftol hidroksilase (1-NH), yang selanjutnya dimetabolisme melalui jalur karbon sentral melalui salisilat dan gentisat. Beberapa bakteri pengurai karbaril dilaporkan memetabolisme senyawa ini menjadi asam salisilat melalui pemutusan cincin orto katekol (Larkin dan Day, 1986; Chapalamadugu dan Chaudhry, 1991). Perlu dicatat, bakteri pengurai naftalena terutama memetabolisme asam salisilat melalui katekol, sedangkan bakteri pengurai karbaril lebih memilih memetabolisme asam salisilat melalui jalur gentisat.
Turunan asam naftalensulfonat/asam disulfonat dan asam naftilaminasulfonat dapat digunakan sebagai zat perantara dalam produksi pewarna azo, zat pembasah, dispersan, dll. Meskipun senyawa-senyawa ini memiliki toksisitas rendah terhadap manusia, penilaian sitotoksisitas menunjukkan bahwa senyawa-senyawa ini mematikan bagi ikan, daphnia, dan alga (Greim dkk., 1994). Perwakilan dari genus Pseudomonas (galur A3, C22) dilaporkan memulai metabolisme dengan hidroksilasi ganda cincin aromatik yang mengandung gugus asam sulfonat untuk membentuk dihidrodiol, yang selanjutnya diubah menjadi 1,2-dihidroksinaftalena melalui pemutusan spontan gugus sulfit (Brilon dkk., 1981). 1,2-dihidroksinaftalena yang dihasilkan dikatabolisme melalui jalur naftalena klasik, yaitu jalur katekol atau gentisat (Gambar 4). Telah ditunjukkan bahwa asam aminonaftalensulfonat dan asam hidroksinaftalensulfonat dapat sepenuhnya didegradasi oleh konsorsium bakteri campuran dengan jalur katabolik komplementer (Nortemann et al., 1986). Telah ditunjukkan bahwa satu anggota konsorsium mendesulfurisasi asam aminonaftalensulfonat atau asam hidroksinaftalensulfonat melalui 1,2-dioksigenasi, sementara aminosalisilat atau hidroksisalisilat dilepaskan ke dalam media kultur sebagai metabolit buntu dan kemudian diambil oleh anggota konsorsium lainnya. Asam naftalendisulfonat relatif polar tetapi sulit didegradasi secara hayati dan oleh karena itu dapat dimetabolisme melalui jalur yang berbeda. Desulfurisasi pertama terjadi selama dihidroksilasi regioselektif cincin aromatik dan gugus asam sulfonat; Desulfurisasi kedua terjadi selama hidroksilasi asam 5-sulfosalisilat oleh salisilat asam 5-hidroksilase untuk membentuk asam gentisat, yang memasuki jalur karbon sentral (Brilon et al., 1981) (Gambar 4). Enzim yang bertanggung jawab untuk degradasi naftalena juga bertanggung jawab untuk metabolisme naftalena sulfonat (Brilon et al., 1981; Keck et al., 2006).
Gambar 4. Jalur metabolisme untuk degradasi naftalena sulfonat. Angka di dalam lingkaran mewakili enzim yang bertanggung jawab untuk metabolisme naftil sulfonat, serupa/identik dengan enzim yang dijelaskan pada Gambar 3.
PAH dengan berat molekul rendah (LMW-PAH) bersifat reduktif, hidrofobik, dan kurang larut, sehingga tidak rentan terhadap penguraian/degradasi alami. Namun, mikroorganisme aerobik mampu mengoksidasinya dengan menyerap oksigen molekuler (O2). Enzim-enzim ini terutama termasuk dalam kelas oksidoreduktase dan dapat melakukan berbagai reaksi seperti hidroksilasi cincin aromatik (mono- atau dihidroksilasi), dehidrogenasi, dan pemutusan cincin aromatik. Produk yang diperoleh dari reaksi-reaksi ini berada dalam keadaan oksidasi yang lebih tinggi dan lebih mudah dimetabolisme melalui jalur karbon sentral (Phale et al., 2020). Enzim-enzim dalam jalur degradasi dilaporkan dapat diinduksi. Aktivitas enzim-enzim ini sangat rendah atau dapat diabaikan ketika sel-sel ditumbuhkan pada sumber karbon sederhana seperti glukosa atau asam organik. Tabel 3 merangkum berbagai enzim (oksigenase, hidrolase, dehidrogenase, oksidase, dll.) yang terlibat dalam metabolisme naftalena dan turunannya.
Tabel 3. Karakteristik biokimia enzim yang bertanggung jawab atas degradasi naftalena dan turunannya.
