Alamat saat ini: OX11 0DE, Inggris, Diamond Building, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Oxfordshire, Inggris, Diamond Light Source Co., Ltd., Electronic Biological Imaging Center.
Kompleks pemanen cahaya pusat reaksi 1 (RC-LH1) adalah komponen fotosintetik inti dari bakteri fototrofik ungu. Kami memperkenalkan dua struktur mikroskopi krio-elektron dari kompleks RC-LH1 dari Rhodopseudomonas palustris. Struktur kompleks RC-LH114-W dengan resolusi 2,65 Å terdiri dari 14 loop subunit LH1 yang mengelilingi RC, yang terputus oleh protein W, sedangkan kompleks tanpa protein W sepenuhnya terdiri dari komposisi RC yang dikelilingi oleh loop LH1 16 subunit yang tertutup. Perbandingan struktur ini memberikan wawasan tentang dinamika kuinon dalam kompleks RC-LH1, termasuk perubahan konformasi yang sebelumnya tidak diketahui ketika mengikat kuinon pada situs QB RC, serta lokasi situs pengikatan kuinon tambahan, yang membantu meneruskannya ke RC. Struktur unik protein W mencegah penutupan loop LH1, sehingga menciptakan saluran untuk mempercepat pertukaran kuinon/kuinolon.
Energi yang dihasilkan oleh fotosintesis dapat menopang hampir semua kehidupan di bumi, dan memiliki potensi besar untuk bioteknologi surya. Selain mendorong fotosintesis global, bakteri fototrof ungu juga menunjukkan berbagai mode energi dan kemampuan metabolisme. Mereka dapat menghindari fotosintesis dan tumbuh sebagai bakteri heterotrof dalam gelap, dapat memfiksasi nitrogen dan karbon dioksida, menghasilkan hidrogen, dan mendegradasi senyawa aromatik (1-3). Untuk menyediakan energi bagi proses-proses ini, cahaya harus diubah dengan cepat dan efisien menjadi energi kimia. Proses ini dimulai ketika kompleks antena penangkap cahaya menyerap cahaya dan mentransfer energi yang terperangkap ke pusat reaksi (RC), sehingga memulai pemisahan muatan (4-7). Unit dasar fotosintesis pada bakteri fototrof ungu terdiri dari RC tipe 2, dikelilingi oleh kompleks pemanen cahaya 1 (LH1), membentuk kompleks inti RC-LH1. LH1 dibentuk oleh susunan heterodimer αβ melengkung, yang masing-masing mengikat dua molekul klorofil bakteri (BChl) a dan satu atau dua karotenoid (8-12). Antena LH1 paling sederhana terdiri dari 16 atau 17 heterodimer αβ yang mengelilingi RC (9-13) dalam lingkaran tertutup, tetapi pada kompleks inti lainnya, peptida transmembran mengganggu kontinuitas LH1 di sekitarnya, sehingga mendorong difusi kuinon/kuinol antara RC dan kompleks sitokrom bc1 (11, 13-15). Tanaman fototrof ungu Rhodopseudomonas (Rps.) adalah organisme model yang dapat memahami transfer energi dan elektron yang mendukung fotosintesis. Struktur kristal pertama Rps. Model kompleks RC-LH1 palustris adalah RC, yang dikelilingi oleh 15 lingkaran heterodimer LH1, yang diinterupsi oleh protein yang tidak dikenal yang disebut "Protein W" (14). Protein-W kemudian diidentifikasi sebagai RPA4402, yang merupakan protein 10,5 kDa yang belum dikarakterisasi dengan tiga heliks transmembran (TMH) yang diprediksi (16). Kami mengusulkan untuk mengganti nama gen rpa4402 yang mengkode protein W menjadi pufW agar konsisten dengan nomenklatur yang digunakan untuk gen yang mengkode subunit RC-L, M (pufL, pufM) dan LH1α, β (pufA, pufB). Menariknya, protein-W hanya terdapat pada sekitar 10% RC-LH1, yang menunjukkan bahwa Rps. palustris menghasilkan dua kompleks RC-LH1 yang berbeda. Di sini, kami melaporkan struktur cryo-EM (cryo-EM) resolusi tinggi dari dua kompleks inti, satu dengan protein W dan 14 heterodimer αβ, yang lain tanpa protein W dan loop LH1 16 heterodimer tertutup. Struktur kami mewakili perubahan signifikan dalam pemahaman kompleks RC-LH1 dari Rps. palustris, karena kami telah menganalisis populasi homogen dari setiap varian dan memiliki resolusi yang cukup untuk secara jelas menetapkan setiap peptida dan pigmen terikat serta lipid dan kuinon terkait. Perbandingan struktur-struktur ini menunjukkan bahwa tiga protein TMH-W yang belum ditemukan di kompleks RC-LH1 lainnya sejauh ini menghasilkan saluran kuinon untuk mempercepat pertukaran kuinon/kuinolon. Sejumlah situs pengikatan lipid dan kuinon yang terkonservasi telah diidentifikasi, dan kami telah mengungkapkan perubahan konformasi baru setelah kombinasi kuinon dan RC, yang mungkin cocok untuk RC fotosistem II (PSII) dari organisme fototrofik yang mengandung oksigen. Temuan kami memberikan wawasan baru tentang kinetika pengikatan dan pertukaran kuinon/kuinolon dalam kompleks inti RC-LH1 dari bakteri fototrofik ungu.
Untuk memfasilitasi studi rinci dari dua kompleks yang ditemukan di Rps. palustris, kami mengisolasi setiap RC-LH1 dengan metode biokimia. Kompleks yang kekurangan protein W (selanjutnya disebut sebagai ΔpufW) dimurnikan dari strain yang tidak memiliki gen pufW (16), dan hanya satu kompleks RC-LH1 yang dapat diproduksi. Kompleks yang mengandung protein W diproduksi oleh strain. Protein W dari strain ini dimodifikasi dengan tag His 10x di ujung C-nya, sehingga kompleks yang mengandung protein W dapat secara efektif dikombinasikan dengan sebagian besar protein W yang tidak ada dengan mengimobilisasi logam. Kompleks tersebut secara efektif dipisahkan (16) Kromatografi Afinitas (IMAC).
Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1, kedua kompleks tersebut mengandung tiga sub-unit RC (RC-L, RC-M, dan RC-H) yang dikelilingi oleh antena LH1. Struktur 2,80 Å dari kompleks yang tidak mengandung protein-W menunjukkan 16 heterodimer αβ, membentuk lingkaran LH1 tertutup yang sepenuhnya mengelilingi RC, selanjutnya disebut sebagai kompleks RC-LH116. Struktur 2,65 Å dari kompleks yang mengandung protein-W memiliki 14 heterodimer LH1 yang terputus oleh protein-W, selanjutnya disebut sebagai RC-LH114-W.
(A dan B) Representasi permukaan senyawa. (C dan D) Pigmen terikat yang diekspresikan dalam bentuk batang. (E dan F) Kompleks yang diamati dari permukaan sitoplasma memiliki peptida dan subunit LH1 yang direpresentasikan dalam bentuk kartun, dan diberi nomor searah jarum jam dari celah protein-W [konsisten dengan penomoran kompleks Rba sphaeroides (13)]. Untuk LH1-α, warna subunit protein adalah kuning; untuk LH1-β, warna subunit protein adalah biru; untuk protein-W, proteinnya berwarna merah; untuk RC-H, berwarna sian; untuk RC-L, berwarna oranye; untuk RC-M, berwarna magenta. Kofaktor direpresentasikan oleh batang, hijau mewakili molekul BChl dan BPh a, ungu mewakili karotenoid, dan kuning mewakili molekul UQ10. (G dan H) Tampilan yang diperbesar dari celah protein-W di wilayah yang setara dari kompleks RC-LH114-W (G) dan kompleks RC-LH116 (H). Kofaktor ditampilkan dalam bentuk pengisian ruang, kuinon terkelat ditampilkan dalam warna biru. Celah protein-W disorot oleh garis putus-putus biru pada (G), dan lubang kecil tempat kuinon/kuinolol berdifusi pada cincin LH116 disorot oleh garis putus-putus hitam pada (H).
Gambar 1 (A dan B) menunjukkan RC yang dikelilingi oleh susunan heterodimer LH1αβ terbuka atau tertutup, yang masing-masing mengikat dua BChl dan satu karotenoid (Gambar 1, C dan D). Studi sebelumnya telah menunjukkan bahwa Rps adalah kompleks LH1. Dalam jalur biosintesis xantin spirulina, spesies ini mengandung populasi karotenoid campuran (17). Namun, spiropiroksantin adalah karotenoid dominan dan kepadatannya memuaskan. Oleh karena itu, kami memilih untuk memodelkan spiropiroksantin di semua situs pengikatan LH1. Polipeptida alfa dan beta adalah TMH tunggal dengan daerah luar membran pendek (Gambar 1, A, B, E, dan F). Meskipun kepadatan 17 residu di C-terminus tidak diamati, polipeptida alfa terbelah dari Met1 hingga Ala46 di kedua kompleks. Polipeptida β direduksi dari Gly4 menjadi Tyr52 pada RC-LH116, dan dari Ser5 menjadi Tyr52 pada RC-LH114-W. Tidak ada kerapatan 3 atau 4 residu N-terminal atau 13 residu C-terminal yang diamati (Gambar S1). Analisis spektrometri massa kompleks campuran RC-LH1 yang disiapkan dari strain tipe liar menunjukkan bahwa daerah yang hilang adalah hasil dari pemutusan heterolog peptida ini (Gambar S1 dan S2). Formilasi N-terminal α-Met1 juga diamati (f). Analisis menunjukkan bahwa peptida α terdiri dari residu fMet1 hingga Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, dan peptida β terdiri dari residu Ser2 hingga Ala53, yang sesuai dengan peta kerapatan EM suhu rendah.