Studi radioisotop (18O2) telah menunjukkan bahwa penggabungan molekul O2 ke dalam cincin aromatik oleh oksigenase merupakan langkah terpenting dalam mengaktifkan biodegradasi lebih lanjut suatu senyawa (Hayaishi et al., 1955; Mason et al., 1955). Penggabungan satu atom oksigen (O) dari molekul oksigen (O2) ke dalam substrat dimulai oleh monooxygenase endogen atau eksogen (juga disebut hidroksilase). Atom oksigen lainnya direduksi menjadi air. Monooxygenase eksogen mereduksi flavin dengan NADH atau NADPH, sedangkan pada endomonooxygenase flavin direduksi oleh substrat. Posisi hidroksilasi menghasilkan keragaman dalam pembentukan produk. Misalnya, salisilat 1-hidroksilase menghidroksilasi asam salisilat pada posisi C1, membentuk katekol. Di sisi lain, salisilat 5-hidroksilase multikomponen (yang mengandung subunit reduktase, ferredoksin, dan oksigenase) menghidroksilasi asam salisilat pada posisi C5, membentuk asam gentisat (Yamamoto et al., 1965).
Dioksigenase menggabungkan dua atom O2 ke dalam substrat. Tergantung pada produk yang terbentuk, enzim ini dibagi menjadi dioksigenase hidroksilasi cincin dan dioksigenase pemecah cincin. Dioksigenase hidroksilasi cincin mengubah substrat aromatik menjadi cis-dihidrodiol (misalnya, naftalena) dan tersebar luas di antara bakteri. Hingga saat ini, telah ditunjukkan bahwa organisme yang mengandung dioksigenase hidroksilasi cincin mampu tumbuh pada berbagai sumber karbon aromatik, dan enzim ini diklasifikasikan sebagai NDO (naftalena), toluena dioksigenase (TDO, toluena), dan bifenil dioksigenase (BPDO, bifenil). Baik NDO maupun BPDO dapat mengkatalisis oksidasi ganda dan hidroksilasi rantai samping dari berbagai hidrokarbon aromatik polisiklik (toluena, nitrotoluena, xilena, etilbenzena, naftalena, bifenil, fluorena, indol, metilnaftalena, naftalensulfonat, fenantrena, antrasena, asetofenon, dll.) (Boyd dan Sheldrake, 1998; Phale dkk., 2020). NDO adalah sistem multikomponen yang terdiri dari oksidoreduktase, ferredoksin, dan komponen oksigenase yang mengandung situs aktif (Gibson dan Subramanian, 1984; Resnick dkk., 1996). Unit katalitik NDO terdiri dari subunit α besar dan subunit β kecil yang tersusun dalam konfigurasi α3β3. NDO termasuk dalam keluarga besar oksigenase dan subunit α-nya mengandung situs Rieske [2Fe-2S] dan besi non-heme mononuklir, yang menentukan spesifisitas substrat NDO (Parales et al., 1998). Biasanya, dalam satu siklus katalitik, dua elektron dari reduksi nukleotida piridin ditransfer ke ion Fe(II) di situs aktif melalui reduktase, ferredoksin, dan situs Rieske. Ekuivalen pereduksi mengaktifkan oksigen molekuler, yang merupakan prasyarat untuk dihidroksilasi substrat (Ferraro et al., 2005). Hingga saat ini, hanya beberapa NDO yang telah dimurnikan dan dikarakterisasi secara detail dari berbagai strain dan kontrol genetik jalur yang terlibat dalam degradasi naftalena telah dipelajari secara detail (Resnick et al., 1996; Parales et al., 1998; Karlsson et al., 2003). Dioksigenase pemecah cincin (enzim pemecah cincin endo- atau orto- dan enzim pemecah cincin eksodiol- atau meta-) bekerja pada senyawa aromatik terhidroksilasi. Misalnya, dioksigenase pemecah cincin orto adalah katekol-1,2-dioksigenase, sedangkan dioksigenase pemecah cincin meta adalah katekol-2,3-dioksigenase (Kojima dkk., 1961; Nozaki dkk., 1968). Selain berbagai oksigenase, terdapat juga berbagai dehidrogenase yang bertanggung jawab untuk dehidrogenasi dihidrodiol aromatik, alkohol, dan aldehida serta menggunakan NAD+/NADP+ sebagai akseptor elektron, yang merupakan beberapa enzim penting yang terlibat dalam metabolisme (Gibson dan Subramanian, 1984; Shaw dan Harayama, 1990; Fahle dkk., 2020).
Enzim seperti hidrolase (esterase, amidase) merupakan kelas enzim penting kedua yang menggunakan air untuk memutus ikatan kovalen dan menunjukkan spesifisitas substrat yang luas. Karbaril hidrolase dan hidrolase lainnya dianggap sebagai komponen periplasma (transmembran) pada anggota bakteri Gram-negatif (Kamini et al., 2018). Karbaril memiliki ikatan amida dan ester; oleh karena itu, ia dapat dihidrolisis oleh esterase atau amidase untuk membentuk 1-naftol. Karbaril pada strain Rhizobium rhizobium AC10023 dan strain Arthrobacter RC100 dilaporkan berfungsi sebagai esterase dan amidase, masing-masing. Karbaril pada strain Arthrobacter RC100 juga berfungsi sebagai amidase. RC100 telah terbukti menghidrolisis empat insektisida kelas N-metilkarbamat seperti karbaril, metomil, asam mefenamat, dan XMC (Hayaatsu et al., 2001). Dilaporkan bahwa CH pada Pseudomonas sp. C5pp dapat bekerja pada karbaril (aktivitas 100%) dan 1-naftil asetat (aktivitas 36%), tetapi tidak pada 1-naftilasetamida, yang menunjukkan bahwa enzim tersebut merupakan esterase (Trivedi et al., 2016).