Koordinasi α-His29 dan β-His36 membuat BChl saling berhadapan; setiap heterodimer αβ berkumpul dengan tetangganya untuk membentuk lingkaran terbuka (RC-LH114-W) atau lingkaran tertutup (RC-LH116) di sekitar susunan pigmen yang terkopel eksiton RC (Gambar 1, C dan D). Dibandingkan dengan pita 877 nm dari RC-LH114-W, pergeseran merah penyerapan 880 nm dari RC-LH116 adalah 3 nm (Gambar 2A). Namun, spektrum dikroisme sirkular hampir sama (Gambar 2B), menunjukkan bahwa meskipun ada perbedaan yang jelas antara lingkaran terbuka dan tertutup, lingkungan lokal BChl sangat mirip. Pergeseran merah penyerapan mungkin merupakan hasil dari berkurangnya gerakan termal dan meningkatnya stabilitas pada loop tertutup (18, 19), perubahan pada kopling pigmen yang disebabkan oleh loop tertutup (20, 21), atau kombinasi dari kedua efek ini (11).
(A) Spektrum absorbsi ultraviolet/tampak/inframerah dekat, puncak-puncaknya ditandai dengan pigmen yang sesuai dan dinormalisasi terhadap puncak BPh pada 775 nm. (B) Spektrum dikroisme sirkular dinormalisasi terhadap absorbansi BChl pada 805 nm. (C dan D) Spektrum ΔA terpilih dari spektrum absorbsi yang diukur berdasarkan waktu dari kompleks RC-LH114-W (C) dan kompleks RC-LH116 (D). Untuk perbandingan yang lebih baik, semua spektrum dinormalisasi terhadap ∆A sebesar −A pada 0,2 ps. (E) Laju oksidasi sitokrom c2 setelah iradiasi dengan adanya berbagai konsentrasi UQ2 (lihat Gambar S8 untuk data mentah). (F) Pada sel yang ditumbuhkan di bawah cahaya intensitas rendah, sedang, atau tinggi (masing-masing 10, 30, atau 300 μMm-2 s-1), protein W dan subunit RC-L dalam kompleks yang dimurnikan dan rasio membran yang terpisah. Tentukan kadar protein dengan elektroforesis gel SDS-poliakrilamida dan uji imunologi (lihat Gambar S9 untuk data mentah). Tentukan rasio relatif terhadap kompleks RC-LH114-W yang dimurnikan. Rasio stoikiometri RC-L terhadap protein-W dari kompleks tersebut adalah 1:1.
BChl pada posisi 1 dalam loop αβ14 yang terdeformasi dari RC-LH114-W (Gambar 1, A, C, dan E) lebih dekat ke donor primer RC (P) sebesar 6,8 Å daripada BChl yang setara dalam RC-LH116 (Gambar 1, B, D, dan F, dan Gambar S3); namun, kinetika absorpsi transien dari kedua kompleks menunjukkan bahwa untuk RC-LH114-W dan RC-LH116, konstanta waktu transfer energi eksitasi dari LH1 ke RC adalah 40 ±4 dan 44 ±3 ps (Gambar 2, C dan D, Gambar S4 dan Tabel S2). Tidak ada juga perbedaan signifikan dalam transfer elektronik di dalam RC (Gambar S5 dan teks tambahan terkait). Kami menduga bahwa kesamaan waktu transfer energi antara LH1 dan RC-P disebabkan oleh jarak, sudut, dan energi potensial yang serupa dari sebagian besar BChl dalam dua loop LH1. Tampaknya, eksplorasi pola energi LH1 untuk mencapai jarak minimum tidak lebih cepat daripada transfer energi langsung dari situs suboptimal ke RC. Lingkaran LH1 terbuka pada RC-LH114-W mungkin juga mengalami gerakan termal yang tidak signifikan dalam kondisi suhu rendah untuk analisis struktural, dan terdapat konformasi cincin αβ14 yang lebih panjang pada suhu kamar dari jarak pigmentasi βBChls pada posisi RC 1.
Kompleks RC-LH116 mengandung 32 BChl dan 16 karotenoid, dan susunan keseluruhannya sama dengan yang diperoleh dari Thermochromatium (Tch.) pidpidum [ID Protein Data Bank (PDB) 5Y5S] (9), strain Thiorhodovibrio (Trv.) 970 (ID PDB 7C9R) (12) dan alga hijau (Blc.viridis) (ID PDB 6ET5) (10). Setelah penyelarasan, hanya sedikit penyimpangan pada posisi heterodimer αβ yang diamati, terutama 1-5, 15, dan 16 (Gambar S6). Kehadiran protein-W memiliki dampak signifikan pada struktur LH1. Ketiga TMH-nya dihubungkan oleh loop pendek, dengan N-terminal di sisi lumen kompleks dan C-terminal di sisi sitoplasma (Gambar 1A dan 3, A sampai D). Protein-W sebagian besar bersifat hidrofobik (Gambar 3B), dan TMH2 serta TMH3 berinteraksi dengan LH1αβ-14 untuk membentuk permukaan transmembran (Gambar 3, B dan E hingga G). Antarmuka tersebut sebagian besar terdiri dari residu Phe, Leu, dan Val di wilayah transmembran. Residu-residu ini tersusun dengan asam amino hidrofobik dan pigmen αβ-14. Beberapa residu polar juga berkontribusi pada interaksi tersebut, termasuk ikatan hidrogen antara W-Thr68 dan β-Trp42 pada permukaan rongga kompleks (Gambar 3, F dan G). Pada permukaan sitoplasma, Gln34 berdekatan dengan gugus keto karotenoid αβ-14. Selain itu, molekul n-dodecyl β-d-maltoside (β-DDM) terdeteksi, dan ekor hidrofobiknya memanjang ke antarmuka antara protein-W dan αβ-14, dan ekor lipidnya mungkin terletak di bagian tengah. Kami juga memperhatikan bahwa daerah resolusi C-terminal protein W dan RCH sangat dekat, tetapi tidak dalam lingkup pembentukan interaksi spesifik (Gambar 1, A dan E). Namun, mungkin ada interaksi pada asam amino C-terminal yang tidak terpecahkan dari kedua protein ini, yang dapat memberikan mekanisme untuk perekrutan protein-W selama perakitan kompleks RC-LH114-W.
(A) Protein-W, yang menghadap antarmuka dengan LH1αβ14 dalam bentuk kartun, memiliki rantai samping berbentuk batang (merah), ditampilkan pada bagian diagram potensial elektrostatik (permukaan abu-abu transparan dengan tingkat kontur 0,13). (B) Protein-W direpresentasikan oleh permukaan berwarna hidrofobik. Area polar dan bermuatan ditampilkan dalam warna cyan, area hidrofobik ditampilkan dalam warna putih, dan area yang sangat hidrofobik ditampilkan dalam warna oranye. (C dan D) Protein-W direpresentasikan dalam bentuk kartun, orientasinya sama seperti pada (A) (C), dan diputar 180° (D). Sesuai dengan posisinya dalam sekuens, residu yang dapat dibedakan mengadopsi skema warna pelangi, di mana N-terminal berwarna biru dan C-terminal berwarna merah. (E) Protein-W dalam tampilan yang sama seperti pada (A), dan residu pada antarmuka protein-W:LH1 direpresentasikan oleh batang dengan tanda yang terpasang. (F) Protein-W diputar 90° relatif terhadap (E) dan LH1αβ14 dalam representasi kartun, dan relatif terhadap residu antarmuka dalam representasi batang. Residu yang menggantung dari polipeptida beta diberi label. Kofaktor ditampilkan sebagai batang yang sesuai dengan warna Gambar 1, β-DDM yang terurai ditampilkan dalam warna abu-abu, dan oksigen ditampilkan dalam warna merah. (G) Tampilan pada (F) diputar 180°, dengan residu menonjol dari polipeptida alfa yang diberi label.
Protein-W menggantikan heterodimer αβ (yang ke-15 pada Gambar 1F), sehingga mencegah penutupan loop dan memiringkan tiga heterodimer αβ pertama. Diamati bahwa sudut kemiringan maksimum heterodimer αβ-1 pertama relatif terhadap normal film adalah 25° hingga 29° (Gambar 1, A dan E), yang dibentuk oleh kemiringan 2° hingga 8° dari αβ-1 dalam RC A kontras tajam-LH116 (Gambar 1, B dan F). Heterodimer kedua dan ketiga masing-masing miring pada sudut 12° hingga 22° dan 5° hingga 10°. Karena halangan sterik RC, kemiringan αβ-1 tidak mencakup pasangan αβ kedua (yang sesuai dengan αβ ke-16 pada Gambar 1F), sehingga membentuk celah yang jelas pada cincin LH1 (Gambar 1, A dan E). Karena kurangnya dua heterodimer αβ, disertai dengan hilangnya empat BChl dan dua karotenoid, tidak ada karotenoid yang berikatan dengan subunit αβ-1 yang terpelintir, sehingga menghasilkan cincin LH114-W yang mengandung 13 karotenoid Vegetarian dan 28 BChl. Estimasi resolusi lokal dari dua kompleks di wilayah αβ1 hingga 7 lebih rendah daripada bagian lain dari loop LH1, yang mungkin mencerminkan plastisitas inheren subunit LH1 yang berdekatan dengan situs RC QB (Gambar 4).