Studi biokimia, pola regulasi enzim, dan analisis genetik telah menunjukkan bahwa gen degradasi naftalena terdiri dari dua unit pengatur yang dapat diinduksi atau "operon": nah ("jalur hulu", mengubah naftalena menjadi asam salisilat) dan sal ("jalur hilir", mengubah asam salisilat ke jalur karbon sentral melalui katekol). Asam salisilat dan analognya dapat bertindak sebagai penginduksi (Shamsuzzaman dan Barnsley, 1974). Dengan adanya glukosa atau asam organik, operon tersebut ditekan. Gambar 5 menunjukkan organisasi genetik lengkap degradasi naftalena (dalam bentuk operon). Beberapa varian/bentuk gen nah (ndo/pah/dox) telah dijelaskan dan ditemukan memiliki homologi sekuens yang tinggi (90%) di antara semua spesies Pseudomonas (Abbasian dkk., 2016). Gen-gen jalur hulu naftalena umumnya disusun dalam urutan konsensus seperti yang ditunjukkan pada Gambar 5A. Gen lain, nahQ, juga dilaporkan terlibat dalam metabolisme naftalena dan biasanya terletak di antara nahC dan nahE, tetapi fungsi sebenarnya masih perlu diklarifikasi. Demikian pula, gen nahY, yang bertanggung jawab atas kemotaksis sensitif naftalena, ditemukan di ujung distal operon nah pada beberapa anggota. Pada Ralstonia sp., gen U2 yang mengkode glutathione S-transferase (gsh) ditemukan terletak di antara nahAa dan nahAb tetapi tidak memengaruhi karakteristik pemanfaatan naftalena (Zylstra et al., 1997).
Gambar 5. Organisasi genetik dan keragaman yang diamati selama degradasi naftalena di antara spesies bakteri; (A) Jalur naftalena atas, metabolisme naftalena menjadi asam salisilat; (B) Jalur naftalena bawah, asam salisilat melalui katekol ke jalur karbon sentral; (C) asam salisilat melalui gentisat ke jalur karbon sentral.
“Jalur bawah” (operon sal) biasanya terdiri dari nahGTHINLMOKJ dan mengubah salisilat menjadi piruvat dan asetaldehida melalui jalur pemecahan metaring katekol. Gen nahG (yang mengkode salisilat hidroksilase) ditemukan terkonservasi di ujung proksimal operon (Gambar 5B). Dibandingkan dengan strain pengurai naftalena lainnya, pada P. putida CSV86 operon nah dan sal bersifat tandem dan sangat terkait erat (sekitar 7,5 kb). Pada beberapa bakteri Gram-negatif, seperti Ralstonia sp. U2, Polaromonas naphthalenivorans CJ2, dan P. putida AK5, naftalena dimetabolisme sebagai metabolit karbon sentral melalui jalur gentisat (dalam bentuk operon sgp/nag). Kaset gen biasanya direpresentasikan dalam bentuk nagAaGHAbAcAdBFCQEDJI, di mana nagR (yang mengkode regulator tipe LysR) terletak di ujung atas (Gambar 5C).
Karbaril memasuki siklus karbon sentral melalui metabolisme 1-naftol, 1,2-dihidroksinaftalena, asam salisilat, dan asam gentisat (Gambar 3). Berdasarkan studi genetik dan metabolik, telah diusulkan untuk membagi jalur ini menjadi "hulu" (konversi karbaril menjadi asam salisilat), "tengah" (konversi asam salisilat menjadi asam gentisat), dan "hilir" (konversi asam gentisat menjadi intermediet jalur karbon sentral) (Singh et al., 2013). Analisis genomik C5pp (superkontig A, 76,3 kb) mengungkapkan bahwa gen mcbACBDEF terlibat dalam konversi karbaril menjadi asam salisilat, diikuti oleh mcbIJKL dalam konversi asam salisilat menjadi asam gentisat, dan mcbOQP dalam konversi asam gentisat menjadi intermediat karbon pusat (fumarat dan piruvat, Trivedi et al., 2016) (Gambar 6).
Telah dilaporkan bahwa enzim yang terlibat dalam degradasi hidrokarbon aromatik (termasuk naftalena dan asam salisilat) dapat diinduksi oleh senyawa terkait dan dihambat oleh sumber karbon sederhana seperti glukosa atau asam organik (Shingler, 2003; Phale et al., 2019, 2020). Di antara berbagai jalur metabolisme naftalena dan turunannya, fitur pengaturan naftalena dan karbaril telah dipelajari sampai batas tertentu. Untuk naftalena, gen di jalur hulu dan hilir diatur oleh NahR, regulator positif trans-acting tipe LysR. Hal ini diperlukan untuk induksi gen nah oleh asam salisilat dan ekspresi tingkat tinggi selanjutnya (Yen dan Gunsalus, 1982). Lebih lanjut, penelitian menunjukkan bahwa faktor inang integratif (IHF) dan XylR (regulator transkripsi yang bergantung pada sigma 54) juga penting untuk aktivasi transkripsi gen dalam metabolisme naftalena (Ramos et al., 1997). Penelitian telah menunjukkan bahwa enzim jalur pembukaan cincin meta katekol, yaitu katekol 2,3-dioksigenase, diinduksi dengan adanya naftalena dan/atau asam salisilat (Basu dkk., 2006). Penelitian juga menunjukkan bahwa enzim jalur pembukaan cincin orto katekol, yaitu katekol 1,2-dioksigenase, diinduksi dengan adanya asam benzoat dan cis,cis-mukonat (Parsek dkk., 1994; Tover dkk., 2001).