Gambar RC-LH114-W (A dan B) dan RC-LH116 (C dan D) ditampilkan dari tampilan atas/samping yang sama (A dan B) (A dan C) dan permukaan rongga Gambar 1. (B dan D). Keterangan warna ditampilkan di sebelah kanan.
Satu-satunya kompleks inti karakteristik lain dengan rasio stoikiometri 1:14 adalah dimer Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX (13). Namun, protein W dan PufX tidak memiliki homologi yang jelas, dan memiliki dampak signifikan pada struktur LH1 masing-masing. PufX adalah TMH tunggal dengan domain sitoplasma N-terminal yang berinteraksi dengan sisi sitoplasma subunit RC-H (13) pada posisi yang sesuai dengan Rps. palustris LH116αβ-16. PufX menciptakan saluran untuk pertukaran kuinon/kuinolon antara RC-LH1 dan kompleks sitokrom bcl dan hadir di semua kompleks inti Rba. sphaeroides (13). Meskipun antarmuka monomer-monomer ada di Rba. Dimer sphaeroides RC-LH1-PufX terletak pada posisi pengikatan protein W dalam RC-LH114-W, dan celah yang diinduksi oleh PufX dan protein-W berada pada posisi yang setara (Gambar S7A). Celah dalam RC-LH114-W juga sejajar dengan saluran kuinon hipotetik (8) dari Pseudomonas rosea LH1, yang dibentuk oleh peptida yang tidak terkait dengan protein W atau PufX (Gambar S7B). Selain itu, saluran kuinon dalam Blc. Emerald green LH1 yang dibentuk dengan mengecualikan satu subunit γ (7) terletak pada posisi yang serupa (Gambar S7C). Meskipun dimediasi oleh protein yang berbeda, munculnya saluran kuinon/kuinolol ini pada posisi umum dalam kompleks RC-LH1 tampaknya merupakan contoh evolusi konvergen, yang menunjukkan bahwa celah yang diciptakan oleh protein W dapat bertindak sebagai saluran kuinon.
Celah pada loop LH114-W memungkinkan pembentukan daerah membran kontinu antara ruang internal kompleks RC-LH114-W dan membran massal (Gambar 1G), alih-alih menghubungkan kedua domain melalui pori protein seperti pada protein. Kompleks RC-LH116 mirip dengan kompleks seperti jarum Tch tertutup (22) (Gambar 1H). Karena difusi kuinon melalui membran lebih cepat daripada difusi melalui saluran protein yang sempit, loop LH114-W yang terbuka dapat memungkinkan pergantian RC yang lebih cepat daripada loop LH116 yang tertutup, dan difusi kuinon ke dalam RC mungkin lebih terbatas. Untuk menguji apakah protein W memengaruhi konversi kuinon melalui RC, kami melakukan uji oksidasi sitokrom pada konsentrasi tertentu ubikuinon 2 (UQ2) (analog UQ10 alami dengan ekor isoprena yang lebih pendek) (Gambar 2E). Meskipun keberadaan kuinon terkelat menghambat penentuan konstanta Michaelis semu secara akurat (RC-LH114-W dan RC-LH116 masing-masing cocok untuk 0,2±0,1μM dan 0,5±0,2μM), laju maksimum RC-LH114-W (4,6±0,2 e-RC-1 s-1) 28±5% lebih besar daripada RC-LH116 (3,6±0,1 e-RC-1 s-1).
Awalnya kami memperkirakan bahwa protein-W hadir dalam sekitar 10% kompleks inti (16); di sini, tingkat hunian sel pertumbuhan cahaya rendah, cahaya sedang, dan cahaya tinggi masing-masing adalah 15±0,6%, 11±1% dan 0,9±0,5% (Gambar 2F). Perbandingan kuantitatif spektrometri massa menunjukkan bahwa penambahan tag histidin tidak mengurangi kelimpahan relatif protein-W dibandingkan dengan strain tipe liar (P = 0,59), sehingga kadar ini bukan artefak dari protein-W yang dimodifikasi (Gambar S10). Namun, hunian protein-W yang rendah dalam kompleks RC-LH1 ini dapat memungkinkan beberapa RC untuk berbalik dengan kecepatan yang dipercepat, sehingga mengurangi pertukaran kuinon/kuinolon yang lebih lambat dalam kompleks RC-LH116. Kami memperhatikan bahwa tingkat hunian cahaya yang tinggi tidak konsisten dengan data transkriptomik terbaru, yang menunjukkan bahwa ekspresi gen pufW meningkat di bawah cahaya yang kuat (Gambar S11) (23). Perbedaan antara transkripsi pufW dan penggabungan protein-W ke dalam kompleks RC-LH1 membingungkan dan mungkin mencerminkan regulasi protein yang kompleks.
Pada RC-LH114-W, terdapat 6 molekul kardiolipin (CDL), 7 molekul fosfatidilkolin (POPC), 1 molekul fosfatidilgliserol (POPG), dan 29 molekul β-DDM yang dialokasikan dan dimodelkan di dalamnya 6 CDL, 24 POPC, 2 POPG, dan 12 βDDM. RC-LH116 (Gambar 5, A dan B). Pada kedua struktur ini, CDL hampir seluruhnya terletak di sisi sitoplasma kompleks, sedangkan POPC, POPG, dan β-DDM sebagian besar terletak di sisi lumen. Dua molekul lipid dan deterjen diisolasi di wilayah αβ-1 hingga αβ-6 dari kompleks RC-LH114-W (Gambar 5A), dan lima diisolasi di wilayah yang setara dari RC-LH116 (Gambar 5B). Lebih banyak lipid ditemukan di sisi lain kompleks, terutama CDL, terakumulasi antara RC dan αβ-7 hingga αβ-13 (Gambar 5, A dan B). Lipid dan deterjen lain yang strukturnya telah terurai terletak di luar cincin LH1, dan rantai asil yang terurai dengan baik membentang di antara subunit LH1, yang untuk sementara ditetapkan sebagai β-DDM dalam RC-LH114-W, dan didefinisikan sebagai β-DDM dalam campuran RC A dari β-DDM dan POPC-LH116. Posisi lipid dan deterjen pengkelat yang serupa dalam struktur kami menunjukkan bahwa mereka adalah situs pengikatan yang relevan secara fisiologis (Gambar S12A). Posisi molekul yang setara dalam Tch juga memiliki konsistensi yang baik. Gentle dan Trv. Strain 970 RC-LH1s (Gambar S12, B sampai E) (9, 12) dan residu ikatan hidrogen dari gugus kepala lipid menunjukkan konservasi yang cukup baik dalam penyelarasan urutan (Gambar S13), menunjukkan bahwa CDL yang terkonservasi yang mengikat RC (24), situs-situs ini mungkin terkonservasi dalam kompleks RC-LH1.
(A dan B) Peptida RC-LH114-W (A) dan RC-LH116 (B) direpresentasikan oleh kartun, dan pigmen direpresentasikan oleh batang, menggunakan skema warna pada Gambar 1. Lipid ditunjukkan dengan warna merah, dan deterjen ditunjukkan dengan warna abu-abu. UQ yang terikat pada situs RC QA dan QB berwarna kuning, sedangkan UQ yang terisolasi berwarna biru. (C dan D) Tampilan yang sama seperti (A) dan (B), dengan lipid dihilangkan. (E hingga G) Tampilan yang diperbesar dari Q1(E), Q2(F) dan Q3(G) dari RC-LH116, dengan rantai samping yang saling memengaruhi. Ikatan hidrogen ditunjukkan sebagai garis putus-putus hitam.
Dalam RC-LH116, baik RC QA dan QB UQ, yang berpartisipasi dalam transfer elektron dalam proses pemisahan muatan, terurai di situs pengikatannya. Namun, dalam RC-LH114-W, kuinon QB belum terpecahkan dan akan dibahas secara detail di bawah ini. Selain kuinon QA dan QB, dua molekul UQ terkelat (terletak di antara cincin RC dan LH1) dialokasikan dalam struktur RC-LH114-W sesuai dengan gugus kepala yang terpecahkan dengan baik (masing-masing terletak di ruang Q1 dan Q2). Gambar 5C). Dua unit isoprena ditugaskan ke Q1, dan peta kerapatan memecahkan 10 ekor isoprena lengkap dari Q2. Dalam struktur RC-LH116, tiga molekul UQ10 terkelat (Q1 hingga Q3, Gambar 5D) terpecahkan, dan semua molekul memiliki kerapatan yang jelas di seluruh ekor (Gambar 5, D hingga G). Dalam kedua struktur tersebut, posisi gugus kepala kuinon Q1 dan Q2 memiliki konsistensi yang sangat baik (Gambar S12F), dan keduanya hanya berinteraksi dengan RC. Q1 terletak di pintu masuk celah W dari RC-LH114-W (Gambar 1G dan 5, C, D dan E), dan Q2 terletak di dekat situs pengikatan QB (Gambar 5, C, D dan F). Residu L-Trp143 dan L-Trp269 yang terkonservasi sangat dekat dengan Q1 dan Q2 dan memberikan potensi interaksi penumpukan π (Gambar 5, E dan F, dan Gambar S12). L-Gln88, 3,0 Å dari oksigen distal Q1, memberikan ikatan hidrogen yang kuat (Gambar 5E); residu ini terkonservasi di semua RC kecuali hubungan yang paling jauh (Gambar S13). L-Ser91 secara konservatif menggantikan Thr di sebagian besar RC lainnya (Gambar S13), berjarak 3,8 Angstrom dari oksigen metil Q1, dan mungkin menyediakan ikatan hidrogen lemah (Gambar 5E). Q3 tampaknya tidak memiliki interaksi spesifik, tetapi terletak di wilayah hidrofobik antara subunit RC-M dan subunit LH1-α 5 hingga 6 (Gambar 5, D dan G). Q1, Q2 dan Q3 atau kuinon terkelat di dekatnya juga telah terdeteksi pada Tch. Gentle, Trv. Strain 970 dan Blc. Struktur iris (9, 10, 12) menunjukkan situs pengikatan kuinon tambahan yang terkonservasi dalam kompleks RC-LH1 (Gambar S12G). Lima UQ yang terurai dalam RC-LH116 sangat sesuai dengan nilai 5,8±0,7 dari masing-masing kompleks yang ditentukan oleh kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC), sedangkan tiga UQ yang terurai dalam RC-LH114-W lebih rendah dari nilai terukur 6,2±0,3 (Gambar S14) yang menunjukkan bahwa terdapat molekul UQ yang tidak terurai dalam struktur tersebut.
Polipeptida pseudo-simetris L dan M masing-masing mengandung lima TMH dan membentuk heterodimer yang menggabungkan satu dimer BChl, dua monomer BChl, dua monomer bakteriofag (BPh), dan satu besi non-Heme dan satu atau dua molekul UQ10. Melalui adanya ikatan hidrogen pada gugus keton terminal dan akumulasinya yang diketahui dalam Rps, karotenoid dimasukkan ke dalam subunit M, yang diberi nama cis-3,4-dehidroorhodopin. Spesies (25). Domain membran luar RC-H ditambatkan ke membran oleh satu TMH. Struktur RC secara keseluruhan mirip dengan tiga subunit RC dari spesies terkait (seperti Rba). sphaeroides (ID PDB: 3I4D). Makrosiklus BChl dan BPh, kerangka karotenoid dan besi non-heme tumpang tindih dalam rentang resolusi struktur ini, demikian pula gugus kepala UQ10 pada situs QA dan kuinon QB pada RC-LH116 (Gambar S15).
Ketersediaan dua struktur RC dengan tingkat okupansi situs QB yang berbeda memberikan peluang baru untuk memeriksa perubahan konformasi yang konsisten yang menyertai pengikatan kuinon QB. Dalam kompleks RC-LH116, kuinon QB terletak pada posisi "proksimal" yang terikat penuh (26), tetapi pemisahan RC-LH114-W tidak memiliki kuinon QB. Tidak ada kuinon QB dalam RC-LH114-W, yang mengejutkan karena kompleks tersebut aktif, bahkan lebih aktif daripada kompleks RC-LH116 dengan kuinon QB yang strukturnya telah ditentukan. Meskipun kedua cincin LH1 mengkelat sekitar enam kuinon, lima di antaranya strukturnya telah ditentukan dalam cincin RC-LH116 yang tertutup, sedangkan hanya tiga yang strukturnya terbatas dalam cincin RC-LH114-W yang terbuka. Peningkatan ketidakteraturan struktural ini mungkin mencerminkan penggantian situs QB RC-LH114-W yang lebih cepat, kinetika kuinon yang lebih cepat dalam kompleks, dan peningkatan kemungkinan melintasi loop LH1. Kami berpendapat bahwa kurangnya UQ di situs RC QB dari RC-LH114-W mungkin merupakan hasil dari kompleks yang lebih kompleks dan lebih aktif, dan situs QB dari RC-LH114-W telah langsung dibekukan dalam pergantian UQ. Tahap spesifik (pintu masuk ke situs QB telah tertutup) mencerminkan konformasi aktivitas ini.
Tanpa QB, rotasi L-Phe217 yang menyertainya ke posisi yang tidak kompatibel dengan pengikatan UQ10, karena akan menyebabkan benturan spasial dengan unit isoprena pertama dari ekor (Gambar 6A). Selain itu, perubahan konformasi utama yang jelas terlihat, terutama heliks de (heliks pendek di loop antara TMH D dan E) di mana L-Phe217 bergeser ke kantong pengikatan QB dan rotasi L-Tyr223 (Gambar 6A) untuk memutus ikatan hidrogen dengan kerangka M-Asp45 dan menutup pintu masuk situs pengikatan QB (Gambar 6B). Heliks de berputar di dasarnya, Cα dari L-Ser209 bergeser sebesar 0,33 Å, sedangkan Cα L-Val221 bergeser sebesar 3,52 Å. Tidak ada perubahan yang terlihat pada TMH D dan E, yang dapat ditumpangkan pada kedua struktur (Gambar 6A). Sejauh yang kami ketahui, ini adalah struktur pertama dalam RC alami yang menutup situs QB. Perbandingan dengan struktur lengkap (terikat QB) menunjukkan bahwa sebelum kuinon direduksi, perubahan konformasi diperlukan agar dapat masuk ke dalam kuinon. L-Phe217 berputar untuk membentuk interaksi penumpukan π dengan gugus kepala kuinon, dan heliks bergeser ke luar, memungkinkan kerangka L-Gly222 dan rantai samping L-Tyr223 untuk membentuk jaringan ikatan hidrogen dengan struktur ikatan hidrogen yang stabil (Gambar 6, A dan C).
(A) Kartun tumpang tindih hologram (rantai L, oranye/rantai M, magenta) dan struktur apo (abu-abu), di mana residu kunci ditampilkan dalam bentuk representasi seperti batang. UQ10 direpresentasikan oleh batang kuning. Garis putus-putus menunjukkan ikatan hidrogen yang terbentuk di seluruh struktur. (B dan C) Representasi permukaan apolipoprotein dan seluruh struktur cincin, menyoroti oksigen rantai samping L-Phe217 dengan warna biru dan L-Tyr223 dengan warna merah, masing-masing. Subunit L berwarna oranye; subunit M dan H tidak berwarna. (D dan E) Apolipoprotein (D) dan seluruh (E) situs RC QB [warna berdasarkan (A) masing-masing] dan Thermophilus thermophilus PSII (hijau, biru dengan kuinon plastik; ID PDB: 3WU2) Sejajarkan (58).
Secara tak terduga, meskipun beberapa struktur RC yang kekurangan QB tanpa LH1 tersedia, perubahan konformasi yang diamati dalam penelitian ini belum pernah dilaporkan sebelumnya. Ini termasuk struktur penipisan QB dari Blc. viridis (ID PDB: 3PRC) (27), Tch. tepidum (ID PDB: 1EYS) (28) dan Rba. sphaeroides (ID PDB: 1OGV) (29), yang semuanya hampir sama dengan struktur QB keseluruhannya. Pemeriksaan cermat 3PRC mengungkapkan bahwa molekul deterjen LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) mengikat di pintu masuk posisi QB, yang dapat mencegah penataan ulang menjadi konformasi tertutup. Meskipun LDAO tidak terurai pada posisi yang sama di 1EYS atau 1OGV, RC ini disiapkan menggunakan deterjen yang sama dan oleh karena itu dapat menghasilkan efek yang sama. Struktur kristal Rba. Sphaeroides RC yang dikristalkan bersama dengan sitokrom c2 (ID PDB: 1L9B) juga tampaknya memiliki situs QB tertutup. Namun, dalam kasus ini, wilayah N-terminal polipeptida RC-M (yang berinteraksi dengan situs pengikatan QB melalui ikatan H residu Tyr pada heliks Q) mengadopsi konformasi yang tidak alami, dan perubahan konformasi QB tidak dieksplorasi lebih lanjut (30). Yang meyakinkan adalah bahwa kita belum melihat deformasi polipeptida M semacam ini pada struktur RC-LH114-W, yang hampir sama dengan wilayah N-terminal RC-LH116 RC. Perlu juga dicatat bahwa setelah penghapusan antena LH1 berbasis deterjen, apolipoprotein RC dalam PDB terpecahkan, yang menghilangkan kumpulan kuinon internal dan lipid di celah antara RC dan permukaan bagian dalam cincin LH1 di sekitarnya (31, 32). RC tetap berfungsi karena mempertahankan semua kofaktor, kecuali kuinon QB yang dapat terurai, yang kurang stabil dan sering hilang selama proses persiapan (33). Selain itu, diketahui bahwa penghapusan LH1 dan lipid siklik alami dari RC dapat berdampak pada fungsi, seperti memperpendek masa hidup keadaan P+QB yang terpisah muatan (31, 34, 35). Oleh karena itu, kami berspekulasi bahwa keberadaan cincin LH1 lokal yang mengelilingi RC dapat mempertahankan situs QB yang "tertutup", sehingga menjaga lingkungan lokal di dekat QB.