Pada strain C5pp, lima gen, mcbG, mcbH, mcbN, mcbR, dan mcbS, mengkode regulator yang termasuk dalam famili regulator transkripsi LysR/TetR yang bertanggung jawab untuk mengendalikan degradasi karbaril. Gen homolog mcbG ditemukan paling dekat hubungannya dengan regulator tipe LysR PhnS (identitas asam amino 58%) yang terlibat dalam metabolisme fenantrena pada Burkholderia RP00725 (Trivedi dkk., 2016). Gen mcbH ditemukan terlibat dalam jalur perantara (konversi asam salisilat menjadi asam gentisat) dan termasuk dalam regulator transkripsi tipe LysR NagR/DntR/NahR pada Pseudomonas dan Burkholderia. Anggota famili ini dilaporkan mengenali asam salisilat sebagai molekul efektor spesifik untuk induksi gen degradasi. Di sisi lain, tiga gen, mcbN, mcbR dan mcbS, yang termasuk dalam regulator transkripsi tipe LysR dan TetR, diidentifikasi dalam jalur hilir (metabolit jalur gentisat-karbon sentral).
Pada prokariota, proses transfer gen horizontal (akuisisi, pertukaran, atau transfer) melalui plasmid, transposon, profag, pulau genomik, dan elemen konjugatif integratif (ICE) merupakan penyebab utama plastisitas dalam genom bakteri, yang mengarah pada perolehan atau kehilangan fungsi/sifat spesifik. Hal ini memungkinkan bakteri untuk beradaptasi dengan cepat terhadap kondisi lingkungan yang berbeda, memberikan potensi keuntungan metabolik adaptif bagi inang, seperti degradasi senyawa aromatik. Perubahan metabolik sering dicapai melalui penyesuaian halus operon degradasi, mekanisme pengaturannya, dan spesifisitas enzim, yang memfasilitasi degradasi berbagai senyawa aromatik (Nojiri et al., 2004; Phale et al., 2019, 2020). Kaset gen untuk degradasi naftalena telah ditemukan terletak pada berbagai elemen bergerak seperti plasmid (konjugatif dan non-konjugatif), transposon, genom, ICE, dan kombinasi spesies bakteri yang berbeda (Gambar 5). Pada Pseudomonas G7, operon nah dan sal dari plasmid NAH7 ditranskripsikan dalam orientasi yang sama dan merupakan bagian dari transposon defektif yang membutuhkan transposase Tn4653 untuk mobilisasi (Sota et al., 2006). Pada strain Pseudomonas NCIB9816-4, gen tersebut ditemukan pada plasmid konjugatif pDTG1 sebagai dua operon (berjarak sekitar 15 kb) yang ditranskripsikan dalam arah yang berlawanan (Dennis dan Zylstra, 2004). Pada strain Pseudomonas putida AK5, plasmid non-konjugatif pAK5 mengkodekan enzim yang bertanggung jawab untuk degradasi naftalena melalui jalur gentisat (Izmalkova et al., 2013). Pada strain Pseudomonas PMD-1, operon nah terletak pada kromosom, sedangkan operon sal terletak pada plasmid konjugatif pMWD-1 (Zuniga et al., 1981). Namun, pada Pseudomonas stutzeri AN10, semua gen degradasi naftalena (operon nah dan sal) terletak pada kromosom dan diduga direkrut melalui peristiwa transposisi, rekombinasi, dan penataan ulang (Bosch et al., 2000). Pada Pseudomonas sp. CSV86, operon nah dan sal terletak di genom dalam bentuk ICE (ICECSV86). Struktur tersebut dilindungi oleh tRNAGly yang diikuti oleh pengulangan langsung yang menunjukkan situs rekombinasi/perlekatan (attR dan attL) dan integrase mirip fage yang terletak di kedua ujung tRNAGly, sehingga secara struktural mirip dengan elemen ICEclc (ICEclcB13 pada Pseudomonas knackmusii untuk degradasi klorokatekol). Telah dilaporkan bahwa gen pada ICE dapat ditransfer melalui konjugasi dengan frekuensi transfer yang sangat rendah (10-8), sehingga mentransfer sifat degradasi ke penerima (Basu dan Phale, 2008; Phale dkk., 2019).