Meskipun apolipoprotein (tanpa kuinon QB) dan struktur lengkapnya hanya mewakili dua cuplikan dari pergantian situs QB, bukan serangkaian peristiwa, ada indikasi bahwa pengikatan dapat diatur untuk mencegah pengikatan ulang oleh hidrokuinon untuk menghambat penghambatan substrat. Interaksi kuinolol dan kuinon di dekat situs QB apolipoprotein mungkin berbeda, yang menyebabkan penolakannya oleh RC. Telah lama diusulkan bahwa perubahan konformasi berperan dalam pengikatan dan reduksi kuinon. Kemampuan RC beku untuk mereduksi kuinon setelah adaptasi gelap terganggu (36); kristalografi sinar-X menunjukkan bahwa kerusakan ini disebabkan oleh kuinon QB yang terperangkap dalam konformasi "distal" sekitar 4,5 Å dari posisi proksimal aktif (26), 37). Kami menyarankan bahwa konformasi pengikatan distal ini adalah cuplikan dari keadaan perantara antara apolipoprotein dan struktur cincin lengkap, yang mengikuti interaksi awal dengan kuinon dan pembukaan situs QB.
RC tipe II yang ditemukan dalam kompleks PSII dari bakteri fototrof tertentu dan sianobakteri, alga, dan tumbuhan memiliki konservasi struktural dan fungsional (38). Penyelarasan struktural yang ditunjukkan pada Gambar 6 (D dan E) menekankan kesamaan antara RC PSII dan situs QB dari kompleks RC bakteri. Perbandingan ini telah lama menjadi model untuk mempelajari sistem pengikatan dan reduksi kuinon yang terkait erat. Publikasi sebelumnya menunjukkan bahwa perubahan konformasi disertai dengan reduksi kuinon oleh PSII (39, 40). Oleh karena itu, dengan mempertimbangkan konservasi evolusi RC, mekanisme pengikatan yang sebelumnya tidak teramati ini mungkin juga berlaku untuk situs QB dari RC PSII pada tumbuhan fototrof yang teroksigenasi.
Strain Rps ΔpufW (penghapusan pufW tanpa label) dan PufW-His (protein bertanda His 10x di terminal C yang diekspresikan dari lokus pufW alami) palustris CGA009 dijelaskan dalam penelitian kami sebelumnya (16). Strain ini dan induk tipe liar isogenik diperoleh dari freezer dengan menggoreskan sejumlah kecil sel pada agar PYE (masing-masing 5 g liter -1) (disimpan dalam LB pada suhu -80 °C, mengandung 50% (b/v) gliserol) protein, ekstrak ragi dan suksinat) [1,5% (b/v)] cawan petri. Cawan petri diinkubasi semalaman dalam gelap pada suhu kamar dalam kondisi anaerobik, dan kemudian disinari dengan cahaya putih (~50 μmolm-2 s-1) yang disediakan oleh lampu halogen OSRAM 116-W (RS Components, UK) selama 3 hingga 5 hari sampai muncul satu koloni. Satu koloni tunggal digunakan untuk menginokulasi 10 ml media M22+ (41) yang ditambah dengan 0,1% (w/v) asam kasein (selanjutnya disebut sebagai M22). Kultur ditumbuhkan dalam kondisi oksigen rendah dalam gelap pada suhu 34°C dengan pengocokan 180 rpm selama 48 jam, dan kemudian 70 ml kultur diinokulasi dalam kondisi yang sama selama 24 jam. Kultur semi-aerobik dengan volume 1 ml digunakan untuk menginokulasi 30 ml media M22 dalam botol kaca transparan bertutup ulir universal 30 ml dan disinari dengan pengadukan (~50μmolm-2 s-1) selama 48 jam dengan batang pengaduk magnetik steril. Kemudian 30 ml kultur diinokulasi dengan sekitar 1 liter kultur dalam kondisi yang sama, yang kemudian digunakan untuk menginokulasi sekitar 9 liter kultur yang disinari pada ~200 μmolm-2 s-1 selama 72 jam. Sel-sel tersebut dipanen dengan sentrifugasi pada 7132 RCF selama 30 menit, disuspensikan kembali dalam ~10 ml tris-HCl 20 mM (pH 8,0), dan disimpan pada suhu -20°C hingga dibutuhkan.
Setelah dicairkan, tambahkan beberapa kristal deoksiribonuklease I (Merck, UK), lisozim (Merck, UK), dan dua tablet penghambat protease holoenzim Roche (Merck, UK) ke sel yang telah diresuspensikan. Dalam sel tekanan French 20.000 psi (Aminco, USA), sel-sel dihancurkan 8 hingga 12 kali. Setelah membuang sel yang tidak pecah dan puing-puing yang tidak larut dengan sentrifugasi pada 18.500 RCF selama 15 menit pada suhu 4°C, membran diendapkan dari lisat berpigmen dengan sentrifugasi pada 113.000 RCF selama 2 jam pada suhu 43.000°C. Buang fraksi yang larut dan suspensikan kembali membran berwarna dalam 100 hingga 200 ml tris-HCl 20 mM (pH 8,0) dan homogenkan hingga tidak ada agregat yang terlihat. Membran yang tersuspensi diinkubasi dalam 20 mM tris-HCl (pH 8,0) (Anatrace, USA) yang mengandung 2% (w/v) β-DDM selama 1 jam dalam kondisi gelap pada suhu 4°C dengan pengadukan perlahan. Kemudian disentrifugasi pada suhu 70°C untuk melarutkan 150.000 RCF pada suhu 4°C selama 1 jam untuk menghilangkan sisa zat yang tidak larut.
Membran pelarut dari strain ΔpufW diaplikasikan ke kolom penukar ion DEAE Sepharose 50 ml dengan tiga volume kolom (CV) buffer pengikat [20 mM tris-HCl (pH 8,0) yang mengandung 0,03% (b/v) β-DDM]. Cuci kolom dengan dua CV buffer pengikat, lalu cuci kolom dengan dua buffer pengikat yang mengandung 50 mM NaCl. Kompleks RC-LH116 dieluasi dengan gradien linier 150 hingga 300 mM NaCl (dalam buffer pengikat) pada 1,75 CV, dan kompleks pengikat yang tersisa dieluasi dengan buffer pengikat yang mengandung 300 mM NaCl pada 0,5 CV. Kumpulkan spektrum absorpsi antara 250 dan 1000 nm, simpan fraksi dengan rasio absorbansi (A880/A280) lebih besar dari 1 pada 880 hingga 280 nm, encerkan dua kali dalam buffer pengikat, dan gunakan prosedur yang sama lagi pada kolom DEAE untuk pemurnian. Encerkan fraksi dengan rasio A880/A280 lebih tinggi dari 1,7 dan rasio A880/A805 lebih tinggi dari 3,0, lakukan putaran ketiga pertukaran ion, dan pertahankan fraksi dengan rasio A880/A280 lebih tinggi dari 2,2 dan rasio A880/A805 lebih tinggi dari 5,0. Kompleks yang telah dimurnikan sebagian dikonsentrasikan hingga ~2 ml dalam filter sentrifugal Amicon dengan batas berat molekul (MWCO) 100.000 (Merck, UK), dan dimuat ke kolom eksklusi ukuran Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, US) yang berisi buffer NaCl 200 mM, kemudian dielusi dalam buffer yang sama pada 1,5 CV. Kumpulkan spektrum absorbsi fraksi eksklusi ukuran, dan konsentrasikan spektrum absorbsi dengan rasio A880/A280 di atas 2,4 dan rasio A880/A805 di atas 5,8 hingga 100 A880, dan segera gunakan untuk persiapan grid cryo-TEM atau penyimpanan. Simpan pada suhu -80°C hingga dibutuhkan.
Membran pelarut dari strain PufW-His diaplikasikan ke kolom HisPrep FF Ni-NTA Sepharose 20 ml (20 mM tris-HCl (pH 8,0) yang mengandung 200 mM NaCl dan 0,03% (w/w)) dalam buffer IMAC (GE Healthcare). v) β-DDM]. Kolom dicuci dengan lima CV buffer IMAC, dan kemudian dengan lima CV buffer IMAC yang mengandung 10 mM histidin. Kompleks inti dieluasi dari kolom dengan lima buffer IMAC yang mengandung 100 mM histidin. Fraksi yang mengandung kompleks RC-LH114-W dikonsentrasikan hingga ~10 ml dalam tangki pengaduk yang dilengkapi dengan filter Amicon 100.000 MWCO (Merck, UK), diencerkan 20 kali dengan buffer pengikat, dan kemudian ditambahkan ke kolom DEAE Sepharose 25 ml, empat CV yang terikat pada buffer digunakan terlebih dahulu. Cuci kolom dengan empat buffer pengikat CV, kemudian elusi kompleks pada delapan CV dengan gradien linier 0 hingga 100 mM NaCl (dalam buffer pengikat), dan empat CV yang tersisa berisi buffer pengikat 100 mM. Kompleks residu yang dielusi pada natrium klorida dikombinasikan dengan rasio A880/A280 lebih tinggi dari 2,4 dan rasio A880/A805 lebih tinggi dari 4,6. Fraksi-fraksi tersebut dipekatkan hingga ~2 ml dalam filter sentrifugal Amicon 100.000 MWCO, dan diisi dengan 1,5 CV IMAC yang telah diimbangi buffer sebelumnya ke kolom eksklusi ukuran Superdex 200 16/600, kemudian dielusi dalam buffer yang sama selama 1,5 CV. Kumpulkan spektrum absorpsi dari fraksi eksklusi ukuran dan konsentrasikan spektrum absorpsi dengan rasio A880/A280 di atas 2,1 dan rasio A880/A805 di atas 4,6 hingga 100 A880, yang segera digunakan untuk persiapan grid TEM beku atau disimpan pada suhu -80°C hingga dibutuhkan.