Sebagian besar gen yang bertanggung jawab untuk degradasi karbaril terletak pada plasmid. Arthrobacter sp. RC100 mengandung tiga plasmid (pRC1, pRC2, dan pRC300) yang dua di antaranya merupakan plasmid konjugatif, pRC1 dan pRC2, yang mengkodekan enzim yang mengubah karbaril menjadi gentisat. Di sisi lain, enzim yang terlibat dalam konversi gentisat menjadi metabolit karbon sentral terletak pada kromosom (Hayaatsu et al., 1999). Bakteri dari genus Rhizobium. Strain AC100, yang digunakan untuk konversi karbaril menjadi 1-naftol, mengandung plasmid pAC200, yang membawa gen cehA yang mengkode CH sebagai bagian dari transposon Tnceh yang dikelilingi oleh sekuens mirip elemen insersi (istA dan istB) (Hashimoto et al., 2002). Pada strain Sphingomonas CF06, gen degradasi karbaril diyakini terdapat dalam lima plasmid: pCF01, pCF02, pCF03, pCF04, dan pCF05. Homologi DNA plasmid-plasmid ini tinggi, menunjukkan adanya peristiwa duplikasi gen (Feng et al., 1997). Pada simbion pendegradasi karbaril yang terdiri dari dua spesies Pseudomonas, strain 50581 mengandung plasmid konjugatif pCD1 (50 kb) yang mengkode gen hidrolase karbaril mcd, sedangkan plasmid konjugatif pada strain 50552 mengkode enzim pendegradasi 1-naftol (Chapalamadugu dan Chaudhry, 1991). Pada strain Achromobacter WM111, gen mcd furadan hidrolase terletak pada plasmid 100 kb (pPDL11). Gen ini telah terbukti hadir pada plasmid yang berbeda (100, 105, 115 atau 124 kb) pada bakteri yang berbeda dari berbagai wilayah geografis (Parekh et al., 1995). Pada Pseudomonas sp. C5pp, semua gen yang bertanggung jawab untuk degradasi karbaril terletak dalam genom yang mencakup 76,3 kb urutan (Trivedi et al., 2016). Analisis genom (6,15 Mb) mengungkapkan keberadaan 42 MGE dan 36 GEI, di mana 17 MGE terletak di superkontig A (76,3 kb) dengan kandungan G+C asimetris rata-rata (54–60 mol%), menunjukkan kemungkinan peristiwa transfer gen horizontal (Trivedi et al., 2016). P. putida XWY-1 menunjukkan susunan gen pengurai karbaril yang serupa, tetapi gen-gen ini terletak pada plasmid (Zhu et al., 2019).
Selain efisiensi metabolisme pada tingkat biokimia dan genomik, mikroorganisme juga menunjukkan sifat atau respons lain seperti kemotaksis, sifat modifikasi permukaan sel, kompartementalisasi, pemanfaatan preferensial, produksi biosurfaktan, dll., yang membantu mereka memetabolisme polutan aromatik secara lebih efisien di lingkungan yang terkontaminasi (Gambar 7).
Gambar 7. Berbagai strategi respons seluler bakteri pengurai hidrokarbon aromatik ideal untuk biodegradasi senyawa polutan asing yang efisien.
Respons kemotaksis dianggap sebagai faktor yang meningkatkan degradasi polutan organik dalam ekosistem yang tercemar secara heterogen. (2002) menunjukkan bahwa kemotaksis Pseudomonas sp. G7 terhadap naftalena meningkatkan laju degradasi naftalena dalam sistem perairan. Strain tipe liar G7 mendegradasi naftalena jauh lebih cepat daripada strain mutan yang kekurangan kemotaksis. Protein NahY (538 asam amino dengan topologi membran) ditemukan ditranskripsikan bersama dengan gen jalur metacleavage pada plasmid NAH7, dan seperti transduser kemotaksis, protein ini tampaknya berfungsi sebagai kemoreseptor untuk degradasi naftalena (Grimm dan Harwood 1997). Studi lain oleh Hansel dkk. (2009) menunjukkan bahwa protein tersebut bersifat kemotaksis, tetapi laju degradasinya tinggi. (2011) mendemonstrasikan respons kemotaktik Pseudomonas (P. putida) terhadap naftalena gas, di mana difusi fase gas menghasilkan aliran naftalena yang stabil ke sel, yang mengendalikan respons kemotaktik sel. Para peneliti memanfaatkan perilaku kemotaktik ini untuk merekayasa mikroba yang akan meningkatkan laju degradasi. Studi telah menunjukkan bahwa jalur kemoreseptor juga mengatur fungsi seluler lainnya seperti pembelahan sel, regulasi siklus sel, dan pembentukan biofilm, sehingga membantu mengendalikan laju degradasi. Namun, memanfaatkan sifat ini (kemotaksis) untuk degradasi yang efisien terhambat oleh beberapa kendala. Hambatan utama adalah: (a) reseptor paralog yang berbeda mengenali senyawa/ligan yang sama; (b) keberadaan reseptor alternatif, yaitu tropisme energi; (c) perbedaan urutan yang signifikan dalam domain sensorik dari famili reseptor yang sama; dan (d) kurangnya informasi tentang protein sensor bakteri utama (Ortega et al., 2017; Martin-Mora et al., 2018). Terkadang, biodegradasi hidrokarbon aromatik menghasilkan beberapa metabolit/intermediat, yang mungkin bersifat kemotaktik untuk satu kelompok bakteri tetapi bersifat repulsif untuk kelompok bakteri lain, sehingga semakin memperumit proses tersebut. Untuk mengidentifikasi interaksi ligan (hidrokarbon aromatik) dengan reseptor kimia, kami membangun protein sensor hibrida (PcaY, McfR, dan NahY) dengan menggabungkan domain sensor dan pensinyalan dari Pseudomonas putida dan Escherichia coli, yang masing-masing menargetkan reseptor untuk asam aromatik, intermediat TCA, dan naftalena (Luu et al., 2019).