Alat pembeku imersi Leica EM GP digunakan untuk menyiapkan grid TEM suhu rendah. Kompleks tersebut diencerkan dalam buffer IMAC hingga A880 sebesar 50, kemudian 5μl dimuat ke jaring tembaga berlapis karbon QUANTIFOIL 1.2/1.3 yang baru saja diberi muatan pijar (Agar Scientific, UK). Inkubasi grid pada suhu 20°C dan kelembaban relatif 60% selama 30 detik, kemudian keringkan dengan tisu selama 3 detik, dan kemudian dinginkan dalam etana cair pada suhu -176°C.
Data kompleks RC-LH114-W direkam di eBIC (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source) dengan mikroskop Titan Krios, yang bekerja pada tegangan akselerasi 300kV, dengan perbesaran nominal 130.000× dan energi celah 20 eV. Gatan 968 GIF Quantum dengan detektor puncak K2 digunakan untuk merekam gambar dalam mode penghitungan untuk mengumpulkan data. Ukuran piksel yang dikalibrasi adalah 1,048Å, dan laju dosis adalah 3,83 e-Å-2s-1. Film dikumpulkan dalam 11 detik dan dibagi menjadi 40 bagian. Area berlapis karbon digunakan untuk memfokuskan ulang mikroskop, dan kemudian mengumpulkan tiga film per lubang. Secara total, 3130 film dikumpulkan, dengan nilai defokus antara -1 dan -3μm.
Data untuk kompleks RC-LH116 dikumpulkan menggunakan mikroskop yang sama di Laboratorium Biostruktur Asterbury (Universitas Leeds, Inggris). Data dikumpulkan dalam mode penghitungan dengan perbesaran 130 k, dan ukuran piksel dikalibrasi menjadi 1,065 Å dengan dosis 4,6 e-Å-2s-1. Film direkam selama 12 detik dan dibagi menjadi 48 bagian. Secara total, 3359 film dikumpulkan, dengan nilai defokus antara -1 dan -3μm.
Semua pemrosesan data dilakukan dalam pipeline Relion 3.0 (42). Gunakan Motioncorr 2 (43) untuk mengoreksi pergerakan berkas dengan pembobotan dosis, dan kemudian gunakan CTFFIND 4.1 (44) untuk menentukan parameter CTF (fungsi transfer kontras). Foto mikrograf tipikal setelah tahap pemrosesan awal ini ditunjukkan pada Gambar 2. S16. Templat seleksi otomatis dihasilkan dengan memilih secara manual sekitar 250 piksel dari 1000 partikel dalam bingkai 250 piksel dan tanpa klasifikasi dua dimensi (2D) referensi, sehingga menolak klasifikasi yang memenuhi kontaminasi sampel atau tidak memiliki karakteristik yang dapat dibedakan. Kemudian, seleksi otomatis dilakukan pada semua mikrofotografi, dan RC-LH114-W adalah 849.359 partikel, dan kompleks RC-LH116 adalah 476.547 partikel. Semua partikel terpilih telah menjalani dua putaran klasifikasi 2D non-referensi, dan setelah setiap putaran, partikel yang memenuhi kriteria area karbon, kontaminasi sampel, tidak memiliki fitur yang jelas, atau partikel yang tumpang tindih secara kuat ditolak, sehingga menghasilkan 772.033 (90,9%) dan 359.678 (75,5%) partikel yang digunakan untuk klasifikasi 3D RC-LH114-W dan RC-LH116 masing-masing. Model referensi 3D awal dihasilkan menggunakan metode stochastic gradient descent. Dengan menggunakan model awal sebagai referensi, partikel terpilih diklasifikasikan ke dalam empat kategori dalam 3D. Dengan menggunakan model dalam kategori ini sebagai referensi, lakukan pemurnian 3D pada partikel dalam kategori terbesar, kemudian gunakan filter low-pass 15Å awal untuk menutupi area pelarut, tambahkan 6 piksel tepi lunak, dan lakukan pasca-pemrosesan piksel untuk mengoreksi fungsi transfer modulasi puncak Gatan K2 dari detektor atas. Untuk dataset RC-LH114-W, model awal ini dimodifikasi dengan menghilangkan kepadatan yang kuat di tepi mask (terputus dari kepadatan kompleks inti di UCSF Chimera). Model yang dihasilkan (resolusi RC-LH114-W dan RC-LH116 masing-masing adalah 3,91 dan 4,16 Å) digunakan sebagai referensi untuk putaran kedua klasifikasi 3D. Partikel yang digunakan dikelompokkan ke dalam kelas 3D awal dan tidak mengandung korelasi yang kuat dengan lingkungan sekitarnya. Tumpang tindih atau kurangnya fitur struktural yang jelas. Setelah putaran kedua klasifikasi 3D, kategori dengan resolusi tertinggi dipilih [Untuk RC-LH114-W, satu kategori terdiri dari 377.703 partikel (44,5%), untuk RC-LH116, terdapat dua kategori, dengan total 260.752 partikel (54,7%), di mana keduanya sama hanya ketika disejajarkan setelah rotasi awal dengan sedikit perbedaan]. Partikel yang dipilih diekstraksi ulang dalam kotak 400 piksel dan disempurnakan dengan penyempurnaan 3D. Masker pelarut dihasilkan menggunakan filter low-pass 15Å awal, ekspansi peta 3 piksel, dan masker lunak 3 piksel. Dengan menggunakan penyempurnaan CTF per partikel, koreksi gerak per partikel, dan putaran kedua penyempurnaan CTF per partikel, penyempurnaan 3D, masking pelarut, dan pasca-pemrosesan dilakukan setelah setiap langkah untuk lebih menyempurnakan tekstur yang dihasilkan. Dengan menggunakan nilai batas FSC (Fourier Shell Correlation Coefficient) sebesar 0,143, resolusi model akhir RC-LH114-W dan RC-LH116 masing-masing adalah 2,65 dan 2,80Å. Kurva FSC dari model akhir ditunjukkan pada Gambar 2. S17.
Semua sekuens protein diunduh dari UniProtKB: LH1-β (PufB; ID UniProt: Q6N9L5); LH1-α (PufA; ID UniProt: Q6N9L4); RC-L (PufL; ID UniProt: O83005); RC-M (PufM; ID UniProt: A0A4Z7); RC-H (PufA; ID UniProt: A0A4Z9); Protein-W (PufW; ID UniProt: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) digunakan untuk membangun model homologi RC, yang berisi sekuens protein RC-L, RC-M dan RC-H dan struktur kristal Rba. sphaeroides RC digunakan sebagai templat (ID PDB: 5LSE) (46). Gunakan alat “fit map” di UCSF Chimera untuk menyesuaikan model yang dihasilkan dengan peta (47), memperbaiki struktur protein, dan kofaktor [4×BChl a (nama residu pustaka monomer = BCL), 2×BPh a (BPH), satu atau dua jenis UQ10 (U10), satu besi non-heme (Fe) dan satu 3,4-dihidroheksakarbonilkolin (QAK)] menggunakan Coot (48) untuk ditambahkan. Karena QAK tidak tersedia di pustaka monomer, maka QAK diparameterisasi menggunakan alat eLBOW di PHENIX (49).
Selanjutnya, subunit LH1 dibangun. Awalnya, alat konstruksi otomatis di PHENIX (49) digunakan untuk secara otomatis membangun sebagian dari urutan LH1 menggunakan peta dan urutan protein LH1-α dan LH1-β sebagai input. Pilih subunit LH1 yang paling lengkap, ekstrak dan muat ke dalam Coot, tambahkan urutan yang hilang secara manual, dan perbaiki seluruh struktur secara manual sebelum menambahkan dua BCL (BCL) dan spirilloxanthin (CRT) [sesuai dengan kepadatan Rps yang relevan dari kompleks LH1 dan kandungan karotenoid yang diketahui. Spesies (17)]. Salin subunit LH1 yang lengkap, dan gunakan UCSF Chimera “Docking Map Tool” untuk melakukan docking di area non-model yang berdekatan dari kepadatan LH1, lalu perbaiki di Coot; ulangi proses hingga semua subunit LH1 telah dimodelkan. Untuk struktur RC-LH114-W, dengan mengekstrak kerapatan yang tidak dialokasikan di Coot, protein tersebut disegmentasi dari komponen non-protein yang tersisa di peta USCF Chimera dan alat Autobuild digunakan untuk menetapkan model awal, dan pemodelan subunit yang tersisa (protein-W). Di PHENIX (49). Tambahkan urutan yang hilang ke model yang dihasilkan di Coot (48), dan kemudian perbaiki seluruh subunit secara manual. Kerapatan yang tidak dialokasikan yang tersisa sesuai dengan kombinasi lipid (ID pustaka monomer PDB CDL = CDL, POPC = 6PL dan POPG = PGT), deterjen β-DDM (LMT) dan molekul UQ10 (U10). Gunakan optimasi PHENIX (49) dan optimasi manual di Coot (48) untuk menyempurnakan model awal lengkap hingga statistik model dan kualitas visual kecocokan tidak dapat ditingkatkan lebih lanjut. Terakhir, gunakan LocScale (50) untuk mempertajam peta lokal, dan kemudian lakukan beberapa siklus pemodelan kepadatan yang tidak dialokasikan dan optimasi otomatis dan manual.