Di bawah pengaruh naftalena dan hidrokarbon aromatik polisiklik (PAH) lainnya, struktur membran bakteri dan integritas mikroorganisme mengalami perubahan signifikan. Studi menunjukkan bahwa naftalena mengganggu interaksi rantai asil melalui interaksi hidrofobik, sehingga meningkatkan pembengkakan dan fluiditas membran (Sikkema dkk., 1995). Untuk melawan efek merugikan ini, bakteri mengatur fluiditas membran dengan mengubah rasio dan komposisi asam lemak antara asam lemak rantai bercabang iso/anteiso dan mengisomerisasi asam lemak tak jenuh cis menjadi isomer trans yang sesuai (Heipieper dan de Bont, 1994). Pada Pseudomonas stutzeri yang ditumbuhkan dengan perlakuan naftalena, rasio asam lemak jenuh terhadap tak jenuh meningkat dari 1,1 menjadi 2,1, sedangkan pada Pseudomonas JS150 rasio ini meningkat dari 7,5 menjadi 12,0 (Mrozik dkk., 2004). Ketika ditumbuhkan pada naftalena, sel Achromobacter KAs 3–5 menunjukkan agregasi sel di sekitar kristal naftalena dan penurunan muatan permukaan sel (dari -22,5 menjadi -2,5 mV) disertai dengan kondensasi sitoplasma dan vakuolisasi, yang menunjukkan perubahan struktur sel dan sifat permukaan sel (Mohapatra dkk., 2019). Meskipun perubahan seluler/permukaan secara langsung terkait dengan penyerapan polutan aromatik yang lebih baik, strategi bioteknologi yang relevan belum dioptimalkan secara menyeluruh. Manipulasi bentuk sel jarang digunakan untuk mengoptimalkan proses biologis (Volke dan Nikel, 2018). Penghapusan gen yang memengaruhi pembelahan sel menyebabkan perubahan morfologi sel. Pada Bacillus subtilis, protein septum sel SepF telah terbukti terlibat dalam pembentukan septum dan diperlukan untuk langkah-langkah pembelahan sel selanjutnya, tetapi bukan merupakan gen esensial. Penghapusan gen yang mengkode peptida glikan hidrolase pada Bacillus subtilis menghasilkan pemanjangan sel, peningkatan laju pertumbuhan spesifik, dan peningkatan kapasitas produksi enzim (Cui et al., 2018).
Kompartementalisasi jalur degradasi karbaril telah diusulkan untuk mencapai degradasi yang efisien dari strain Pseudomonas C5pp dan C7 (Kamini et al., 2018). Diusulkan bahwa karbaril diangkut ke ruang periplasma melalui septum membran luar dan/atau melalui porin yang dapat berdifusi. CH adalah enzim periplasma yang mengkatalisis hidrolisis karbaril menjadi 1-naftol, yang lebih stabil, lebih hidrofobik, dan lebih toksik. CH terlokalisasi di periplasma dan memiliki afinitas rendah terhadap karbaril, sehingga mengendalikan pembentukan 1-naftol, sehingga mencegah akumulasinya dalam sel dan mengurangi toksisitasnya terhadap sel (Kamini et al., 2018). 1-naftol yang dihasilkan diangkut ke dalam sitoplasma melintasi membran dalam melalui partisi dan/atau difusi, dan kemudian dihidroksilasi menjadi 1,2-dihidroksinaftalena oleh enzim 1NH dengan afinitas tinggi untuk metabolisme lebih lanjut dalam jalur karbon sentral.
Meskipun mikroorganisme memiliki kemampuan genetik dan metabolik untuk mendegradasi sumber karbon xenobiotik, struktur hierarkis pemanfaatannya (yaitu, penggunaan sumber karbon sederhana lebih diutamakan daripada sumber karbon kompleks) merupakan hambatan utama bagi biodegradasi. Kehadiran dan pemanfaatan sumber karbon sederhana menurunkan regulasi gen yang mengkode enzim yang mendegradasi sumber karbon kompleks/tidak disukai seperti PAH. Contoh yang telah banyak dipelajari adalah ketika glukosa dan laktosa diberikan bersamaan kepada Escherichia coli, glukosa dimanfaatkan lebih efisien daripada laktosa (Jacob dan Monod, 1965). Pseudomonas dilaporkan dapat mendegradasi berbagai PAH dan senyawa xenobiotik sebagai sumber karbon. Hierarki pemanfaatan sumber karbon pada Pseudomonas adalah asam organik > glukosa > senyawa aromatik (Hylemon dan Phibbs, 1972; Collier dkk., 1996). Namun, ada pengecualian. Menariknya, Pseudomonas sp. CSV86 menunjukkan struktur hierarkis unik yang lebih memilih menggunakan hidrokarbon aromatik (asam benzoat, naftalena, dll.) daripada glukosa dan melakukan ko-metabolisme hidrokarbon aromatik dengan asam organik (Basu et al., 2006). Pada bakteri ini, gen untuk degradasi dan transportasi hidrokarbon aromatik tidak mengalami penurunan ekspresi bahkan dengan adanya sumber karbon kedua seperti glukosa atau asam organik. Ketika ditumbuhkan dalam medium glukosa dan hidrokarbon aromatik, diamati bahwa gen untuk transportasi dan metabolisme glukosa mengalami penurunan ekspresi, hidrokarbon aromatik dimanfaatkan pada fase log pertama, dan glukosa dimanfaatkan pada fase log kedua (Basu et al., 2006; Choudhary et al., 2017). Di sisi lain, keberadaan asam organik tidak memengaruhi ekspresi metabolisme hidrokarbon aromatik, sehingga bakteri ini diharapkan menjadi strain kandidat untuk studi biodegradasi (Phale et al., 2020).