Peptida, kofaktor, dan lipid serta kuinon lainnya yang terikat dalam kerapatan masing-masing ditunjukkan pada Gambar 1 dan 2. S18 hingga S23. Informasi statistik dari model akhir ditunjukkan pada Tabel S1.
Kecuali dinyatakan lain, spektrum absorbsi UV/Vis/NIR dikumpulkan menggunakan spektrofotometer Cary60 (Agilent, USA) dengan interval 1 nm dari 250 nm hingga 1000 nm dan waktu integrasi 0,1 detik.
Encerkan sampel dalam kuvet kuarsa dengan jalur 2 mm hingga A880 sebesar 1, dan kumpulkan spektrum absorpsi antara 400 dan 1000 nm. Spektrum dikroik sirkular dikumpulkan pada spektropolarimeter Jasco 810 (Jasco, Jepang) dengan interval 1 nm antara 400 nm dan 950 nm pada laju pemindaian 20 nm min-1.
Koefisien ekstingsi molar ditentukan dengan mengencerkan kompleks inti hingga A880 sekitar 50. Encerkan volume 10μl dalam 990μl buffer pengikat atau metanol, dan kumpulkan spektrum absorbsi segera untuk meminimalkan degradasi BChl. Kandungan BChl dari setiap sampel metanol dihitung dengan koefisien ekstingsi pada 771 nm sebesar 54,8 mM-1 cm-1, dan koefisien ekstingsi ditentukan (51). Bagi konsentrasi BChl yang diukur dengan 32 (RC-LH114-W) atau 36 (RC-LH116) untuk menentukan konsentrasi kompleks inti, yang kemudian digunakan untuk menentukan spektrum absorbsi sampel yang sama yang dikumpulkan dalam buffer. Koefisien ekstingsi paralel. Tiga pengukuran berulang dilakukan untuk setiap sampel, dan absorbansi rata-rata maksimum BChl Qy digunakan untuk perhitungan. Koefisien ekstingsi RC-LH114-W yang diukur pada 878 nm adalah 3280±140 mM-1 cm-1, sedangkan koefisien ekstingsi RC-LH116 yang diukur pada 880 nm adalah 3800±30 mM-1 cm-1.
UQ10 dikuantifikasi sesuai dengan metode dalam (52). Singkatnya, kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik (RP-HPLC) dilakukan menggunakan sistem HPLC Agilent 1200. Larutkan sekitar 0,02 nmol RC-LH116 atau RC-LH114-W dalam 50 μl metanol:kloroform 50:50 yang mengandung 0,02% (w/v) ferri klorida, dan injeksikan Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4,6 mm yang telah di-ekuilibriasi sebelumnya. Larutkan dalam 1 ml-1 min-1 pada suhu 40°C dalam pelarut HPLC (80:20 metanol:2-propanol) pada kolom ×25 cm. Lakukan elusi isokratik dalam pelarut HPLC untuk memantau absorbansi pada 275 nm (UQ10), 450 nm (karotenoid) dan 780 nm (BChl) selama 1 jam. Puncak pada kromatogram 275 nm pada menit ke-25,5 diintegrasikan, yang tidak mengandung senyawa lain yang terdeteksi. Luas area terintegrasi digunakan untuk menghitung jumlah mol UQ10 yang diekstrak dengan mengacu pada kurva kalibrasi yang dihitung dari injeksi standar murni dari 0 hingga 5,8 nmol (Gambar S14). Setiap sampel dianalisis dalam tiga replikasi, dan kesalahan yang dilaporkan sesuai dengan simpangan baku (SD) rata-rata.
Larutan yang mengandung kompleks RC-LH1 dengan absorbansi Qy maksimum 0,1 disiapkan dengan 30 μM sitokrom c2 jantung kuda tereduksi (Merck, UK) dan 0 hingga 50 μM UQ2 (Merck, UK). Tiga sampel 1 ml disiapkan pada setiap konsentrasi UQ2 dan diinkubasi semalaman dalam gelap pada suhu 4°C untuk memastikan adaptasi sempurna terhadap gelap sebelum pengukuran. Larutan dimasukkan ke dalam spektrofotometer modular OLIS RSM1000 yang dilengkapi dengan kisi nyala 300 nm/garis 500, celah masuk 1,24 mm, celah tengah 0,12 mm, dan celah keluar 0,6 mm. Filter lolos panjang 600 nm ditempatkan di pintu masuk tabung foto sampel dan tabung fotomultiplier referensi untuk mengecualikan cahaya eksitasi. Absorbansi dipantau pada 550 nm dengan waktu integrasi 0,15 s. Cahaya eksitasi dipancarkan dari LED (Light Emitting Diode) M880F2 880 nm (Thorlabs Ltd., UK) melalui kabel serat optik dengan intensitas 90% melalui pengontrol DC2200 (Thorlabs Ltd., UK) dan dipancarkan ke sumber cahaya pada sudut 90°. Berkas pengukuran berlawanan dengan cermin untuk memantulkan kembali cahaya yang awalnya tidak diserap oleh sampel. Pantau absorbansi 10 detik sebelum iluminasi selama 50 detik. Kemudian absorbansi dipantau lebih lanjut selama 60 detik dalam gelap untuk menilai sejauh mana kuinolol secara spontan mereduksi sitokrom c23+ (lihat Gambar S8 untuk data mentah).
Data diproses dengan menyesuaikan laju awal linier dalam rentang 0,5 hingga 10 s (tergantung pada konsentrasi UQ2) dan merata-ratakan laju dari ketiga sampel pada setiap konsentrasi UQ2. Konsentrasi RC-LH1 yang dihitung berdasarkan koefisien ekstingsi masing-masing digunakan untuk mengubah laju menjadi efisiensi katalitik, diplot dalam Origin Pro 2019 (OriginLab, AS), dan disesuaikan dengan model Michaelis-Menten untuk menentukan nilai Km dan Kcat yang tampak.
Untuk pengukuran absorpsi transien, sampel RC-LH1 diencerkan hingga ~2μM dalam buffer IMAC yang mengandung 50 mM natrium askorbat (Merck, USA) dan 0,4 mM Terbutin (Merck, USA). Asam askorbat digunakan sebagai donor elektron pengorbanan, dan tert-butaklofen digunakan sebagai penghambat QB untuk memastikan bahwa donor RC utama tetap tereduksi (yaitu, tidak teroksidasi secara fotokimia) selama proses pengukuran. Sekitar 3 ml sampel ditambahkan ke sel putar khusus (diameter sekitar 0,1 m, 350 RPM) dengan panjang jalur optik 2 mm untuk memastikan bahwa sampel dalam jalur laser memiliki cukup waktu untuk adaptasi gelap antara pulsa eksitasi. Gunakan pulsa laser ~100-fs untuk memperkuat sistem laser Ti: Sapphire (Spectra Physics, USA) untuk mengeksitasi sampel pada 880 nm dengan laju pengulangan 1 kHz (20 nJ untuk NIR atau 100 nJ untuk Vis). Sebelum mengumpulkan data, paparkan sampel ke cahaya eksitasi selama sekitar 30 menit. Paparan akan menyebabkan inaktivasi QA (mungkin mengurangi QA satu atau dua kali). Namun perlu dicatat bahwa proses ini dapat dibalik karena setelah periode adaptasi gelap yang lama, RC akan perlahan kembali ke aktivitas QA. Spektrometer Helios (Ultrafast Systems, USA) digunakan untuk mengukur spektrum transien dengan waktu tunda -10 hingga 7000 ps. Gunakan perangkat lunak Surface Xplorer (Ultrafast Systems, USA) untuk memisahkan set data, kemudian gabungkan dan standarisasi. Gunakan paket perangkat lunak CarpetView (Light Conversion Ltd., Lithuania) untuk menggunakan set data gabungan untuk mendapatkan spektrum diferensial yang terkait dengan peluruhan, atau gunakan fungsi yang mengkonvolusikan beberapa eksponen dengan respons instrumen untuk menyesuaikan evolusi spektral panjang gelombang tunggal di Origin (OriginLab, USA).
Seperti disebutkan di atas (53), film fotosintetik yang mengandung kompleks LH1 yang tidak memiliki RC dan antena LH2 perifer disiapkan. Membran diencerkan dalam 20 mM tris (pH 8,0) dan kemudian dimasukkan ke dalam kuvet kuarsa dengan jalur optik 2 mm. Pulsa laser 30 nJ digunakan untuk mengeksitasi sampel pada 540 nm dengan waktu tunda -10 hingga 7000 ps. Proses set data seperti yang dijelaskan untuk sampel Rps. pal.