Sudah diketahui bahwa biotransformasi hidrokarbon dapat menyebabkan stres oksidatif dan peningkatan enzim antioksidan pada mikroorganisme. Biodegradasi naftalena yang tidak efisien baik pada sel fase stasioner maupun dengan adanya senyawa beracun menyebabkan pembentukan spesies oksigen reaktif (ROS) (Kang et al. 2006). Karena enzim pendegradasi naftalena mengandung gugus besi-sulfur, di bawah stres oksidatif, besi dalam heme dan protein besi-sulfur akan teroksidasi, yang menyebabkan inaktivasi protein. Ferredoxin-NADP+ reduktase (Fpr), bersama dengan superoksida dismutase (SOD), memediasi reaksi redoks reversibel antara NADP+/NADPH dan dua molekul ferredoxin atau flavodoxin, sehingga membersihkan ROS dan memulihkan pusat besi-sulfur di bawah stres oksidatif (Li et al. 2006). Telah dilaporkan bahwa Fpr dan SodA (SOD) pada Pseudomonas dapat diinduksi oleh stres oksidatif, dan peningkatan aktivitas SOD dan katalase diamati pada empat strain Pseudomonas (O1, W1, As1, dan G1) selama pertumbuhan dalam kondisi penambahan naftalena (Kang et al., 2006). Studi menunjukkan bahwa penambahan antioksidan seperti asam askorbat atau besi fero (Fe2+) dapat meningkatkan laju pertumbuhan naftalena. Ketika Rhodococcus erythropolis tumbuh dalam medium naftalena, transkripsi gen sitokrom P450 yang terkait dengan stres oksidatif termasuk sodA (Fe/Mn superoksida dismutase), sodC (Cu/Zn superoksida dismutase), dan recA meningkat (Sazykin et al., 2019). Analisis proteomik kuantitatif komparatif sel Pseudomonas yang dikultur dalam naftalena menunjukkan bahwa peningkatan berbagai protein yang terkait dengan respons stres oksidatif merupakan strategi mengatasi stres (Herbst et al., 2013).
Mikroorganisme dilaporkan dapat menghasilkan biosurfaktan di bawah pengaruh sumber karbon hidrofobik. Surfaktan ini merupakan senyawa aktif permukaan amfifilik yang dapat membentuk agregat pada antarmuka minyak-air atau udara-air. Hal ini mendorong pseudo-solubilisasi dan memfasilitasi adsorpsi hidrokarbon aromatik, sehingga menghasilkan biodegradasi yang efisien (Rahman dkk., 2002). Karena sifat-sifat ini, biosurfaktan banyak digunakan di berbagai industri. Penambahan surfaktan kimia atau biosurfaktan ke kultur bakteri dapat meningkatkan efisiensi dan laju degradasi hidrokarbon. Di antara biosurfaktan, rhamnolipid yang diproduksi oleh Pseudomonas aeruginosa telah banyak dipelajari dan dikarakterisasi (Hisatsuka dkk., 1971; Rahman dkk., 2002). Selain itu, jenis biosurfaktan lainnya meliputi lipopeptida (mucin dari Pseudomonas fluorescens), pengemulsi 378 (dari Pseudomonas fluorescens) (Rosenberg dan Ron, 1999), lipid disakarida trehalosa dari Rhodococcus (Ramdahl, 1985), lichenin dari Bacillus (Saraswathy dan Hallberg, 2002), dan surfaktan dari Bacillus subtilis (Siegmund dan Wagner, 1991) dan Bacillus amyloliquefaciens (Zhi dkk., 2017). Surfaktan ampuh ini telah terbukti mengurangi tegangan permukaan dari 72 dynes/cm menjadi kurang dari 30 dynes/cm, sehingga memungkinkan penyerapan hidrokarbon yang lebih baik. Telah dilaporkan bahwa Pseudomonas, Bacillus, Rhodococcus, Burkholderia, dan spesies bakteri lainnya dapat menghasilkan berbagai biosurfaktan berbasis rhamnolipid dan glikolipid ketika ditumbuhkan dalam media naftalena dan metilnaftalena (Kanga et al., 1997; Puntus et al., 2005). Pseudomonas maltophilia CSV89 dapat menghasilkan biosurfaktan ekstraseluler Biosur-Pm ketika ditumbuhkan pada senyawa aromatik seperti asam naftoat (Phale et al., 1995). Kinetika pembentukan Biosur-Pm menunjukkan bahwa sintesisnya merupakan proses yang bergantung pada pertumbuhan dan pH. Ditemukan bahwa jumlah Biosur-Pm yang dihasilkan oleh sel pada pH netral lebih tinggi daripada pada pH 8,5. Sel yang ditumbuhkan pada pH 8,5 lebih hidrofobik dan memiliki afinitas yang lebih tinggi terhadap senyawa aromatik dan alifatik daripada sel yang ditumbuhkan pada pH 7,0. Pada Rhodococcus spp. Kondisi N6, rasio karbon terhadap nitrogen (C:N) yang lebih tinggi, dan keterbatasan besi merupakan kondisi optimal untuk produksi biosurfaktan ekstraseluler (Mutalik dkk., 2008). Berbagai upaya telah dilakukan untuk meningkatkan biosintesis biosurfaktan (surfactin) dengan mengoptimalkan strain dan fermentasi. Namun, kadar surfaktan dalam media kultur rendah (1,0 g/L), yang menjadi tantangan untuk produksi skala besar (Jiao dkk., 2017; Wu dkk., 2019). Oleh karena itu, metode rekayasa genetika telah digunakan untuk meningkatkan biosintesisnya. Namun, modifikasi rekayasa genetika sulit dilakukan karena ukuran operon yang besar (∼25 kb) dan regulasi biosintesis yang kompleks dari sistem penginderaan kuorum (Jiao dkk., 2017; Wu dkk., 2019). Sejumlah modifikasi rekayasa genetika telah dilakukan pada bakteri Bacillus, terutama bertujuan untuk meningkatkan produksi surfactin dengan mengganti promotor (operon srfA), mengekspresikan secara berlebihan protein ekspor surfactin YerP dan faktor pengatur ComX dan PhrC (Jiao et al., 2017). Namun, metode rekayasa genetika ini hanya mencapai satu atau beberapa modifikasi genetik dan belum mencapai produksi komersial. Oleh karena itu, studi lebih lanjut tentang metode optimasi berbasis pengetahuan sangat diperlukan.
Studi biodegradasi PAH sebagian besar dilakukan dalam kondisi laboratorium standar. Namun, di lokasi yang terkontaminasi atau di lingkungan yang terkontaminasi, banyak faktor abiotik dan biotik (suhu, pH, oksigen, ketersediaan nutrisi, ketersediaan substrat, xenobiotik lainnya, penghambatan produk akhir, dll.) telah terbukti mengubah dan memengaruhi kapasitas degradasi mikroorganisme.
Suhu memiliki pengaruh signifikan terhadap biodegradasi PAH. Seiring peningkatan suhu, konsentrasi oksigen terlarut menurun, yang memengaruhi metabolisme mikroorganisme aerobik, karena mereka membutuhkan oksigen molekuler sebagai salah satu substrat untuk oksigenase yang melakukan reaksi hidroksilasi atau pemecahan cincin. Seringkali dicatat bahwa peningkatan suhu mengubah PAH induk menjadi senyawa yang lebih beracun, sehingga menghambat biodegradasi (Muller et al., 1998).
Telah diketahui bahwa banyak lokasi yang terkontaminasi PAH memiliki nilai pH ekstrem, seperti lokasi yang terkontaminasi air limbah tambang asam (pH 1–4) dan lokasi gasifikasi gas alam/batubara yang terkontaminasi air lindi alkali (pH 8–12). Kondisi ini dapat sangat memengaruhi proses biodegradasi. Oleh karena itu, sebelum menggunakan mikroorganisme untuk bioremediasi, disarankan untuk menyesuaikan pH dengan menambahkan bahan kimia yang sesuai (dengan potensi oksidasi-reduksi sedang hingga sangat rendah) seperti amonium sulfat atau amonium nitrat untuk tanah alkali atau pengapuran dengan kalsium karbonat atau magnesium karbonat untuk lokasi asam (Bowlen et al. 1995; Gupta dan Sar 2020).
Pasokan oksigen ke area yang terdampak merupakan faktor pembatas laju biodegradasi PAH. Karena kondisi redoks lingkungan, proses bioremediasi in situ biasanya memerlukan pengenalan oksigen dari sumber eksternal (pengolahan tanah, penghembusan udara, dan penambahan bahan kimia) (Pardieck et al., 1992). Odenkranz et al. (1996) menunjukkan bahwa penambahan magnesium peroksida (senyawa pelepas oksigen) ke akuifer yang terkontaminasi dapat secara efektif melakukan bioremediasi senyawa BTEX. Studi lain meneliti degradasi in situ fenol dan BTEX di akuifer yang terkontaminasi dengan menyuntikkan natrium nitrat dan membangun sumur ekstraksi untuk mencapai bioremediasi yang efektif (Bewley dan Webb, 2001).