Membran diendapkan dengan sentrifugasi pada 150.000 RCF selama 2 jam pada suhu 4°C, dan kemudian absorbansinya pada 880 nm dilarutkan kembali dalam 20 mM tris-HCl (pH 8,0) dan 200 mM NaCl. Larutkan membran dengan pengadukan perlahan dalam 2% (w/v) β-DDM selama 1 jam dalam gelap pada suhu 4°C. Sampel diencerkan dalam 100 mM trietilamonium karbonat (pH 8,0) (TEAB; Merck, UK) hingga konsentrasi protein 2,5 mg ml-1 (analisis Bio-Rad). Pemrosesan lebih lanjut dilakukan dari metode yang telah dipublikasikan sebelumnya (54), dimulai dengan pengenceran 50 μg protein ke dalam total 50 μl TEAB yang mengandung 1% (w/v) natrium laurat (Merck, UK). Setelah sonikasi selama 60 detik, sampel direduksi dengan 5 mM tris(2-karboksietil)fosfin (Merck, UK) pada suhu 37°C selama 30 menit. Untuk S-alkilasi, inkubasi sampel dengan 10 mM metil S-metiltiometanasulfonat (Merck, UK) dan tambahkan dari larutan stok isopropanol 200 mM selama 10 menit pada suhu kamar. Pencernaan proteolitik dilakukan dengan menambahkan 2 μg campuran tripsin/endoproteinase Lys-C (Promega UK) dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 3 jam. Surfaktan laurat diekstraksi dengan menambahkan 50 μl etil asetat dan 10 μl asam trifluoroasetat (TFA) 10% (v/v) kualitas LC (Thermo Fisher Scientific, UK) dan di-vortex selama 60 detik. Pemisahan fase dipromosikan dengan sentrifugasi pada 15.700 RCF selama 5 menit. Sesuai dengan protokol pabrikan, kolom putar C18 (Thermo Fisher Scientific, UK) digunakan untuk menyedot dan menghilangkan garam dari fase bawah yang mengandung peptida secara hati-hati. Setelah dikeringkan dengan sentrifugasi vakum, sampel dilarutkan dalam 0,5% TFA dan 3% asetonitril, dan 500 ng dianalisis dengan kromatografi RP nanoflow yang digabungkan dengan spektrometri massa menggunakan parameter sistem yang telah dijelaskan sebelumnya.
Gunakan MaxQuant v.1.5.3.30 (56) untuk identifikasi dan kuantifikasi protein untuk mencari basis data proteom Rps. palustris (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Data proteomik spektrometri massa telah disimpan di ProteomeXchange Alliance melalui repositori mitra PRIDE (http://proteomecentral.proteomexchange.org) dengan pengidentifikasi dataset PXD020402.
Untuk analisis dengan RPLC yang digabungkan dengan spektrometri massa ionisasi elektrospray, kompleks RC-LH1 disiapkan dari Rps tipe liar. Menggunakan metode yang telah dipublikasikan sebelumnya (16), konsentrasi protein yang dihasilkan dalam sel palustris adalah 2 mg ml-1 dalam 20 mM Hepes (pH 7,8), 100 mM NaCl dan 0,03% (w/v) β- (analisis Bio-Rad) ) DDM. Menurut protokol pabrikan, gunakan kit pemurnian 2D (GE Healthcare, USA) untuk mengekstrak 10 μg protein dengan metode presipitasi, dan larutkan endapan dalam 20 μl asam format (FA) 60% (v/v), asetonitril 20% (v/v) dan air 20% (v/v). Lima mikroliter dianalisis dengan RPLC (Dionex RSLC) yang digabungkan dengan spektrometri massa (Maxis UHR-TOF, Bruker). Gunakan kolom MabPac 1,2×100 mm (Thermo Fisher Scientific, UK) untuk pemisahan pada suhu 60°C dan laju alir 100μlmin⁻¹, dengan gradien 85% (v/v) pelarut A [larutan berair 0,1% (v/v) FA dan 0,02% (v/v) TFA] hingga 85% (v/v) pelarut B [0,1% (v/v) FA dan 0,02% (v/v) dalam 90% (v/v) asetonitril TFA]. Dengan menggunakan sumber ionisasi elektrospray standar dan parameter default selama lebih dari 60 menit, spektrometer massa memperoleh m/z 100 hingga 2750 (rasio massa terhadap muatan). Dengan bantuan alat FindPept dari portal sumber daya bioinformatika ExPASy (https://web.expasy.org/findpept/), petakan spektrum massa ke subunit kompleks tersebut.
Sel-sel tersebut ditumbuhkan selama 72 jam di bawah 100 ml NF-low (10μMm-2 s-1), medium (30μMm-2 s-1) atau cahaya tinggi (300μMm-2 s-1). Medium M22 (medium M22 di mana amonium sulfat dihilangkan dan natrium suksinat digantikan oleh natrium asetat) dalam botol berpenutup ulir 100 ml (23). Dalam lima siklus 30 detik, manik-manik kaca 0,1 mikron dimasukkan dengan rasio volume 1:1 untuk melisiskan sel dan didinginkan di atas es selama 5 menit. Materi yang tidak larut, sel yang tidak pecah, dan manik-manik kaca dihilangkan dengan sentrifugasi pada 16.000 RCF selama 10 menit dalam mikrosentrifuga meja. Membran tersebut dipisahkan dalam rotor Ti 70.1 dengan 100.000 RCF dalam larutan tris-HCl 20 mM (pH 8,0) dengan gradien sukrosa 40/15% (w/w) selama 10 jam.
Seperti yang dijelaskan dalam penelitian kami sebelumnya, imunodeteksi tag His pada PufW (16). Singkatnya, kompleks inti yang dimurnikan (11,8 nM) atau membran yang mengandung konsentrasi RC yang sama (ditentukan dengan oksidasi mengurangi spektrum perbedaan tereduksi dan mencocokkan muatan pada gel yang diwarnai) dalam buffer pemuatan SDS 2x (Merck, UK) diencerkan dua kali. Protein dipisahkan pada gel NuPage bis-tris 12% replika (Thermo Fisher Scientific, UK). Gel diwarnai dengan Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, UK) untuk memuat dan memvisualisasikan subunit RC-L. Protein pada gel kedua dipindahkan ke membran polivinilidena fluorida (PVDF) yang diaktifkan metanol (Thermo Fisher Scientific, UK) untuk uji imunologi. Membran PVDF diblokir dalam larutan 50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 0,2% (v/v) Tween-20 dan 5% (w/v) susu bubuk skim, kemudian diinkubasi dengan antibodi primer anti-His (dalam larutan penyangga antibodi [50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl dan 0,05% (v/v) Tween-20] dengan perbandingan 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, USA) selama 4 jam. Setelah dicuci 3 kali selama 5 menit dalam buffer antibodi, membran dikombinasikan dengan antibodi sekunder anti-tikus peroksidase lobak (Sigma-Aldrich, UK) (diencerkan 1:10.000 dalam buffer antibodi). Inkubasi untuk memungkinkan deteksi (5 menit setelah 3 kali pencucian dalam buffer antibodi) menggunakan substrat kemiluminesensi WESTAR ETA C 2.0 (Cyanagen, Italia) dan Amersham Imager 600 (GE Healthcare, UK).
Dengan menggambar distribusi intensitas setiap gel yang diwarnai atau lajur immunoassay, mengintegrasikan area di bawah puncak dan menghitung rasio intensitas RC-L (gel yang diwarnai) dan Protein-W (immunoassay), di ImageJ (57) Proses gambar. Rasio ini dikonversi menjadi rasio molar dengan mengasumsikan bahwa rasio RC-L terhadap protein-W dalam sampel RC-LH114-W murni adalah 1:1 dan menormalkan seluruh kumpulan data sesuai dengan itu.
Untuk materi tambahan artikel ini, silakan lihat http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Artikel ini merupakan artikel akses terbuka yang didistribusikan di bawah ketentuan Lisensi Atribusi Creative Commons. Artikel ini mengizinkan penggunaan, distribusi, dan reproduksi tanpa batasan dalam media apa pun dengan syarat karya asli dikutip dengan benar.
Catatan: Kami hanya meminta Anda untuk memberikan alamat email Anda agar orang yang Anda rekomendasikan ke halaman ini mengetahui bahwa Anda ingin mereka melihat email tersebut dan bahwa email tersebut bukan spam. Kami tidak akan menyimpan alamat email apa pun.
Pertanyaan ini digunakan untuk menguji apakah Anda adalah pengunjung dan mencegah pengiriman spam otomatis.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Struktur resolusi tinggi dari kompleks perangkap cahaya 1 di pusat reaksi memberikan wawasan baru tentang dinamika kuinon.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Struktur resolusi tinggi dari kompleks perangkap cahaya 1 di pusat reaksi memberikan wawasan baru tentang dinamika kuinon.
©2021 Asosiasi Amerika untuk Kemajuan Ilmu Pengetahuan. semua hak dilindungi undang-undang. AAAS adalah mitra dari HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef dan COUNTER. ScienceAdvanced ISSN 2375-2548.